Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

L’objectif global de ce protocole est d’effectuer des tests précis d’échantillons de moelle osseuse de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë pour détecter une maladie résiduelle mesurable, y compris la quantification des cellules souches de leucémie. Cette méthode peut fournir une évaluation précise de la maladie résiduelle mesurable dans les échantillons de moelle osseuse de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë. Le principal avantage de cette approche est qu’un suivi attentif du protocole permet d’obtenir des résultats hautement reproductibles et de haute qualité.

Les implications de cette technique s’étendent à la prise de décision clinique, car elle peut être utilisée comme lecture de la réponse des patients au traitement. Jeroen Janssen, hématologue, Gerrit Sijm, technicien du laboratoire d’hématologie diagnostique, Jennifer Scheick et Sander Snel, techniciens de l’équipe MRD, feront la démonstration des procédures. Avec le patient en position de décubitus latéral, marquez la colonne iliaque postérieure supérieure avec un stylo et désinfectez la peau de la zone de biopsie prévue avec 0,5 à 1 % de chlorhexidine dans de l’éthanol dans un mouvement circulaire vers l’extérieur.

Après avoir administré un anesthésique local, prélevez une aiguille de calibre 15 de 2,8 pouces avec l’extrémité proximale dans la paume et l’index contre le côté de la tige métallique de l’aiguille près de la pointe pour le contrôle. En exerçant une pression douce mais ferme, introduisez l’aiguille avec un mouvement de supination alterné rapide à travers la peau anesthésiée vers la colonne iliaque. Lorsque l’aiguille entre en contact avec la colonne iliaque postérieure, retirez la stilette et fixez une seringue vide de 10 millilitres à l’aiguille.

Retirez doucement le piston pour créer une pression négative à l’intérieur de la seringue jusqu’à ce que jusqu’à 10 millilitres de spicules de moelle osseuse aient été prélevés. Ne pas prendre plus de 10 mils de moelle osseuse par aspiration pour éviter l’hémodilution. Retirez la seringue et remettez la stilette sur l’aiguille.

Ensuite, éjectez environ deux millilitres de moelle dans un verre de montre et assurez-vous qu’un échantillon suffisant est prélevé pour être injecté dans un tube de huit millilitres recouvert d’héparine et retournez immédiatement le tube. Pour éviter la coagulation, il est important d’investir le tube contenant l’anticoagulant dès l’ajout de la moelle osseuse. Pour une évaluation morphologique optimale, utilisez une spatule en plastique pour transférer les spicules de l’aspiration dans le verre de la montre sur une lame de verre, et glissez soigneusement une autre lame de verre sur le dessus de la moelle.

Après séchage, colorez les spicules avec May-Grunwald Giemsa pour une analyse par microscopie optique. Placez le tube de moelle osseuse dans un support en plastique et placez le support dans un récipient en plastique avec un sachet de gel à température ambiante et un formulaire de demande rempli. Avant d’analyser la moelle osseuse par cytométrie en flux, démarrez le cytomètre en flux et ouvrez le logiciel d’analyse par cytométrie en flux pour créer une nouvelle expérience avec un graphique à points de diffusion directe par rapport à un graphique à points de diffusion latérale.

Pour évaluer la taille et la granularité des cellules, chargez des cellules sanguines périphériques lysées non marquées provenant d’un donneur sain et sélectionnez la fonction Acquérir des cellules. Gate les lymphocytes et ajustez les tensions de diffusion directe et latérale pour atteindre les valeurs cibles moyennes appropriées pour la population de cellules fermées. Ensuite, acquérez des données pour au moins 10 000 événements.

Pour configurer les tensions du tube photomultiplicateur du canal de fluorescence cible, utilisez d’abord des particules d’étalonnage de perles arc-en-ciel à huit pics selon les instructions du fabricant pour acquérir 10 000 événements à un faible débit. Gate les perles singulet dans le graphique à points de dispersion avant par rapport au graphique à points latéral, suivi d’une porte le 7ème pic dans le graphique à points FITC-PE. Identifiez les populations de billes résultantes pour chaque fluorophore.

Poursuivez l’acquisition de la suspension à huit pointes à billes arc-en-ciel et ajustez et ajustez les tensions PMT dans tous les canaux de fluorescence pour atteindre les valeurs MFI cibles conformément aux instructions du fabricant. Utilisez l’enregistrement pour collecter les données d’environ 2 000 événements et vérifiez l’IMF pour le 7e pic des billes. Ensuite, ajoutez un volume suffisant de chaque anticorps expérimental conjugué au fluorochrome pour colorer les billes dans les tubes fluorescents correspondants moins un témoin et tourbillonner les tubes à fond.

