ADN coloration méthode basée sur la précipitation de Formazan induite par l’exposition à la lumière bleue
28 janvier 2018
Cette méthode permet la coloration sélective et quantification de l’ADN en gels en trempant le gel dans un SYBR Green I / Nitro tétrazolium bleu solution et puis exposer au soleil ou une source de lumière bleue. Cela produit un précipité visible et ne nécessite presque aucun équipement, ce qui est idéal pour utilisation sur le terrain.
Le protocole de coloration de l’ADN comporte trois étapes générales. La première consiste à mettre le gel dans une solution de SYBR Green I et de nitro blue tetrazolium, également connu sous le nom de NBT. Le gel est ensuite agité pendant 25 minutes s’il s’agit d’un gel de polyacrylamide et une heure s’il s’agit d’un gel d’agarose.
La dernière étape consiste à exposer le gel à une source de lumière bleue telle que des LED bleues ou la lumière du soleil. Au cours de cette étape, des bandes de précipités apparaissent. Ces bandes ont une corrélation directe avec la concentration d’ADN et le gel peut ensuite être numérisé dans un scanner de bureau afin de quantifier l’ADN.
Pour le gel de polyacrylamide, un gel de polyacrylamide non dénaturant est préparé. Le gel est ensuite chargé avec les échantillons et le processus d’électrophorèse commence. SYBR Green I est dilué à 1,2X et les solutions millimolaires NBT 20 sont maintenant préparées.
Le gel est placé dans un récipient en plastique et 16,75 mils de SYBR Green I dilué et 325 mils de NBT à 20 millimolaires sont ajoutés. Ensuite, le récipient est recouvert de Parafilm et de papier d’aluminium et agité à 60 tr/min pendant 25 minutes. Enfin, la feuille d’aluminium et un Parafilm sont retirés et le gel est exposé à la lumière du soleil ou à une source de lumière bleue.
Pour la quantification de bande et les courbes d’étalonnage, le gel est placé dans un scanner de bureau, puis l’image est analysée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Enfin, une greffe de signal normalisé par rapport à la concentration est faite. Un gel d’agarose est fabriqué.
Les puits sont chargés d’un plasmide résistant à l’ampicilline et le gel est coupé en deux morceaux, chacun étant coloré d’une coloration différente. Ensuite, la bande plasmidique est extraite et transformée par transformation chimique en cellules compétentes avec un milieu contenant de l’ampicilline. Un gel d’agarose à 1 % est préparé dans un tampon TAE 1X et chargé de quatre microlitres de plasmide à environ 100 nanogrammes par microlitre.
Le gel dans la chambre d’électrophorèse est ensuite fait fonctionner à 100 volts pendant une heure. La moitié du gel est colorée avec les méthodes SYBR Green I et NBT et l’autre moitié avec la méthode UV SYBR Green I. Pour le gel d’agarose, la méthode SYBR Green I NBT est réalisée à l’aide de SBYR Green I à une concentration de 1,2X et de NBT à 2 millimolaires.
Le gel est placé dans un récipient en plastique et le volume de la solution est mis à l’échelle pour couvrir le gel et le temps d’agitation est prolongé à une heure. Pour les gels d’agarose, la méthode SYBR Green I couramment utilisée consiste à recouvrir le gel d’une solution 1X SYBR Green I et à agiter pendant une heure. Ensuite, le gel est exposé à un transilluminateur UV pour la visualisation de la bande pendant deux minutes.
Une fois le gel coloré, la bande plasmidique est coupée à l’aide d’un scalpel et le plasmide extrait à l’aide d’un kit d’extraction commercial. L’ADN est normalisé à 9,1 nanogrammes par microlitre pour transformer les bactéries Escherichia coli XL 10 compétentes en produits chimiques. Enfin, les colonies sont comptées.
Les unités formant colonies sont calculées. Le résultat est greffé et les résultats obtenus avec SYBR Green I NBT et SYBR Green I UV sont comparés. Un précipité de formazan violet apparaît à l’endroit où se trouve l’ADN.
Dans l’expérience, une échelle d’ADN a été chargée pour faire une courbe d’étalonnage avec une limite de détection de 192 picogrammes à 1 500 paires de bases. L’utilisation de gels d’agarose permet la récupération de l’échantillon à l’aide d’un kit disponible dans le commerce et n’interfère pas avec l’extraction. Une certaine récupération à l’aide de cette méthode avec une LED bleue permet d’obtenir une meilleure qualité par rapport au SYBR Green I utilisant un transilluminateur.
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Aperçu
Cette méthode permet la coloration sélective et la quantification de l'ADN dans des gels à l'aide d'une solution de vert SYBR I et de tétrazolium bleu nitreux. Le processus nécessite un équipement minimal, ce qui le rend adapté aux applications sur le terrain.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Biologie moléculaire
- Applications sur le terrain
Contexte
- La quantification de l'ADN est essentielle pour diverses études biologiques.
- Les méthodes traditionnelles nécessitent souvent des équipements complexes.
- Cette méthode simplifie considérablement le processus.
- Utilise des réactifs courants pour des résultats efficaces.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode simple pour la coloration de l'ADN.
- Permettre la quantification de l'ADN dans différents types de gel.
- Faciliter les travaux sur le terrain avec un équipement minimal.
Méthodes utilisées
- Imprégner le gel d'une solution de SYBR Green I et de NBT.
- Agiter le gel pendant 25 minutes (polyacrylamide) ou 1 heure (agarose).
