Name: Calorimétrie différentielle à balayage - une méthode dévaluation de la stabilité thermique et la Conformation de Protein Antigen (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Découvrez la calorimétrie différentielle à balayage pour évaluer la stabilité thermique et la conformation des protéines antigéniques. Cette méthode mesure directement la température de transition et l'énergie de dénaturation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs sont très reconnaissants à Joseph Mancini (anciennement GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments limitée) pour leur rôle dans l&#39;installation et la formation sur le calorimètre différentiel, Sasmit Deshmukh et Webster Magcalas pour leurs discussions.

1. Instrument Start-up <ol><li> Mettre en marche le calorimètre différentiel à balayage et à augmenter la pression dans les cellules à supprimer l&#39;ébullition des échantillons, ainsi que d&#39;éviter la formation de bulles à des températures élevées. Cette opération est généralement réalisée par apport de l&#39;azote dans le système. </li><li> En fonction du matériau constitutif de la cellule (par exemple, le tantale, l&#39; or, le platine, etc.), régler la pression de l&#39;alimentation en gaz d&#39;azote selon la pression recommandée par le fabricant pour éviter d&#39; endommager la cellule. Par exemple, régler la pression de l&#39;alimentation en azote gazeux à 45 psi pour l&#39;instrument utilisé pour développer cette procédure, et la pression supérieure à 80 psi peut endommager la cellule. </li><li> Veiller à ce que tous les réservoirs d&#39;agent de nettoyage sont remplis au volume requis. Les agents de nettoyage nécessaires comprennent un détergent et de l&#39;eau pour laver et nettoyer la cellule, respectivement, après chaque échantillon run. </li><li> Régler la température du compartiment de retenue d&#39;échantillonà une valeur appropriée, de préférence de 5 ° C, pour maintenir l&#39;intégrité de l&#39;échantillon avant l&#39;expérimentation. </li></ol> Préparation 2. Sample <ol><li> Dialyser l&#39;échantillon contre le tampon qui sera utilisé comme référence pour l&#39;expérience. En variante, le tampon d&#39;élution ont été recueillies à l&#39;étape finale de la purification des protéines ( par exemple la colonne d&#39; élution) peut être utilisée. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;échantillon de protéine en utilisant la méthode de détermination de la concentration en protéines plus convenable tel que le procédé Kjedahl 33 ou 34 méthode de Lowry. A titre de comparaison objective des résultats, utilisez la même méthode cohérente dans la même étude. La plage de concentration requise peut varier en fonction du modèle de l&#39;instrument. Pour l&#39;instrument utilisé dans ce protocole, la plage de travail est préférable de 0,5 à 1 mg / mL. </li><li> Dégazer le tampon d&#39;échantillon et de référence dans le vide pour se débarrasser de microbulles qui peuvent causer le volume inaccurAcy. Cette étape peut être ignorée pour les modèles plus récents calorimètre. </li><li> En utilisant une micropipette et embouts stériles dans une armoire de bioconfinement à flux laminaire, charger les échantillons et leur tampon respectif par paires en plaques à 96 puits compatibles avec l&#39;instrument. Remplir les deux premières paires de puits avec le tampon et les deux dernières paires avec de l&#39;eau pour le tampon et le tampon d&#39;analyse de l&#39;eau, respectivement. Balayages Buffer-tampon de vérifier l&#39;adéquation de l&#39;instrument avant la mesure (évaluation de l&#39; erreur d&#39;instrumentation) échantillonner ainsi que d&#39; établir une ligne de base; tandis que les analyses d&#39;eau sont exécutés pour nettoyer les cellules. </li><li> Couvrir la plaque de 96 puits avec un film d&#39;étanchéité, et de veiller à ce que les puits soient bien étanches avant de prendre la plaque hors du Cabinet de biosécurité pour éviter la contamination de l&#39;échantillon. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;échantillon de maintien compartiment dans le bon sens. </li></ol> Configuration 3. Experimental Paramètre Remarque: Selon le instrumentation, des échantillons peuvent être chargés dans la cellule, soit manuellement à l&#39;aide d&#39;une seringue, ou automatiquement en utilisant un échantillonneur automatique. Dans ce cas (ie un milieu industriel), un échantillonneur automatique est utilisé pour gagner du temps. <ol><li> Utilisation du logiciel d&#39;acquisition, entrez l&#39;information d&#39;échantillon dans l&#39;ordre de la plaque a été chargé conformément à la section 2.4. Entrez les concentrations si disponible, sinon, entrez les valeurs de concentration dans le logiciel d&#39;analyse avant l&#39;analyse des données (section 4.2). </li><li> Sélectionnez l&#39;option qui assure le nettoyage des cellules avec un détergent avant chaque analyse d&#39;échantillon, qui devrait être suivie par plusieurs étapes de rinçage à l&#39;eau pour assurer qu&#39;aucun résidu de détergent est laissé dans les cellules. </li><li> Régler la température de départ de l&#39;essai à 20 ° C, mais cela peut varier en fonction de la connaissance préalable de l&#39;échantillon. Pour des protéines connues, la température de départ prédéterminée peut être utilisé, tandis qu&#39;une température de départ inférieure peut être appliquée pour des échantillons inconnus. </li><li> Réglez la température finalede l&#39;expérience, par exemple 100 ° C. La température finale peut varier en fonction de la connaissance préalable de l&#39;échantillon. </li><li> Réglez la vitesse de balayage de l&#39;expérience, par exemple 60 ° C / h, ce qui est la vitesse de balayage typique. Cependant, la vitesse de balayage peut varier en fonction de la connaissance préalable de l&#39;échantillon, par exemple 90 ° C / h, ou 120 ° C / h. Il est conseillé de scanner des échantillons inconnus à différentes vitesses de balayage pour évaluer la cinétique de dépliage. </li><li> échantillons Rescan pour étudier la réversibilité du dépliement thermique. Le déroulement d&#39;une protéine est considérée comme réversible si l&#39;enthalpie obtenue pour le deuxième balayage est d&#39;au moins 80% de la valeur d&#39;enthalpie pour la première analyse. </li><li> Régler le thermostat après l&#39;essai à 10 ° C pour préserver l&#39;intégrité des cellules du calorimètre. </li><li> Vérifiez que les paramètres de configuration de l&#39;expérience sont correctes avant d&#39;exécuter l&#39;expérience. Si tout est en place, commencer l&#39;expérience. </li></ol> 4. Les données Unealy <ol><li> Récupérer les données brutes de l&#39;expérience et de sélectionner un échantillon à la fois pour l&#39;analyse. Scan Soustraire de référence, c. -à- tampon, de l&#39;analyse de l&#39; échantillon. NOTE: Référence soustraction est effectuée automatiquement par les nouveaux modèles d&#39;instruments de DSC. </li><li> Entrer la valeur de concentration échantillon si elle a été omise conformément à l&#39;article 3.1. </li><li> Monter et soustraire la ligne de base de la thermogramme acquise pour tenir compte des différences dans les capacités thermiques des Etats pliée et dépliée de la protéine qui est causée par l&#39;exposition des groupes hydrophobes à l&#39;eau lors de dépliage. Linéaire ou cubique d&#39;ajustement de courbe peuvent être appliqués en fonction de la forme du profil de DSC pour l&#39;échantillon. Par souci de cohérence, le même type de montage doit être utilisé au cours d&#39; une étude, par exemple , l&#39; étude de stabilité en temps réel. Cette étape est nécessaire pour traiter la courbe d&#39;intégration de pointe pour obtenir enthalpie de transition. </li><li> Effectuer l&#39;intégration de pointe à l&#39;aide non-linéaire moindres carrés. Basé sur le produitconnaissances appliquer deux états ou modèle à deux états non. Le modèle à deux états peut être utilisé pour un seul transitions thermiques coopératives, et pour des protéines inconnues, appliquer deux non modèle d&#39;état jusqu&#39;à ce que de nouvelles connaissances de produit est disponible. Le cas échéant, ajuster ajustement de courbe en utilisant la courbe fonction d&#39; ajustement itérative du logiciel de l&#39;équipement jusqu&#39;à ce que la valeur du chi carré reste constante. </li><li> Les résultats obtenus montreront les valeurs de milieu de températures de transition (Tm), enthalpie calorimétrique (AH), et van&#39;t Hoff enthalpie (AH VH) de l&#39;échantillon. </li></ol>

