Name: ADN coloration méthode basée sur la précipitation de Formazan induite par l’exposition à la lumière bleue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Découvrez une méthode de coloration de l'ADN dans les gels utilisant SYBR Green I et NBT avec exposition à la lumière bleue. Cette technique simple permet une quantification fiable sur le terrain avec un équipement minimal.

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Ce travail a été soutenu par Fondo Nacional de Desarrollo y Científico Tecnológico (Fondecyt), Chili, 11130263 de projet (à la CW), projet CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (pour CW) et U-inicia depuis le Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (à CW).
Merci à Tatiana Naranjo-Palma de Majorque pour l’aider dans la phase initiale de ce projet, le Dr Jorge Babul et Diego Quiroga-Roger de discussion utile, Robert Lesch pour réviser le manuscrit et la Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de Universidad de Chile. Merci aussi à Pérez de Marcelo pour éditer la vidéo et Neil Stevens pour corriger le texte et Errol Watson pour la fourniture de la voix-off.

1. préparation et exécution du Gel
<ol><li>Préparer les gels de polyacrylamide gel de 12 % non-dénaturisation à l’aide de la recette de Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel électrophorèse (SDS-PAGE) trouvé dans Sambrook et Russell14 mais avec de l’eau au lieu de SDS.<ol>
<li>Pour préparer 5 mL de solution de gel, utiliser 1,7 mL d’eau distillée, 2 mL d’acrylamide/bis acrylamide (30/0,8 % m/v), 1,3 mL de 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL de persulfate d’ammonium 10 % et 0,002 mL de TEMED.</li>
		<li>Pour préparer 2 mL de gel de concentration utiliser 1,5 mL d’eau, 0,33 mL d’acrylamide/bis acrylamide (30/0,8 % m/v), 0,25 mL de 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL de persulfate d’ammonium 10 % et 0,002 mL de TEMED. Les dimensions du gel sont 7,3 cm x 8,2 cm x 0.075 cm (l x l x p). Remarque : Utilisez un peigne bien 15 de 0,75 mm d’épaisseur pour la meilleure sensibilité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verser les quantités appropriées de 6 x chargement mémoire tampon et l’échantillon d’ADN d’un tube de microtubes de 1,5 mL (par ex. utilisation 1 µL de tampon de charge 6 x à 5 µL de l’échantillon d’ADN).</li>
	<li>Placer le gel dans la chambre d’électrophorèse verticale.<ol>
<li>Remplir la chambre avec 750 mL de tampon de x TAE 1 pour exécuter 2 gels. Pour préparer 1 L de 50 x TAE, utilisez 442 g de base Tris, 57,1 mL d’acide acétique glacial et 100 mL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajouter de l’eau distillée pour un volume final de 1 L.</li>
		<li>Charger les échantillons dans le gel. Exécutez le gel à 100 V pendant 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vous pouvez également préparer un gel d’agarose 1 x TAE à l’aide de la recette trouvée dans Sambrook14.<ol>
<li>Ajouter 300 mL de 1 x TAE à la chambre d’électrophorèse horizontale. Exécutez le gel pendant 45 min à 100 V.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NBT-SG j’ai coloration (Figure 1).
<ol><li>
L’acrylamide Gel de coloration.
