ADN coloration méthode basée sur la précipitation de Formazan induite par l’exposition à la lumière bleue

Le protocole de coloration de l’ADN comporte trois étapes générales. La première consiste à mettre le gel dans une solution de SYBR Green I et de nitro blue tetrazolium, également connu sous le nom de NBT. Le gel est ensuite agité pendant 25 minutes s’il s’agit d’un gel de polyacrylamide et une heure s’il s’agit d’un gel d’agarose.

La dernière étape consiste à exposer le gel à une source de lumière bleue telle que des LED bleues ou la lumière du soleil. Au cours de cette étape, des bandes de précipités apparaissent. Ces bandes ont une corrélation directe avec la concentration d’ADN et le gel peut ensuite être numérisé dans un scanner de bureau afin de quantifier l’ADN.

Pour le gel de polyacrylamide, un gel de polyacrylamide non dénaturant est préparé. Le gel est ensuite chargé avec les échantillons et le processus d’électrophorèse commence. SYBR Green I est dilué à 1,2X et les solutions millimolaires NBT 20 sont maintenant préparées.

Le gel est placé dans un récipient en plastique et 16,75 mils de SYBR Green I dilué et 325 mils de NBT à 20 millimolaires sont ajoutés. Ensuite, le récipient est recouvert de Parafilm et de papier d’aluminium et agité à 60 tr/min pendant 25 minutes. Enfin, la feuille d’aluminium et un Parafilm sont retirés et le gel est exposé à la lumière du soleil ou à une source de lumière bleue.

Pour la quantification de bande et les courbes d’étalonnage, le gel est placé dans un scanner de bureau, puis l’image est analysée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Enfin, une greffe de signal normalisé par rapport à la concentration est faite. Un gel d’agarose est fabriqué.

Les puits sont chargés d’un plasmide résistant à l’ampicilline et le gel est coupé en deux morceaux, chacun étant coloré d’une coloration différente. Ensuite, la bande plasmidique est extraite et transformée par transformation chimique en cellules compétentes avec un milieu contenant de l’ampicilline. Un gel d’agarose à 1 % est préparé dans un tampon TAE 1X et chargé de quatre microlitres de plasmide à environ 100 nanogrammes par microlitre.

Le gel dans la chambre d’électrophorèse est ensuite fait fonctionner à 100 volts pendant une heure. La moitié du gel est colorée avec les méthodes SYBR Green I et NBT et l’autre moitié avec la méthode UV SYBR Green I. Pour le gel d’agarose, la méthode SYBR Green I NBT est réalisée à l’aide de SBYR Green I à une concentration de 1,2X et de NBT à 2 millimolaires.

Le gel est placé dans un récipient en plastique et le volume de la solution est mis à l’échelle pour couvrir le gel et le temps d’agitation est prolongé à une heure. Pour les gels d’agarose, la méthode SYBR Green I couramment utilisée consiste à recouvrir le gel d’une solution 1X SYBR Green I et à agiter pendant une heure. Ensuite, le gel est exposé à un transilluminateur UV pour la visualisation de la bande pendant deux minutes.

Une fois le gel coloré, la bande plasmidique est coupée à l’aide d’un scalpel et le plasmide extrait à l’aide d’un kit d’extraction commercial. L’ADN est normalisé à 9,1 nanogrammes par microlitre pour transformer les bactéries Escherichia coli XL 10 compétentes en produits chimiques. Enfin, les colonies sont comptées.

Les unités formant colonies sont calculées. Le résultat est greffé et les résultats obtenus avec SYBR Green I NBT et SYBR Green I UV sont comparés. Un précipité de formazan violet apparaît à l’endroit où se trouve l’ADN.

Dans l’expérience, une échelle d’ADN a été chargée pour faire une courbe d’étalonnage avec une limite de détection de 192 picogrammes à 1 500 paires de bases. L’utilisation de gels d’agarose permet la récupération de l’échantillon à l’aide d’un kit disponible dans le commerce et n’interfère pas avec l’extraction. Une certaine récupération à l’aide de cette méthode avec une LED bleue permet d’obtenir une meilleure qualité par rapport au SYBR Green I utilisant un transilluminateur.