<ol><li>Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+techniques%3A+applications+in+biology+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience.</a> J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).</li>
<li>Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. , US3263484A 02 August (1966).</li>
<li>O'Neill, M. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/231200637_The_Analysis_of_a_Temperature-Controlled_Scanning_Calorimeter">The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter.</a> Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).</li>
<li>O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60242a011">Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry.</a> Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).</li>
<li>Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).</li>
<li>Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+study+of+the+nature+of+the+intramolecular+fusion+of+collagen%2C+isolated+from+transplantable+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Dokl.+Akad.+Nauk%22%5BJournal%5D)">Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor.</a> Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndronikashvili%2C+EL+%22Conformational+Changes+of+Biopolymers+in+Solution%22">Conformational Changes of Biopolymers in Solution</a>. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).</li>
<li>Andronikashvili, E. L. <a target="_blank" href="http://europepmc.org/abstract/med/3318939">Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures.</a> Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).</li>
<li>Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+denaturation+of+lysozyme+in+alcohol-water+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures.</a> Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+capacity+and+entropy+changes+in+processes+involving+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.pc.38.100187.002335">Biochemical applications of differential scanning calorimetry.</a> Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).</li>
<li>Jackson, W. M., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+protein+denaturation.+A+calorimetric+study+of+the+reversible+denaturation+of+chymotrypsinogen+and+conclusions+regarding+the+accuracy+of+the+two-state+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation.</a> Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+thermal+transitions+in+globular+proteins.+I.+Calorimetric+study+of+chymotrypsinogen%2C+ribonuclease+and+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin.</a> Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+approach+to+the+problem+of+stabilization+of+globular+protein+structure%3A+a+calorimetric+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study.</a> J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).</li>
<li>Privalov, P. L., Potekhin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+microcalorimetry+in+studying+temperature-induced+changes+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins.</a> Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).</li>
<li>Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).</li>
<li>Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+functional+and+structural+transformations+of+the+photosystem+II+oxygen-evolving+complex+in+spinach+subchloroplast+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).</li>
<li>Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).</li>
<li>Oreshkin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+muscle+proteins+of+cured+beef+during+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating.</a> Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).</li>
<li>Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. <a target="_blank" href="http://www.future-science.com/doi/abs/10.4155/pbp.14.27">Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens.</a> Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).</li>
<li>Jiskoot, W., Daan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiskoot%2C+W+%22Methods+for+structural+analysis+of+protein+pharmaceuticals%22">Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals</a>. 3, Springer Science & Business Media. (2005).</li>
<li>Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ultrasensitive+scanning+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new ultrasensitive scanning calorimeter.</a> Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).</li>
<li>Plotnikov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Freire, E. Differential scanning calorimetry. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/book/10.1385%2F0896033015">Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology</a>. 40, 191-218 (1995).</li>
<li>Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetrically+determined+dynamics+of+complex+unfolding+transitions+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).</li>
<li>Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+the+structural+stability+of+the+tetrameric+oligomerization+domain+of+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor.</a> Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).</li>
<li>Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+equilibrium+of+human+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The conformational equilibrium of human growth hormone.</a> J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).</li>
<li>Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1016/0307-4412(94)90013-2/full">Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states.</a> Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).</li>
<li>Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781588299543">Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology</a>. 490, 1-39 (2009).</li>
<li>Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. <a target="_blank" href="http://www.ijapbs.com/admin/php/uploads/156_pdf.pdf">The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU).</a> Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).</li>
<li>Stability testing of new drug substances and products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guideline%2C+ICH+Harmonised+Tripartite%22">Guideline, ICH Harmonised Tripartite</a>. 1 (2), current step. 4 (2003).</li>
<li>Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14907713">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%96hne%2C+G+%22Differential+Scanning+Calorimetry%22">Differential Scanning Calorimetry</a>. , Springer Science & Business Media. (2003).</li>
<li>Porter, L. L., George, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22635268">A thermodynamic definition of protein domains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).</li>
<li>Frokjaer, S., Daniel, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+drug+stability%3A+a+formulation+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein drug stability: a formulation challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).</li>
<li>Chiu, M. H., Elmar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry%3A+an+invaluable+tool+for+a+detailed+thermodynamic+characterization+of+macromolecules+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Bioallied+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions.</a> J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).</li>
<li>Hirst, J. D., Charles, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicity%2C+circular+dichroism+and+molecular+dynamics+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins.</a> J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+modules+of+the+vaccinia+virus+complement+control+protein+are+not+in+extensive+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact.</a> Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).</li>
<li>Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+denaturation+as+a+tool+in+the+formulation+optimization+of+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+disc+today%22%5BJournal%5D)">Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics.</a> Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+differential+scanning+calorimetry+for+thermal+stability+analysis+of+proteins%3A+qualification+of+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC.</a> J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).</li>
</ol>