Créez une nouvelle expérience à blanc avec les mêmes paramètres de compensation, en veillant à ce que le seuil de diffusion vers l’avant soit fixé à 5 000 et que les valeurs de compensation de tous les fluorochromes soient nulles. Pour créer les commandes de compensation, sélectionnez la fonction Créer une commande de compensation et chargez le tube de commande non taché. Ajustez la porte P1 autour de la population de billes singulet et vérifiez que la porte P1 ne contient que des billes singulet.

Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la porte P1 et sélectionnez Appliquer à toutes les commandes de compensation. Ensuite, enregistrez les données de tous les tubes de fluorescence marqués individuellement en confirmant que la porte P2 englobe la population positive sur chaque histogramme de florescence. Pour colorer les cellules en vue d’une analyse cytométrique en flux, transportez la moelle osseuse au laboratoire, consultez le formulaire de demande pour vérifier le numéro d’étude du patient et la date de naissance et déterminez ce qui doit être coloré.

Pour la MRD, nous utilisons un panneau de coloration composé de quatre tubes. Ici, nous démontrons la coloration du panneau LSC qui se compose d’un tube. Après la numération cellulaire, transférez le volume approprié de moelle osseuse dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Ajoutez un tampon de lyse à 10 fois le volume cellulaire expérimental pour lyser les globules rouges. Retournez le tube pour mélanger et incubez les cellules pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de la période de lyse, granulez les cellules par centrifugation.

Remettez les cellules en suspension dans 15 millilitres de tampon de lavage à température ambiante et récoltez à nouveau la pastille cellulaire par centrifugation. Pendant ce temps, pipetez la quantité appropriée de solution de cocktail d’anticorps dans des tubes FACS de cinq millilitres. Voici le panneau pour le tube de cellules souches.

Remettez la pastille en suspension dans le tampon de lavage et ajoutez la suspension de la cellule dans le tube FACS contenant la solution cocktail d’anticorps monoclonaux pour une incubation de 15 minutes dans l’obscurité. Ensuite, lavez les cellules dans un tampon de lavage et granulez les cellules par centrifugation. Après centrifugation, remettre le granulé en suspension dans 400 microlitres de tampon de lavage frais.

Pour analyser les cellules souches leucémiques, ajoutez quatre microlitres de billes vierges à la suspension cellulaire colorée avec le cocktail d’anticorps de cellules souches. Ensuite, lisez les échantillons en utilisant les paramètres précédemment définis en acquérant au moins quatre fois 10 à la 6ème occurrence à partir des échantillons de patients expérimentaux. Pour identifier l’immunophénotype associé à la leucémie observé chez environ 90 % des patients atteints de leucémie myéloïde aiguë, il est crucial que les vannes anti-explosion soient correctement réglées, comme illustré.

Ici, des exemples de données provenant de patients individuels présentant différents types d’aberrance sur les cellules primitives CD34-positives sont présentés. Dans ces graphiques, on peut observer un patient qui reste en rémission complète et un patient qui a rechuté après avoir eu des résultats positifs résiduels mesurables de la maladie après le deuxième cycle de traitement d’induction, ce qui souligne la nécessité d’un réglage précis de la porte avant l’analyse de l’échantillon. L’identification et la quantification de la LSC nécessitent une analyse supplémentaire des aberrances, en particulier sur les cellules blastiques CD34-positives CD38-négatives, comme le montrent ces graphiques.

Lors de l’exécution de ce protocole, il est très important d’avoir du personnel spécialisé et de secours pour le prélèvement de moelle osseuse, le transport, les travaux expérimentaux et les étapes d’analyse de cette procédure. Cette procédure peut également être utilisée pour effectuer des analyses cytogénétiques et moléculaires afin de répondre à des questions supplémentaires sur la corrélation entre des populations cellulaires spécifiques et des aberrances moléculaires d’intérêt, ou pour affiner le groupe de risque d’un patient afin de prédire les résultats cliniques. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’hématologie pour explorer la maladie résiduelle chez les patients atteints de LMA après le traitement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment nous identifions et quantifions avec précision la maladie résiduelle en utilisant la cytométrie en flux, y compris la collecte et le transport d’échantillons de moelle osseuse de patients atteints de LMA.