Application de Codé génétiquement fluorescent oxyde nitrique (NO •) Sondes, les geNOps, pour l'imagerie en temps réel de NO • Les signaux dans les cellules simples

Ce manuscrit présente des protocoles pour l’application de nouvelles sondes d’oxyde nitrique (NO•) génétiquement codées (geNOps) pour surveiller les fluctuations de NO• d’une cellule unique en temps réel à l’aide de la microscopie à fluorescence. La formation de NO• déclenchée par le Ca²⁺ au niveau des cellules endothéliales individuelles a été visualisée en combinant les geNOps avec un capteur chimique Ca²⁺.

L’objectif global de cette approche d’imagerie est de surveiller les signaux d’oxyde nitrique en temps réel au niveau des cellules individuelles à l’aide d’une nouvelle classe de sondes fluorescentes d’oxyde nitrique génétiquement codées, les geNOps. Compte tenu de l’importance de l’oxyde nitrique en biologie et en physiologie, une visualisation de cette molécule au niveau cellulaire ou même subcellulaire a été souhaitée depuis sa découverte. Nous visualisons les signaux d’oxyde nitrique à l’aide de nouvelles sondes à base de protéines fluorescentes, de construction plutôt simple, les geNOps.

Les geNOps réagissent directement et immédiatement au monoxyde d’azote par extinction de fluorescence. Cela signifie que vous pouvez surveiller la cinétique en temps réel de la génération, de la diffusion et de la dégradation de l’oxyde nitrique dans des cellules uniques. Le principal avantage des geNOps est que vous pouvez examiner les signaux d’oxyde nitrique avec une résolution spatiale et temporelle élevée à l’aide d’un microscope à fluorescence conventionnel.

Commencez cette procédure en remplaçant le tampon de stockage de la lignée cellulaire endothéliale ou des cellules HEK293 par un millilitre par puits de la solution de booster de fer(II) à température ambiante. Incuber les cellules pendant exactement 20 minutes dans l’obscurité. La procédure de chargement du fer est essentielle pour obtenir une réactivité complète des sondes et peut être adaptée à différents types de cellules et applications.

Ensuite, lavez les cellules une fois avec un tampon de stockage et incubez chaque puits avec deux millilitres de tampon de stockage pendant au moins deux heures à température ambiante afin de permettre aux cellules de s’équilibrer. Ensuite, remplacez la mémoire tampon de stockage par Fura-2AM de 3,3 micromolaires dans un millilitre de mémoire tampon de stockage. Protégez les cellules de la lumière et incubez-les pendant 45 minutes.

Après 45 minutes, lavez les cellules deux fois avec un tampon de stockage, et incubez-les à nouveau pendant au moins 30 minutes afin de permettre aux cellules de s’équilibrer. Pour commencer la procédure, fixez d’abord une lamelle de 30 millimètres recouverte de la lignée cellulaire endothéliale ou de cellules HEK293 dans une chambre de perfusion métallique. Allumez le système d’imagerie, puis placez la chambre de perfusion métallique sur le microscope.

Connectez le tube d’afflux aux réservoirs tampons, puis allumez le système de perfusion. Raccordez maintenant l’efflux à une pompe à vide, en assurant un débit constant et en évitant la vidange de la lamelle. Démarrez la perfusion par gravité avec un tampon de calcium physiologique à l’aide d’un système de perfusion semi-automatique.

Définissez ensuite les paramètres d’imagerie à l’aide du logiciel correspondant. Sélectionnez les longueurs d’onde d’excitation 340 nanomètres et 380 nanomètres pour l’imagerie Fura-2 et 480 nanomètres pour l’excitation G-geNOp. Ensuite, sélectionnez la région d’imagerie en déplaçant la table xyz du microscope jusqu’à ce que plusieurs cellules fluorescentes soient mises au point.