Tous les auteurs sont des employés de Sanofi Pasteur. Le travail a été financé par Sanofi Pasteur, et les frais de publication de cette vidéo-article ont été payés par Sanofi Pasteur. Les auteurs ont aucune affiliation pertinentes ou la participation financière avec toute organisation ou entité qui a un conflit financier avec le sujet ou matériaux discuté dans le manuscrit. Ceux-ci comprennent l&#39;emploi, consultants, détention d&#39;actions ou d&#39;options, ou des redevances. Aucune assistance d&#39;écriture a été utilisée dans la production de ce manuscrit.

Cette procédure a été intégrée avec succès dans divers paquets d&#39;essai de caractérisation, y compris la stabilité et la comparabilité des produits 21 études. Dans les études de stabilité en temps réel, DSC est utilisée pour surveiller la Tm, ainsi que d&#39; estimer la F a des agents biologiques au fil du temps pour déterminer leur durée de vie. En ce qui concerne la comparabilité des produits, il est utilisé pour évaluer l&#39;impact des processus et le changement de l&#39;installation ainsi que l&#39;effet des étapes clés de la fabrication sur la conformation structurelle des lots produits. Cela implique généralement la comparaison directe de l&#39;AH du lot produit à un produit de référence qui a été désigné comme le produit idéal. En outre, DSC a révélé être un outil d&#39; analyse utile pour les études de formulation de produit 37. La Tm d&#39;une protéine dans différents tampons et à des concentrations différentes peuvent être utilisées pour déterminer la formulation la plus grande stabilité profère àla protéine. Pour assurer la fiabilité de cette méthode et de l&#39; objectivité de ses résultats, il est important de garder les paramètres de test cohérente d&#39; une exécution à l&#39; intérieur de la même étude (par exemple, le vaccin contre l&#39; étude de formulation). Toutefois, la procédure peut être modifiée pour tenir compte des différences dans les propriétés physiques des diverses protéines. Un exemple d&#39;une modification qui peut être apportée modifie le taux de l&#39;expérience 38, 39 balayage. Les protéines qui ont été exposées à des agrégats qui forment lorsqu&#39;ils sont chauffés ont été examinés à une vitesse de balayage plus rapide (par exemple, 120 ° C / h) afin d&#39; éviter l&#39;apport de granulats à profil de transition thermique ainsi que d&#39; obstruer les capillaires du calorimètre. Il est intéressant de noter que la numérisation taux peut influencer le résultat d&#39;une expérience de 38 DSC. L&#39;élargissement du pic de transition thermique a été observée avec l&#39;augmentation des taux de balayage dans certains protéines; cependant, T m est resté relativement constant 38. En outre, les dialyse et de dégazage étapes de préparation des échantillons sont également très important pour des résultats précis 31. La dialyse assure que la seule différence dans la composition de l&#39;échantillon et le tampon est la protéine; Ainsi, tout l&#39;excès de chaleur absorbée par l&#39;échantillon peut être attribuée à la capacité thermique de la protéine. Dégazage assure l&#39; analyse du volume précis, comme l&#39;extrapolation du paramètre thermodynamique suppose que l&#39;événement se déroule soit produit dans le volume et la pression 31 constante. La partie de la pression constante de l&#39;hypothèse est comptabilisée par mise sous pression d&#39;azote du système conformément à l&#39;article 1.1 de la procédure. En comparaison à d&#39;autres méthodes de détermination de la stabilité des conformations de protéines telles que dichroïsme circulaire (CD) et Fluorescence spectroscopies, DSC offre un certain nombre d&#39;avantages dans un comcadre commercial, y compris des économies de coûts et de temps. En premier lieu, la conception adiabatique d&#39;un calorimètre différentiel à balayage permet la mesure de la stabilité thermique avec une meilleure précision de la température par rapport aux mesures effectuées avec l&#39; instrumentation pour CD et spectroscopies de fluorescence 6. D&#39; autre part, contrairement aux CD, la précision des données de DSC ne dépend pas de l&#39;hélicité de la protéine 39, 40; Toutefois, CD fournit des informations supplémentaires sur le déroulement de la structure secondaire, qui serait complémentaire du DSC 41. En outre, la mise sous pression du système DSC permet de tester une large gamme de températures sans faire bouillir l&#39;échantillon; Ainsi, une large gamme de protéines peut être testée par DSC. Bien que DSC est une approche relativement simple et rapide pour déterminer la stabilité thermique des produits biologiques, il est pas sans limites. Tout d&#39;abord, la baseétape en ligne de soustraction introduit une certaine forme d&#39;incohérence humaine dans l&#39;analyse de données brutes; ainsi, les variations dans les résultats peuvent être observées entre les différents utilisateurs. Deuxièmement, différentielles calorimètres de balayage ont des limites de concentration minimales qui pourraient être difficiles à réaliser à l&#39;échelle industrielle en vrac. Troisièmement, l&#39;AH de dénaturation thermique irréversible est pas absolue; ce qui implique que Ag dérivé (un indicateur de la stabilité des protéines) dans des scénarios similaires peut être trompeur. En outre, le procédé fonctionne le mieux pour des échantillons purifiés. La présence d&#39;impuretés peut soit provoquer un déplacement de la Tm en cas d&#39;interaction avec la protéine à l&#39;étude, ou l&#39; apparition de nouvelles transitions thermiques s&#39;il n&#39;y a pas d&#39; interaction. En tout cas, ces fonctionnalités supplémentaires sur les thermogrammes peuvent être attribués à tort des échantillons, affectant ainsi l&#39;interprétation des résultats. Malgré ces limites, DSC reste une méthode fiable qui peut fournir des informations détaillées au sujet de thermodynamique thprotéine e processus en cours si elles sont appliquées correctement 42. En conclusion, DSC offre un avantage considérable comme un outil de lecture conformationnelle pour les produits de vaccin et leurs intermédiaires. Les deux paramètres, T m et AH, collectées pour un tableau de lots d&#39;un même produit peuvent devenir une base empirique qui peut être utilisé pour examiner l&#39;impact des changements de processus, la formulation, et les conditions de stockage sur la structure tertiaire et la stabilité des protéines et les antigènes viraux 21, 43.

Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une méthode expérimentale , qui mesure directement la différence dans l&#39; absorption d&#39;énergie thermique ayant lieu dans un échantillon par rapport à une référence lors d&#39; un changement régulé en température 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Effectué dans un calorimètre différentiel à balayage, le procédé consiste à introduire l&#39; énergie thermique dans une cellule échantillon et une cellule de référence , tout en augmentant simultanément la température à l&#39; identique des deux cellules au cours du temps 2, 13,14. En raison de la différence dans la composition de l&#39;échantillon et la référence, la quantité d&#39;énergie différente sera nécessaire pour élever la température des cellules 2, 12, 13. Ainsi, la quantité excessive d&#39;énergie nécessaire pour compenser la différence de température entre les cellules est mesurée et directement corrélée à des propriétés thermodynamiques spécifiques de l&#39;échantillon 1, 3. Dans les années 1960, MJ O&#39;Neil et E. Watson de Perkin Elmer développé le premier calorimètre différentiel pour mesurer le flux de chaleur de matériaux solides 2, 3, 4. En parallèle, PL Privalov et DR Monaseldze EL de l&#39;Institut de Physique, République de Géorgie (ex-URSS) ont créé un calorimètre différentiel adiabatique unique qui peut être utilisé for la recherche biochimique 5, 6. Par la suite, l&#39;équipe de Andronikashvili à l&#39;Institut de Physique, République de Géorgie, a rapporté la capacité thermique de biomolécules telles que les protéines fibreuses et globulaires, l&#39; ADN et l&#39; ARN en utilisant DSC 7, 8, 9. Plusieurs équipes dirigées par Sturtevant 10, 11, 12, 13 Brandts et Privalov 14, 15, 16 concentrés sur le développement de la théorie et les applications pratiques de DSC pour étudier les détails thermodynamiques de dépliement des protéines. La valeur de DSC dans l&#39; étude des grandes structures supramoléculaires tels que les phages, les chloroplastes, les cristaux liquides phospholipides et des protéines de la viande ont également été signalés 17 </<html> sup&gt;, 18, 19, 20. DSC est devenu monnaie courante dans la recherche et le développement pharmaceutique pour l&#39;évaluation de la stabilité thermique des biomolécules, en particulier des protéines 1, 21, 22. Cela est principalement dû à des progrès en termes de sensibilité et de l&#39; automatisation de l&#39;instrumentation utilisée pour réaliser l&#39;expérience 23, 24. Ici, le résultat final de l&#39;expérience de DSC, à savoir, la capacité thermique molaire en fonction de la température, est utilisée pour estimer les paramètres thermodynamiques suivants (changement de capacité thermique (ΔCp), enthalpie (AH), l&#39;entropie (ΔS) et énergie libre de Gibbs (AG)) en utilisant l&#39;équation ci-dessous: eq1.jpg &quot;/&gt; (1) <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" /> (2) <img alt="l&#39;équation 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" /> (3) <img alt="l&#39;équation 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> (4) <img alt="l&#39;équation 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" /> (5) Où Cp est mesurée la capacité thermique; q est le flux de chaleur dans le matériau d&#39;essai; T 0 et T sont les températures initiales et finales de la transition , respectivement 22, 25. Il est également intéressant de noter que les équations applicables ci - dessus pour les protéines à domaine unique qui peuvent subir la transition à deux états et réversible dépliement thermique 22. L&#39; analyse des protéines plus complexes (par exemple des protéines, deux à l&#39; état non, et oligomères) have été rapporté par Friere et al. 26; Johnson et al. 27; et Kasimova et al. 28. Pour déterminer si une protéine subit une transition à deux états ou forme intermédiaires lors de la dénaturation thermique, l&#39;enthalpie expérimentalement (AH; aussi appelé enthalpie comme calorimétrique AH Cal) est comparé à l&#39;enthalpie dérivée en utilisant l&#39;équation de van&#39;t Hoff donnée ci - dessous (également dénommée van&#39;t Hoff enthalpie; AH VH): <img alt="L&#39;équation 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> (6) Où T m est la température de point médian de la transition, R est la constante des gaz parfaits (1,987 cal mol -1 K -1) et Y est la fraction de la population de protéines à l&#39;état déplié 16, 29. SiAH VH est égal à AH Cal; ou AH VH / AH Cal est égal à 1, alors la protéine subit un &quot;tout ou rien&quot; transition (ie de transition à deux états) 16, 25, 29. Cependant, si AH VH est inférieure à AH Cal; ou AH VH / AH Cal est inférieur à 1, la protéine subit une transition à deux états non 16, 25, 29. Le rapport de VH AH / AH Cal correspond également à la proportion de la structure de la protéine qui fond comme une unité ou d&#39;un domaine coopératif 26 thermodynamique. Les paramètres thermodynamiques tels que mentionnés ci-dessus, et Ag AH fournissent des informations utiles quant à la stabilité thermique des protéines, y compris des produits biologiques<html> 30. Cependant, l&#39; accent sera mis sur T m et AH dans cette publication, car ils sont les valeurs déclarées pour ce protocole. T m est la température à mi-parcours de la transition, où le pliage et les états dépliés de la protéine sont à l&#39; équilibre (ie, AG = 0) 25, 31. Plus la Tm d&#39;une protéine, plus sa stabilité thermique 31. AH correspond à la surface sous le pic (s) de la capacité de chaleur par rapport à la courbe de température (également connu sous le thermogramme) généré à la fin de l&#39;expérience DSC 16, 25. Il est l&#39;énergie requise pour dénaturer les protéines et peut être utilisée pour estimer la fraction active (F a) dans une formulation de protéine ( par exemple, la proportion de protéines ayant une conformation active dans un échantillon) en utilisant l&#39;équation suivante: jove_content &quot;&gt; <img alt="L&#39;équation 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> (7) Où AH est l&#39;enthalpie obtenu de façon expérimentale de l&#39;échantillon de protéine et Q est l&#39;enthalpie calculée pour une référence bien caractérisé normalisée ou d&#39;une protéine 22. L&#39;estimation de F a est importante pour la surveillance de la stabilité en temps réel des produits ainsi que la réalisation d&#39; études de stabilité dans des conditions de stress tel que requis par les lignes directrices de l&#39; ICH 32. Comparaison de AH fournit également des informations sur la compacité de la structure tertiaire de conformation d&#39;une protéine 31. Ce protocole décrit en détail une procédure d&#39;évaluation de la stabilité thermique des protéines dans un milieu industriel et a été largement utilisé pour la formulation de vaccins. Il a été développé en utilisant un calorimètre différentiel à balayage automatisé qui génère des résultats reproductibles fou des concentrations aussi faibles que 300 pg / ml de protéine.

