Préparation du visage à la souris

L’objectif global de cette procédure est de préparer l’aorte et l’artère carotide de la souris à l’immunocoloration du visage après une ligature de l’artère carotide gauche. Cette méthode nous permet d’étudier l’organisation, l’expression de chaque protéine et l’état possible des cellules antrales et d’autres cellules vasculaires dans des méthodes d’immunocoloration. Les préparations en face permettent d’analyser de grandes zones à travers les vaisseaux sanguins pour l’évaluation de la différence régionale dans l’expression de divers paramètres cellulaires normaux et possibles.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Quaico, un microchirurgien de notre groupe. Commencez par placer la souris anesthésiée sur une planche chirurgicale en position couchée. Après avoir confirmé l’absence de réponse au pincement des orteils, collez les pattes avant à la planche en position tendue et les deux pattes arrière du côté droit de la souris pour les exposer au côté gauche du cou.

Retirez les poils autour de la zone cervicale et désinfectez la peau exposée. Couvrez la souris avec un champ chirurgical stérilisé avec un trou sur la région chirurgicale et appliquez une pommade sur les yeux de l’animal. Passez la souris sous le microscope de dissection et faites une incision médiane ventrale autour de la région cervicale.

Repositionnez les glandes salivaires qui recouvrent les vaisseaux sanguins du côté gauche de l’animal pour exposer l’artère carotide commune gauche, qui bifurque en artère carotide interne gauche et en artère carotide externe gauche. Retirez doucement le tissu conjonctif autour et en dessous de l’artère carotide interne gauche et utilisez une pince pour passer une longueur de 2,5 centimètres de suture en soie prédécoupée six O sous l’artère, à l’aide d’une deuxième pince pour tirer la suture d’environ un tiers de sa longueur de l’autre côté du vaisseau. Ligate l’artère carotide interne gauche.

Ensuite, retirez le tissu conjonctif autour de l’artère carotide externe gauche, comme nous venons de le démontrer, et faites une ligature à proximité de l’artère thyroïde supérieure gauche. Lorsque toutes les artères, à l’exception de l’artère occipitale, ont été ligaturées, remettez les glandes salivaires dans leur position d’origine et hydratez le champ opératoire avec deux à trois gouttes de solution saline. Ensuite, utilisez six sutures en vicryl enduites de O pour fermer la peau et placez la souris dans la cage préchauffée avec surveillance jusqu’à ce qu’elle décubise complètement.

À la fin de l’expérience, fixez la souris en position couchée sur une planche de dissection et utilisez des ciseaux à iris pour exposer la cavité abdominale avec une incision médiane. Coupez les côtes latéralement au sternum pour exposer la cavité thoracique. Ensuite, entaillez l’artère fémorale et insérez une aiguille de calibre 26 attachée à une profusion gravitaire installée dans l’apex du ventricule gauche pour profuser le système circulatoire avec une solution saline complétée par de l’héparine.

Continuez la profusion jusqu’à ce que la solution saline qui s’écoule de la coupe devienne claire. Ensuite, changez le système de profusion de solution saline à 4 % de paraformaldéhyde dans le PBS. Après cinq minutes, passez la souris sous le microscope de dissection et utilisez des ciseaux et des pinces à bout émoussé pour prélever l’aorte et les artères carotides gauche et droite.

Ensuite, transférez les tissus dans une boîte de Pétri de PBS et retirez soigneusement la graisse et les tissus conjonctifs, puis séparez et fendez longitudinalement l’aorte et les artères carotides pour exposer l’endothélium. La chose la plus importante à retenir lors de la préparation des vaisseaux sanguins en face est que les cellules endothéliales sont facilement endommagées par une manipulation brutale. N’étirez à aucun moment les récipients, en particulier pendant les étapes de récolte et de nettoyage.

Transférez ensuite chaque récipient dans des puits individuels d’une plaque de 12 puits contenant 0,5 millilitre de solution de perméabilisation par puits. Perméabiliser les vaisseaux sanguins pendant 10 minutes en le berçant à température ambiante, suivi d’un bref lavage au PBS. Bloquez toute liaison non spécifique avec une incubation de 30 minutes dans 10 % de sérum normal de la même espèce que les anticorps secondaires prévus dans le TTBS, avec balancement à température ambiante.

Ensuite, étiquetez les échantillons avec les anticorps primaires d’intérêt dilués dans du TTBS avec 10 % de sérum normal pendant la nuit avec un balancement à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, rincez les vaisseaux sanguins avec trois lavages de 10 minutes dans du TTBS avec balancement à température ambiante, suivis d’une incubation dans les anticorps secondaires appropriés dilués dans du TTBS et 10 % de sérum normal et dappy. Remettez les échantillons dans la bascule et couvrez pour les protéger de la lumière.

Après une heure à température ambiante avec bascule, laver les échantillons trois fois dans du TTBS frais, comme démontré, suivi d’un bref rinçage au PBS, et placer une goutte de réactif anti-décoloration par récipient sur des verres de couverture individuels de 22 x 50 millimètres. Au microscope, placez un récipient dans chaque goutte de réactif avec l’endothélium vers le bas, et couvrez les récipients avec une lame de verre de 22 x 75 millimètres par échantillon. Placez les lames sur une lingette de laboratoire propre et couvrez-les de deux morceaux de lingette de laboratoire et de 3,5 kilogrammes de poids pour aplatir les vaisseaux.

Après un maximum de cinq minutes, retirez le poids et essuyez l’excès de solution autour des lamelles. Appliquez ensuite du vernis à ongles sur les quatre coins des lamelles et placez les lames dans une boîte à glissières, côté housse vers le haut. Le lendemain matin, utilisez plus de vernis à ongles pour sceller complètement les lamelles et imagez les vaisseaux dès que le vernis à ongles est sec.

Ici, une image typique de l’immuno-florescence en face d’un double endothélial coloré avec des anticorps anti-cadhérine anti-VE, une molécule d’adhésion cellulaire vasculaire et illustrant une seule section optique d’une aorte de souris prise près de l’ouverture d’une artère intercostale, est présentée. Notez la coloration du contour linéaire vert à la jonction d’adhérence des cellules endothéliales et la forte molécule d’adhésion des cellules vasculaires, une coloration à l’ouverture de l’artère intercostale où le flux sanguin perturbé est connu pour se produire. Sur ces images, on peut observer la coloration en face d’une carotide gauche partiellement ligaturée et d’une artère droite non ligaturée témoin un jour après l’opération, avec une augmentation de la molécule d’adhésion anti-cellulaire vasculaire, une coloration apparente dans le vaisseau ligaturé.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire une ligature partielle de l’artère carotide gauche et de faire des préparations en face dans les vaisseaux sanguins de la souris. Apportez-le avec votre optique à d’autres petits animaux. L’utilisation des préparations en face est maintenant limitée à la coloration par immunofluorescence, mais peut également être utilisée avec d’autres méthodes, par exemple pour l’étude de ces régions entières après la coloration des orioles, ou pour des contre-expériences ex vivo.