Différenciation des cellules souches embryonnaires humaines en progéniteurs neuraux

Commencez avec une plaque multipuits recouverte d’une matrice de membrane basale qui comprend des polymères extracellulaires et des protéines d’adhésion.

Ensemencez les puits avec une suspension unicellulaire de cellules souches embryonnaires humaines dans un milieu de croissance contenant un inhibiteur de la Rho-kinase.

Incuber pour permettre l’attachement des cellules souches à la matrice.

Les cellules absorbent l’inhibiteur, qui bloque les enzymes Rho-kinase et empêche la mort cellulaire apoptotique.

Cela favorise la survie des cellules et les maintient dans un état indifférencié.

Remplacez le milieu de croissance par un milieu d’induction neuronale riche en facteurs de croissance et contenant des inhibiteurs qui ciblent des récepteurs ALK spécifiques.

Ces inhibiteurs interagissent avec leurs récepteurs et bloquent les voies de signalisation BMP et TGF-β, empêchant la différenciation cellulaire en précurseurs endodermiques ou mésodermiques.

Cela conduit à une différenciation sélective des cellules souches en précurseurs ectodermiques.

Ces précurseurs ectodermiques utilisent les nutriments et les facteurs de croissance du milieu pour se multiplier et se différencier plus tard en cellules progénitrices neurales.

Plaquez les cellules sur une plaque à 6 puits recouverte d’une matrice de membrane basale à une densité de 2 x 10⁵ cellules par puits dans 2 millilitres de mTeSR1 avec 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Après 24 heures, remplacez le milieu de culture par un milieu d’induction neurale complété par 1 dorsomorphine micromolaire et 5 SB431542 micromolaires. Changez de milieu tous les deux jours pendant les quatre premiers jours de l’induction neuronale, puis tous les jours, jusqu’à ce que la confluence soit atteinte au septième jour.