<table><tbody><tr><td>Calorimètre différentiel à balayage</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>28428948 (via GE Healthcare)</td><td>Dispose d’un échantillonneur automatique pour la distribution automatisée d’échantillons dans la cellule afin de réduire l’effort humain et les erreurs.</td></tr><tr><td>Contrad 100</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>1504</td><td>Diluer avec de l’eau à 20 % avant utilisation</td></tr><tr><td>500 &micro ; L Plaque en polypropylène à fond rond à 96 puits</td><td>Canadian Life Science</td><td>ML072100</td><td>Des plaques équivalentes d’autres fournisseurs (par exemple , VW) peuvent également être utilisées</td></tr><tr><td>MicroCal ThermoVac.</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>N/Ap</td><td>reçoit l’armoire de biosécurité Cap VP DSC</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Labconco</td><td>Logic+ - Enceinte</td> à <td>flux laminaire de bioconfinement A2 pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Cassette de dialyse Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810 ou 66380</td><td>pour équilibrer l’échantillon et le tampon</td></tr></tbody></table>

calorimétrie différentielle à balayage - une méthode d&#39;évaluation de la stabilité thermique et la conformation de protein antigen

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une technique analytique qui mesure la capacité calorifique molaire d&#39;échantillons en fonction de la température. Dans le cas d&#39;échantillons de protéines, les profils DSC fournissent des informations sur la stabilité thermique, et dans une certaine mesure, sert de «empreinte digitale» de structure qui peut être utilisée pour évaluer la conformation structurelle. Elle est réalisée à l&#39; aide d&#39; un calorimètre différentiel à balayage qui mesure la température de transition thermique (température de fusion, T m) et l&#39;énergie nécessaire pour rompre les interactions de stabilisation de la structure tertiaire (enthalpie, AH) des protéines. Des comparaisons sont faites entre les formulations ainsi que des lots de production, et les différences de valeurs dérivées indiquent des différences dans la stabilité thermique et la conformation structurelle. Les données illustrant l&#39;utilisation de DSC dans un cadre industriel pour les études de stabilité, ainsi que le suivi des étapes clés de la fabrication sont fournis comme preuve de l&#39;efficacité de cette protocol. Par rapport aux autres méthodes d&#39;évaluation de la stabilité thermique des conformations de protéines, DSC est rentable, nécessite peu d&#39;étapes de préparation des échantillons et fournit également un profil thermodynamique complet du processus qui se déroule de la protéine.