- Exposer le gel à une source de lumière bleue ou à la lumière solaire.
- Numériser le gel pour la quantification de l'ADN.
Résultats principaux
- Les bandes de précipité visibles corrépondent à la concentration en ADN.
- Une coloration efficace est obtenue avec un équipement minimal.
- Les résultats peuvent être quantifiés à l'aide de scanners de bureau standards.
- La méthode démontre une fiabilité dans des conditions de terrain.
Conclusions
- La méthode offre une approche pratique de la quantification de l'ADN.
- Elle convient à divers types de gels et à des applications sur le terrain.
- Améliore l'accessibilité pour les chercheurs situés dans des régions éloignées.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans le secteur industriel
Cette méthode de coloration de l'ADN permet la visualisation directe et la quantification des acides nucléiques sans équipement spécialisé, soutenant ainsi une validation rapide des cibles dans des environnements à ressources limitées. En éliminant la dépendance aux transilluminateurs UV, elle réduit les risques pour la sécurité et la complexité opérationnelle dans les flux de travail de découverte précoce. L'approche renforce la fiabilité prédictive grâce à une corrélation reproductible entre le signal du colorant et la concentration en ADN, facilitant les décisions d'orientation (go/no-go) dans les filières d'identification de composés candidats.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet la vérification d'hypothèses grâce à la corrélation directe entre l'intensité du précipité de formazan et la concentration en ADN, soutenant ainsi l'évaluation de l'interaction avec la cible.
- Valeur opérationnelle : Utilise un mélange à température ambiante et une exposition à la lumière bleue, évitant ainsi les protocoles utilisant des rayonnements UV dangereux et les équipements d'imagerie spécialisés.
- Valeur prédictive : Fournit une sortie quantitative compatible avec des scanners de bureau, permettant une comparaison rapide des rendements en acides nucléiques entre différentes conditions expérimentales.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi pour les tests : Génère des bandes de précipité stables et visibles qui servent de lectures normalisées pour les formats de criblage haut débit des acides nucléiques.
- Reproductibilité : Des durées de mélange définies (25 min pour le polyacrylamide, 60 min pour l’agarose) et des concentrations de réactifs ajustables garantissent une production de signal cohérente d’un lot à l’autre.
- Compatibilité avec les plateformes existantes : Fonctionne avec les gels d’agarose et de polyacrylamide, permettant une intégration transparente dans les protocoles d’électrophorèse existants pour l’analyse de variants ou de plasmides.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet la récupération de plasmides fonctionnels après coloration, comme en témoigne un nombre plus élevé d'unités formant des colonies par rapport aux méthodes basées sur les UV, ce qui permet une validation fonctionnelle en aval.
- Dérisquage mécanistique : Évite les dommages de l'ADN induits par les UV, préservant ainsi l'intégrité de l'échantillon pour une corrélation précise génotype-phénotype dans les tests de dépistage phénotypique.
- Utilité préclinique : Permet une quantification sur le terrain des constructions d'expression génique ou des titres viraux dans des modèles précliniques, sans nécessiter d'infrastructure de laboratoire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, de l'extraction des acides nucléiques à la validation des tests fonctionnels, notamment dans les contextes où l'accès à l'équipement est limité ou où une itération rapide est nécessaire.
- Biologie de la découverte : Soutient la validation des cibles en fournissant des signaux d'ADN quantifiables corrélés à l'efficacité transcriptionnelle ou d'édition dans les études de modulation de voies.
- Écrans : Permet une quantification standardisée des acides nucléiques pour la confirmation des « hits » dans des bibliothèques CRISPR ou d'overexpression, améliorant ainsi la reproductibilité des tests.
- Analytique : Génère des courbes linéaires signal-concentration par imagerie à l’aide d’un scanner de bureau, facilitant la normalisation des données dans des formats multi-puits ou basés sur gel.
- Recherche translationnelle : Facilite la récupération d’acides nucléiques intacts pour des tests fonctionnels in vitro, assurant ainsi un lien entre la découverte et les essais précliniques d’efficacité.
- Réutilisation en entreprise : Nécessite uniquement du SYBR Green I, du NBT et une source de lumière bleue, ce qui en fait un module peu coûteux et réutilisable au sein de plusieurs équipes projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en évitant les artéfacts induits par les UV, améliorant ainsi la fiabilité des données dans les tests de validation ciblée.
- Valeur opérationnelle : Supprime le besoin de chambres noires ou de transilluminateurs, augmentant le débit et réduisant les goulots d'étranglement dans les plateformes partagées.
- Valeur stratégique : Diminue les dépenses en capital pour la quantification des acides nucléiques, permettant des tests décentralisés dans des laboratoires satellites ou des sites collaboratifs.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une progression ajustée au risque en fournissant une confirmation précoce, indépendante de tout équipement, du rendement des constructions avant d'investir dans la purification en aval.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une formation de base en biologie moléculaire pour la préparation des gels et l'électrophorèse.
- Exige un accès à une source de lumière bleue (par exemple, LED à 470 nm) ou à la lumière solaire, ainsi qu'à un équipement standard de laboratoire pour l'agitation.
- Implique des durées de coloration et des concentrations de réactifs normalisées afin d'assurer la reproductibilité entre laboratoires.
- Peut nécessiter une optimisation pour des formats à haut débit en raison des étapes de manipulation manuelle des gels.
- Limité à la détection des acides nucléiques ; n'est pas applicable aux dosages de protéines ou de petites molécules sans adaptation.
