Calorimétrie différentielle à balayage - une méthode d'évaluation de la stabilité thermique et la Conformation de Protein Antigen

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer la stabilité thermique et la conformation structurelle des protéines dans un environnement industriel à l’aide de la calorimétrie différentielle à balayage. La calorimétrie différentielle à balayage mesure la capacité thermique molaire des échantillons en fonction de la température et a été utilisée avec succès pour évaluer la stabilité thermique et la conformation structurelle des protéines. Cette procédure relativement simple ne dépend pas de l’hélicité structurale ou des fluorophores intrinsèques comme c’est le cas pour d’autres méthodes biophysiques.

Un autre avantage de cette technique est qu’elle mesure directement la température de transition thermique et l’énergie nécessaire pour perturber l’interaction, stabilisant ainsi la structure tertiaire des protéines. Lorsqu’elle est utilisée en conjonction avec l’enthousiasme du dépliage, la température de transition thermique peut servir de paramètre utile pour surveiller l’uniformité d’un lot à l’autre des processus de fabrication de produits biologiques. La démonstration visuelle de cette méthode peut servir de support interactif pour aider efficacement les nouveaux utilisateurs à franchir les étapes critiques.

Pour commencer, activez le calorimètre différentiel à balayage. Ensuite, fournissez de l’azote dans le système. Cela augmentera la pression dans les cellules pour supprimer l’ébullition des échantillons et empêcher la formation de bulles à des températures élevées.

En fonction du matériau constitutif de la cellule, ajustez la pression de l’alimentation en azote gazeux selon la pression recommandée par le fabricant pour éviter d’endommager la cellule. Assurez-vous que tous les réservoirs de produit de nettoyage sont remplis au volume requis. Les agents de nettoyage requis comprennent un détergent pour laver la cellule et de l’eau pour nettoyer la cellule après chaque analyse d’échantillon.

Réglez la température du compartiment de stockage de l’échantillon à une valeur appropriée, de préférence cinq degrés Celsius, pour maintenir l’intégrité de l’échantillon avant l’expérience. Il est important d’équilibrer l’échantillon par rapport au tampon pour s’assurer que la seule différence entre les solutions est la protéine. Par conséquent, la différence observée de capacité thermique peut être correctement attribuée à la protéine.

Déterminer la concentration de l’échantillon de protéines à l’aide d’une méthode appropriée de détermination de la concentration de protéines, telle que la méthode de Lowry. Pour l’instrument utilisé dans ce protocole, la plage de travail préférable est de 0,5 à un milligramme de protéines par millilitre. Dialisez l’échantillon contre le tampon qui servira de référence pour l’expérience.

Dégazez l’échantillon et le tampon de référence dans le vide pour éliminer les microbulles qui peuvent entraîner une imprécision du volume. En travaillant dans une armoire de bioconfinement à flux laminaire, à l’aide d’une micropipette et d’embouts stériles, chargez les échantillons dans leur tampon respectif par paires dans des plaques à 96 puits. Remplissez les deux premières paires de puits avec un tampon pour effectuer des balayages tampon-tampon afin de vérifier l’adéquation de l’instrument avant la mesure de l’échantillon.

Remplissez les deux dernières paires de puits avec de l’eau pour le balayage d’eau afin de nettoyer les cellules. Couvrez ensuite la plaque à 96 puits d’un film d’étanchéité. Assurez-vous que les puits sont correctement scellés avant de retirer la plaque de l’enceinte de biosécurité afin d’éviter la contamination de l’échantillon.

Enfin, placez la plaque dans le compartiment de rétention de l’échantillon dans la bonne orientation. À l’aide du logiciel d’acquisition, entrez les informations de l’échantillon dans l’ordre dans lequel la plaque a été chargée. Entrez les concentrations de protéines si disponibles.

Sinon, entrez la concentration dans le logiciel d’analyse avant l’analyse des données. Sélectionnez l’option qui assure le nettoyage de la cellule avec un détergent avant chaque balayage d’échantillon. Le nettoyage doit être suivi de plusieurs étapes de rinçage à l’eau pour s’assurer qu’aucun résidu de détergent ne reste dans les cellules.

Réglez la température de départ de l’expérience à 20 degrés Celsius, ce qui peut varier en fonction de l’échantillon. Pour les protéines connues, une température de départ prédéterminée peut être utilisée tandis qu’une température de départ plus basse peut être appliquée pour des échantillons inconnus. Réglez ensuite la température finale de l’expérience.

La température finale peut également varier en fonction de la connaissance préalable de l’échantillon. Ensuite, réglez la vitesse de balayage de l’expérience. Il est conseillé de scanner des échantillons inconnus à différentes vitesses de balayage pour évaluer la cinétique de dépliage.

Mettre en place le logiciel d’acquisition pour rescanner les échantillons afin d’examiner la réversibilité de la transition thermique. Le dépliage d’une protéine est considéré comme réversible si l’enthalpie obtenue pour le deuxième balayage est d’au moins 80 % de la valeur d’enthalpie du premier balayage. Réglez le thermostat post-expérience à 10 degrés Celsius pour préserver l’intégrité de la cellule du calorimètre.

Vérifiez que les paramètres de configuration de l’expérience sont corrects avant d’exécuter l’expérience. Si tout est en place, lancez l’expérience. Après l’expérience, effectuez l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte.

Pour l’analyse, la soustraction de la ligne de base est effectuée manuellement. La cohérence à cette étape est cruciale pour obtenir des résultats comparables. Voici les données brutes représentatives d’une série expérimentale, y compris le tampon et les balayages d’eau.

Les échantillons analysés sont des toxines dans leurs états natifs et détoxifiés. Les balayages d’échantillons sont traités séparément pour calculer les valeurs de température de fusion et d’enthalpie de chaque échantillon. Pour l’État d’origine, la température de fusion est de 55,55 degrés Celsius et l’enthalpie de la toxine est de 3,157 fois 10 puissance cinq calories par mole.

À l’inverse, la température de fusion de la toxine dans son état détoxifié est de 81,21 degrés Celsius et l’enthalpie est de 3,656 fois 10 puissance cinq calories par mole. La superposition des données traitées de la toxine dans ses états natif et détoxifié démontre que l’échantillon détoxifié est plus stable thermiquement que son état natif en fonction des valeurs de température de fusion. Cela indique également que le processus de détoxification introduit des changements structurels dans la structure tertiaire de la toxine.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de fournir un approvisionnement adéquat en détergent et en eau pour éviter la contamination croisée de la cellule et de la seringue, car leur clarté est cruciale pour des résultats précis. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la calorimétrie différentielle à balayage comme méthode d’évaluation de la stabilité thermique et de la conformation des protéines. Vous serez également en mesure de faire des déductions significatives à partir des cycles thermiques résultants.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le dichroïsme circulaire peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les modifications des structures secondaires lors du dépliage. Les données recueillies pour un éventail de lots du même produit ont été utilisées pour créer des bases de référence empiriques afin d’examiner l’impact des changements de procédé, de formulation et des conditions de stockage sur la conformation de la structure des antigènes protéiques pour la production de vaccins.