Les données brutes de la plupart des expériences de DSC sont présentés sous forme d&#39; un flux de chaleur par rapport à la courbe de température, que le calorimètre mesure en fait la différence entre la vitesse d&#39;écoulement de chaleur dans la solution d&#39;échantillon et de tampon 35. Par conséquent, si les deux cellules (ie cellules d&#39;échantillon et de référence) contiennent des solutions identiques lors d&#39; une expérience, les données brutes de l&#39;analyse devraient être une ligne à plat , avec des pics observables. Tout pic observé peut être attribué à une erreur d&#39;instrumentation (cellules par exemple endommagés ou contaminés), ce qui explique pourquoi l&#39; exécution d&#39; analyses de tampon analyse préalable à l&#39; échantillon est une épreuve suffisante de conformité du système. La figure 1 illustre le résultat d&#39;une analyse de la mémoire tampon typique indiquant que le calorimètre était en bon état de fonctionnement avant l&#39;analyse des échantillons. La figure 2 montre les données brutes d&#39;une expérience DSC effectuée sur diffbeaucoup érents de deux échantillons de protéines. Comme il ressort plus haut, les pics observés sont les différences dans le flux de chaleur des échantillons et leurs tampons respectifs. Les différences de concentration de l&#39;échantillon peuvent provoquer des variations de capacité calorifique enregistré par le calorimètre; Cependant, ces variations sont normalisées lors de l&#39;analyse de l&#39;échantillon conformément à l&#39;article 4.2 de la procédure. Des concentrations plus élevées peuvent également révéler des domaines thermodynamiques supplémentaires ne contribuent pas à la transition à des concentrations plus faibles. En outre, chaque transition représente un domaine thermodynamique qui peut comprendre un ou plusieurs domaines structuraux de la protéine 36. Dans ce cas, la protéine 1 a trois domaines structuraux qui se fondent en coopération. La figure 3 montre les résultats obtenus à partir de l&#39;analyse des données brutes pour les protéines 1 et 2 présentés dans la figure 2, à savoir, après soustraction de base et itératif courbe fiPrép. Les thermogrammes obtenus ont été normalisées pour la numérisation de taux (automatiquement effectué par un algorithme prédéfini dans le logiciel d&#39;analyse) et de la concentration; Ainsi, la présentation des résultats de l&#39;expérience de la capacité calorifique comparable par rapport à des graphes de température. Le logiciel d&#39;analyse utilise les données de la capacité calorifique par rapport à des graphiques de température, tels que T m et ΔCp, pour dériver d&#39; autres paramètres thermodynamiques utilisant des variations des équations données ci - dessus en fonction de la coopérativité de dépliement des protéines. Lors du test des échantillons inconnus, le réglage de la plage de température appropriée est cruciale. Dans le cas contraire, les thermogrammes incomplètes peuvent en résulter, comme cela est illustré sur la figure 4. Bien que T m à partir de ces profils peut être dérivée, AH ne peut pas être déterminée avec précision. Par conséquent, l&#39;échantillon doit être retesté avec une plus grande plage de température pour saisir complètement la transition thermique. Certaines protéines re aussiforme adily agrégats après dénaturation complète, résultant en une augmentation de la capacité thermique post-transition: apparaît souvent comme un thermogramme incomplet comme illustré sur la figure 2B. Cependant, un nouvel essai avec une température finale plus élevée peut permettre de confirmer l&#39;existence d&#39;une occurrence d&#39;une transition conformationnelle dans cette région du thermogramme ou il est que l&#39;effet d&#39;absorption de la chaleur des agrégats de protéines. La stabilité thermique est l&#39; une des propriétés physiques les plus importantes de protéines et de produits à base de protéines dans l&#39;industrie 37. Dans le domaine pharmaceutique, il est utilisé pour déterminer la stabilité des produits biologiques dans des conditions différentes, y compris des tampons de formulation et des facteurs environnementaux tels que l&#39;humidité et la température. Il est également utilisé pour surveiller la clé étape de fabrication (par exemple, la purification et la désintoxication) pour assurer la cohérence conformationnelle entre les lots de production. <strong<html> &gt; Les figures 5 et 6 illustrent l&#39;utilisation de DSC pour examiner les effets des conditions de désintoxication et de stockage de produits chimiques , respectivement sur la stabilité et la conformation structurelle de deux protéines différentes. Les différences significatives dans Tm et AH indiquent des changements conformationnels et la dégradation des protéines, respectivement. En outre, la perte de la troisième transition de la figure 6 illustre en outre la dégradation d&#39;un domaine qui a été confirmé par une diminution du poids moléculaire , lorsque les échantillons ont été analysés en utilisant des tailles de chromatographie d&#39; exclusion par diffusion de lumière multi-angles (SEC-MALS) ( données non présentées). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> Figure 1: Buffer Scans. La similitude de gradient de chaque balayage, sans pics observables indique que l&#39;appareil est en bon état de fonctionnement et a généré des résultats reproductibles.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> Figure 2: Les données brutes recueillies à partir des expériences de DSC. Ces graphiques sont bonnes représentations des données non analysées (brutes) acquis après essais expérimentaux (ie avant soustraction de base et l&#39; ajustement de courbe). Chaque ligne représente un lot de production. Protein 2 tend à regrouper plus facilement lors du chauffage, ce qui entraîne une augmentation de la capacité thermique supérieure à 100 ° C dans la région post-transition du thermogramme. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /><br/&gt; Figure 3: Analyse DSC données. Ces graphiques sont bonnes représentations de données DSC analysées (après soustraction de base et ajustement de la courbe). La ligne bleue représente le thermogramme après soustraction de base, tandis que la ligne rouge représente la courbe avec le meilleur ajustement à la thermogramme. (A) La Tm pour les protéines et AH 1 Echantillon n ° 12 sont 80,16 ° C et 1,69 x 10 6 cal / mol respectivement. (B) Le T m et AH pour Protein 1 Echantillon n ° 13 sont 80,15 ° C et 1,71 x 10 6 cal / mol respectivement. (C) La Tm pour les protéines et AH 2 Echantillon n ° 21 sont 75,01 ° C et 4,08 x 10 6 cal / mol respectivement. (D) La Tm pour les protéines et AH 2 Echantillon n ° 22 sont 75,67 ° C et 4,22 x 10 6 cal / mol respectivement. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour</a>voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> Figure 4: Un thermogramme incomplet. Les données brutes pour recueillir Protein 1 analysé à une plage de température insuffisante. La température finale de l&#39; expérience a été réglée à 90 ° C , qui n&#39;a pas tenu compte du profil de la transition complète de la protéine par rapport à l&#39;expérience de la figure 2A qui a été réglée à 120 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> Figure 5: a analysé les données montrant l&#39;effet de détoxification chimique sur la structure tertiaire de la protéine 1. (A) Protein 1 est une toxine dans sa conformation native et has son T m à 56,84 ° C et AH à 2.57 x 10 5 cal / mol. (B) La forme détoxifiée de Protein 1 (c. -à- tétanique) a respectivement T m et les valeurs ÔH de 81,01 ° C et 1,89 x 10 6 cal / mol. Ainsi, on peut conclure que l&#39;étape de désintoxication introduit une certaine forme de variation de la conformation structurelle de la protéine 1 qui confère une plus grande stabilité (supérieure T m) à sa forme détoxifiée. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> Figure 6: a analysé les données montrant l&#39;effet des conditions de stockage sur la Conformation des protéines 3. Ces graphiques illustrent l&#39;effet de la température de stockage (2 - 8 ° C) sur la stabilité et la structure tertiaire de ProTein 3 plus de 30 semaines. La Tm et les valeurs ÔH pour la protéine 3 au 8 ème (A) et 38 ème semaine (B) de stockage sont donnés dans le tableau 1 ci - dessous. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Échantillon </td><td> Tm 1 (° C) </td><td> AH 1 (cal / mol) </td><td> 2 Tm (° C) </td><td> AH 2 (cal / mol) </td><td> 3 Tf (° C) </td><td> AH 3 (cal / mol) </td></tr><tr><td> Protein 3 stocké à 2-8 ° C pendant 8 semaines </td><td> 61,91 </td><td> 1,71 x 10 5 </td><td> 75,54 </td><td> 2,17 x 10 5 </td><td> 90.29 </td><td> 4,17 x 10 5 </td></tr><tr><td&gt; Protein 3 stocké à 2-8 ° C pendant 38 semaines </td><td> 61.87 </td><td> 1,66 x 10 5 </td><td> 75.18 </td><td> 1,46 x 10 5 </td><td> 90.22 </td><td> 5,76 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Tm et ÔH valeurs pour Protein 3 au 8 e et 38 e Semaine de stockage à 2 - 8 ° C. Bien que les valeurs de Tm des deux points de temps sont les mêmes, la différence entre les valeurs de ÔH indique que la structure tertiaire de la protéine 3 a dégradé de plus de 30 semaines dans les conditions de stockage spécifiées.