Ensuite, définissez les régions d’intérêt. Dessinez les régions couvrant plusieurs cellules fluorescentes uniques entières pour chaque champ d’imagerie. Ensuite, définissez une région d’arrière-plan de taille similaire.

Commencez à collecter des données sur un microscope fluorescent inversé et avancé avec une platine d’échantillonnage motorisée et une source de lumière monochromatique. Alternativement, excitez les cellules à 340 nanomètres et 380 nanomètres pour Fura-2AM et 480 nanomètres pour G-geNOp, respectivement. Réglez les temps d’exposition respectifs de manière à ce qu’un signal de fluorescence clair soit détectable au fil du temps pour tous les canaux.

Collectez la lumière émise à 510 nanomètres pour Fura-2AM, 520 nanomètres pour G-geNOp à l’aide d’une caméra CCD avec un ensemble de filtres approprié composé de l’excitateur de 500 nanomètres, d’un dichroïque de 495 nanomètres et d’un émetteur de 510-520 nanomètres. Ensuite, enregistrez une image totale toutes les trois secondes. Enregistrez les trois premières minutes dans un tampon de calcium physiologique pour obtenir la base des signaux de fluorescence respectifs.

Une fois qu’une fluorescence de base stable est observée, passez à de l’histamine de 100 micromolaires ou à de l’ATP contenant un tampon de calcium physiologique pour stimuler les cellules pendant trois minutes. Par la suite, revenez au tampon de calcium physiologique sans histamine ni ATP et L-NNA pendant cinq minutes pour éliminer les composés des cellules. Ensuite, administrez du NOC-7 à 10 micromolaires dans le tampon de calcium physiologique pendant deux minutes à l’aide du système de perfusion.

Le donneur d’oxyde nitrique affecte fortement la fluorescence de G-geNOp, et il diminue généralement les cellules de plus de 20 % en réponse à la NOC-7 à 10 micromolaires. Dans les cellules EA.hy926, l’effet NOC-7 est plus fort par rapport à l’extinction de fluorescence G-geNOp induite par les agonistes. Ensuite, lavez le composé libérant de l’oxyde nitrique pendant environ 10 minutes avec le tampon de calcium physiologique et arrêtez l’enregistrement une fois que la fluorescence basale est récupérée.

On voit ici les images représentatives de fluorescence à grand champ des cellules EA.hy926 exprimant G-geNOp qui sont chargées de Fura-2AM. Et ici, voici le déroulement temporel représentatif des enregistrements simultanés des signaux Fura-2 et G-geNOp en réponse à l’histamine de 100 micromolaires. Comme indiqué, l’histamine a été éliminée après trois minutes à l’aide d’un système de perfusion.

Ces courbes représentent les enregistrements simultanés de signaux cytosoliques de calcium et d’oxyde nitrique d’une seule cellule endothéliale chargée de Fura-2AM exprimant transitoirement G-geNOp. Les cellules ont été stimulées avec de l’histamine de 100 micromolaires pendant trois minutes dans un tampon contenant du calcium. Et ici, on voit les signaux représentatifs de calcium et d’oxyde nitrique enregistrés simultanément au fil du temps d’une cellule EA.hy926 qui a été prétraitée avec du L-NNA de 500 micromolaires avant la mesure.

Les cellules ont été traitées avec de l’histamine de 100 micromolaires en présence de calcium de deux millimolaires. Cette figure montre les courbes moyennes représentant les signaux cytosoliques d’oxyde nitrique en réponse à un ATP micromolaire suivi d’une seconde stimulation cellulaire avec de l’ATP de 100 micromolaires. Une fois maîtrisée, cette technique vous permet de visualiser les signaux d’oxyde nitrique en temps réel avec un minimum d’effort.

Je crois que cette technique ouvrira la voie aux chercheurs pour explorer et réétudier les signaux d’oxyde nitrique dans divers modèles cellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’utilisation de la technologie geNOps pour l’imagerie en temps réel de l’oxyde nitrique dans votre système modèle.