La calorimétrie différentielle mesure la température de transition thermique (s) et de l&#39;énergie thermique totale requise pour dénaturer une protéine. Les résultats obtenus sont utilisés pour évaluer la stabilité thermique des antigènes protéiques dans des formulations de vaccins.

Calorimétrie différentielle à balayage - une méthode d&#39;évaluation de la stabilité thermique et la Conformation de Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer la stabilité thermique et la conformation structurelle des protéines dans un environnement industriel à l’aide de la calorimétrie différentielle à balayage. La calorimétrie différentielle à balayage mesure la capacité thermique molaire des échantillons en fonction de la température et a été utilisée avec succès pour évaluer la stabilité thermique et la conformation structurelle des protéines. Cette procédure relativement simple ne dépend pas de l’hélicité structurale ou des fluorophores intrinsèques comme c’est le cas pour d’autres méthodes biophysiques.Un autre avantage de cette technique est qu’elle mesure directement la température de transition thermique et l’énergie nécessaire pour perturber l’interaction, stabilisant ainsi la structure tertiaire des protéines. Lorsqu’elle est utilisée en conjonction avec l’enthousiasme du dépliage, la température de transition thermique peut servir de paramètre utile pour surveiller l’uniformité d’un lot à l’autre des processus de fabrication de produits biologiques. La démonstration visuelle de cette méthode peut servir de support interactif pour aider efficacement les nouveaux utilisateurs à franchir les étapes critiques.Pour commencer, activez le calorimètre différentiel à balayage. Ensuite, fournissez de l’azote dans le système. Cela augmentera la pression dans les cellules pour supprimer l’ébullition des échantillons et empêcher la formation de bulles à des températures élevées.En fonction du matériau constitutif de la cellule, ajustez la pression de l’alimentation en azote gazeux selon la pression recommandée par le fabricant pour éviter d’endommager la cellule. Assurez-vous que tous les réservoirs de produit de nettoyage sont remplis au volume requis. Les agents de nettoyage requis comprennent un détergent pour laver la cellule et de l’eau pour nettoyer la cellule après chaque analyse d’échantillon.Réglez la température du compartiment de stockage de l’échantillon à une valeur appropriée, de préférence cinq degrés Celsius, pour maintenir l’intégrité de l’échantillon avant l’expérience. Il est important d’équilibrer l’échantillon par rapport au tampon pour s’assurer que la seule différence entre les solutions est la protéine. Par conséquent, la différence observée de capacité thermique peut être correctement attribuée à la protéine.Déterminer la concentration de l’échantillon de protéines à l’aide d’une méthode appropriée de détermination de la concentration de protéines, telle que la méthode de Lowry. Pour l’instrument utilisé dans ce protocole, la plage de travail préférable est de 0,5 à un milligramme de protéines par millilitre. Dialisez l’échantillon contre le tampon qui servira de référence pour l’expérience.Dégazez l’échantillon et le tampon de référence dans le vide pour éliminer les microbulles qui peuvent entraîner une imprécision du volume. En travaillant dans une armoire de bioconfinement à flux laminaire, à l’aide d’une micropipette et d’embouts stériles, chargez les échantillons dans leur tampon respectif par paires dans des plaques à 96 puits. Remplissez les deux premières paires de puits avec un tampon pour effectuer des balayages tampon-tampon afin de vérifier l’adéquation de l’instrument avant la mesure de l’échantillon.Remplissez les deux dernières paires de puits avec de l’eau pour le balayage d’eau afin de nettoyer les cellules. Couvrez ensuite la plaque à 96 puits d’un film d’étanchéité. Assurez-vous que les puits sont correctement scellés avant de retirer la plaque de l’enceinte de biosécurité afin d’éviter la contamination de l’échantillon.Enfin, placez la plaque dans le compartiment de rétention de l’échantillon dans la bonne orientation. À l’aide du logiciel d’acquisition, entrez les informations de l’échantillon dans l’ordre dans lequel la plaque a été chargée. Entrez les concentrations de protéines si disponibles.Sinon, entrez la concentration dans le logiciel d’analyse avant l’analyse des données. Sélectionnez l’option qui assure le nettoyage de la cellule avec un détergent avant chaque balayage d’échantillon. Le nettoyage doit être suivi de plusieurs étapes de rinçage à l’eau pour s’assurer qu’aucun résidu de détergent ne reste dans les cellules.Réglez la température de départ de l’expérience à 20 degrés Celsius, ce qui peut varier en fonction de l’échantillon. Pour les protéines connues, une température de départ prédéterminée peut être utilisée tandis qu’une température de départ plus basse peut être appliquée pour des échantillons inconnus. Réglez ensuite la température finale de l’expérience.La température finale peut également varier en fonction de la connaissance préalable de l’échantillon. Ensuite, réglez la vitesse de balayage de l’expérience. Il est conseillé de scanner des échantillons inconnus à différentes vitesses de balayage pour évaluer la cinétique de dépliage.Mettre en place le logiciel d’acquisition pour rescanner les échantillons afin d’examiner la réversibilité de la transition thermique. Le dépliage d’une protéine est considéré comme réversible si l’enthalpie obtenue pour le deuxième balayage est d’au moins 80 % de la valeur d’enthalpie du premier balayage. Réglez le thermostat post-expérience à 10 degrés Celsius pour préserver l’intégrité de la cellule du calorimètre.Vérifiez que les paramètres de configuration de l’expérience sont corrects avant d’exécuter l’expérience. Si tout est en place, lancez l’expérience. Après l’expérience, effectuez l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte.Pour l’analyse, la soustraction de la ligne de base est effectuée manuellement. La cohérence à cette étape est cruciale pour obtenir des résultats comparables. Voici les données brutes représentatives d’une série expérimentale, y compris le tampon et les balayages d’eau.Les échantillons analysés sont des toxines dans leurs états natifs et détoxifiés. Les balayages d’échantillons sont traités séparément pour calculer les valeurs de température de fusion et d’enthalpie de chaque échantillon. Pour l’État d’origine, la température de fusion est de 55,55 degrés Celsius et l’enthalpie de la toxine est de 3,157 fois 10 puissance cinq calories par mole.À l’inverse, la température de fusion de la toxine dans son état détoxifié est de 81,21 degrés Celsius et l’enthalpie est de 3,656 fois 10 puissance cinq calories par mole. La superposition des données traitées de la toxine dans ses états natif et détoxifié démontre que l’échantillon détoxifié est plus stable thermiquement que son état natif en fonction des valeurs de température de fusion. Cela indique également que le processus de détoxification introduit des changements structurels dans la structure tertiaire de la toxine.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de fournir un approvisionnement adéquat en détergent et en eau pour éviter la contamination croisée de la cellule et de la seringue, car leur clarté est cruciale pour des résultats précis. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la calorimétrie différentielle à balayage comme méthode d’évaluation de la stabilité thermique et de la conformation des protéines. Vous serez également en mesure de faire des déductions significatives à partir des cycles thermiques résultants.Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le dichroïsme circulaire peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les modifications des structures secondaires lors du dépliage. Les données recueillies pour un éventail de lots du même produit ont été utilisées pour créer des bases de référence empiriques afin d’examiner l’impact des changements de procédé, de formulation et des conditions de stockage sur la conformation de la structure des antigènes protéiques pour la production de vaccins.

differential-scanning-calorimetry-method-for-assessing-thermal

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Cette vidéo présente la calorimétrie différentielle à balayage, une technique permettant d’étudier l’interaction entre une biomolécule et un ligand. La liaison d’un aptamère d’ADN et d’un ligand thermolabile est étudiée en appliquant des cycles répétés de chauffage et de refroidissement à l’échantillon et en obtenant des balayages pour l’analyse thermodynamique.

Calorimétrie différentielle à balayage pour étudier l’interaction aptamère-ligand thermolabile de l’ADN

Le mélange est une approche efficace pour générer des biomatériaux avec un large éventail de propriétés et caractéristiques combinées. En prévision des interactions moléculaires entre les différentes protéines de soie naturelle, de nouvelles plates-formes en alliage de protéines de soie de soie avec la résilience accordable mécanique, réponse électrique, transparence optique, au traitement chimique, la biodégradabilité, ou la stabilité thermique peuvent être conçus.

Concevoir protéines de soie soie Matériaux alliage pour applications biomédicales

La fluorimétrie différentielle à balayage est une méthode largement utilisée pour cribler des bibliothèques de petites molécules pour les interactions avec les protéines. Nous présentons ici une méthode simple pour étendre ces analyses afin de fournir une estimation de la constante de dissociation entre une petite molécule et son partenaire protéique.

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

Nous présentons un protocole pour la caractérisation rapide des biomoléculaire pliage et contraignant les interactions avec les ligands thermolabiles utilisant la calorimétrie différentielle à balayage.

Mesurer les profils biomoléculaire DSC avec des Ligands Thermolabile de caractériser rapidement pliage et reliure Interactions

Un protocole est présenté pour tester rapidement la stabilité thermique des protéines dans une variété de conditions par décalage thermique et nano différentielle à balayage fluorimétrie. Systèmes tampon, de sels et d’additifs, ensemble comprenant trois écrans de stabilité unique, sont dosés avec des protéines afin d’identifier des tampons adaptés pour des études fonctionnelles et structurelles.

Comment faire pour stabiliser les protéines : écrans de stabilité thermique décaler dosages et Nano différentielle Fluorimétrie dans le projet Virus-X à balayage

Mesures de l’engagement de cibles de drogue sont au cœur de développement des médicaments efficaces et validation de la sonde chimique. Ici, nous détaillons un protocole permettant de mesurer l’engagement de drogue-cible à l’aide de l’imagerie contenu élevé dans une adaptation de microplaques compatibles de l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA).

À l’aide de contenu élevé d’imagerie afin de quantifier l’Engagement de cibles en cellules adhérentes

La surveillance des changements dans la température de fusion d’une protéine cible(c.-à-d.essai de décalage thermique, TSA) est une méthode efficace pour filtrer les bibliothèques de fragments de quelques centaines de composés. Nous présentons un protocole TSA mettant en œuvre la fluorimétrie à balayage nano-différentiel assistée par robotique (nano-DSF) pour surveiller la fluorescence intrinsèque du tryptophane et la rétrodiffusion de la lumière pour le criblage des fragments.

Fluorimétrie à balayage nano-différentiel pour le criblage dans la découverte de plomb à base de fragments

Cette publication montre l’application de la diffraction des rayons X et de la calorimétrie différentielle à balayage comme étalons de référence pour étudier l’état solide des excipients à base de lipides (LBE). Comprendre l’altération à l’état solide dans les LBE et son effet sur la performance des produits pharmaceutiques est le facteur clé pour la fabrication de formes posologiques robustes à base de lipides.

Un ensemble d’outils analytiques établis pour étudier l’altération à l’état solide des excipients à base de lipides

Ce protocole décrit une méthode unique de détection de la liaison entre les composés et les molécules de protéines, offrant les avantages d’une perte minimale d’échantillons de protéines et d’une grande précision des données.

Détection de l’interaction protéine-ombellifère CD40 par fluorescence différentielle

L'interaction entre les canaux HCN et leur sous-unité auxiliaire a été identifié comme une cible thérapeutique dans le trouble dépressif majeur. Ici, une méthode basée sur la polarisation de fluorescence pour identifier les petites molécules inhibitrices de cette interaction protéine-protéine, est présentée.

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Découvrez la calorimétrie différentielle à balayage pour évaluer la stabilité thermique et la conformation des protéines antigéniques. Cette méthode mesure directement la température de transition et l'énergie de dénaturation.

Calorimétrie différentielle à balayage - une méthode dévaluation de la stabilité thermique et la Conformation de Protein Antigen (Vidéo) | JoVE Journal

Calorimétrie différentielle à balayage - une méthode d'évaluation de la stabilité thermique et la Conformation de Protein Antigen

Explorer plus de vidéos