	<ol>
<li>Préparer les solutions : 0,1 % p/v NBT et 1,2 x SG j’ai. Remarque : Il est possible d’utiliser du bromure d’éthidium, GelRed et SYBR Gold au lieu de SG j’ai, mais SG j’ai eu les meilleures performances.</li>
		<li>Verser 16,75 mL de 1,2 x SYBR vert I solution dans un récipient de taille appropriée. Remarque : Nous avons utilisé le couvercle d’une boîte de pointe de pipette en tant que conteneur, et ces volumes sont calculés pour couvrir le gel à l’aide de ce conteneur ; ses dimensions sont de 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (l x l x p).</li>
		<li>Placer le gel dans la solution. Ajouter 3,25 mL de solution à 0,1 % p/v NBT pour donner 0,2 mM NBT et 1 x (équivalent à 2,0 µM) SG j’ai concentrations finales.</li>
		<li>Fermer le récipient avec un film plastique et enrouler complètement le récipient avec du papier aluminium pour bloquer toute lumière ambiante. Remarque : Le film plastique est utilisé pour éviter les éclaboussures et pour éviter une réaction de la feuille d’aluminium avec la solution colorante.</li>
		<li>Agiter pendant 25 min dans un agitateur orbital à 60 tr/min.</li>
		<li>Enlever en aluminium et en plastique. Exposer au soleil pendant 90 min maximum. Vérifiez toutes les 5 min jusqu'à ce que la bande d’intérêt s’affiche.</li>
		<li>Pour utiliser la lumière bleue, préparer une protoboard avec 3 Diodes électroluminescentes (LED) et placer les LEDs 5 mm environ de la surface du gel (cocher la coloration en continu, comme le temps nécessaire dépend de l’intensité de la source lumineuse de LED).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gel d’agarose souillant.
	<ol>
<li>Après préparation et en cours d’exécution une agarose à 1 % gel comme décrit dans les sections 1.4 (les dimensions sont de 1 cm x 6,2 cm x 7 cm ; l x l x p), suivez les mêmes étapes que dans 2.1 avec ces modifications :</li>
		<li>Verser 41,9 mL de 1,2 x SG j’ai la solution dans le couvercle d’une boîte de pointe de pipette ; ses dimensions sont de 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (l x l x p). Ajouter 8,1 mL de solution à 0,1 % NBT.</li>
		<li>Fermer le récipient avec un film plastique et puis complètement envelopper le contenant avec du papier aluminium pour bloquer toute lumière ambiante.</li>
		<li>Agiter pendant 1 h dans un agitateur orbital à 60 tr/min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analyse.
<ol><li>
NBT-SG j’ai des courbes d’étalonnage.
	<ol>
<li>Obtenir des images de gel par balayage à 1200 dpi.</li>
		<li>Logiciels pour l’analyse de l’image. Redresser les images à l’aide d’un éditeur d’image. Exécutez une densitométrie d’image.</li>
		<li>Calculer l’aire sous la courbe. Préparer un graphique du Signal/SignalMax contre la concentration de l’ADN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ADN récupération.
<ol><li>Préparer un gel d’agarose de 1 % à 1 x TAE à l’aide de la recette trouvée dans Sambrook14.</li>
	<li>Ajouter 300 mL de 1 x TAE à la chambre d’électrophorèse horizontale. Charger 4 µL de 100 plasmide de15 ng/µL pDJ100 et échelle d’ADN suivant le schéma donné à la Figure 2. Exécutez le gel pendant 1 h à 100 V.</li>
	<li>Marquer et peser les deux tubes de microcentrifuge de 2 mL.</li>
	<li>Coupent le gel par le milieu afin d’avoir les deux moitiés identiques. Chacun d’eux doit contenir l’échelle et le plasmide d’échantillon pour comparer les différentes techniques de coloration. Une représentation schématique est à la Figure 2.</li>
	<li>Colorer une moitié avec NBT-SG j’ai comme dans l’étape 2.<ol>
<li>Découpez la bande de plasmide à l’aide d’un scalpel propre. Enregistrer le morceau de gel dans un tube et peser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tache de l’autre partie du gel avec SG j’ai avec 50 mL de 1 x SG j’ai solution et lentement agiter (60 t/mn) le gel pendant 1 h dans l’obscurité.<ol>
<li>Placer le gel sur une courte longueur d’onde et exposer pendant 2 min. coupe sur la bande de plasmide à l’aide d’un scalpel propre.</li>
		<li>Enregistrer le morceau de gel dans l’autre tube et peser. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici tout en gardant les tubes à-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procéder à l’extraction de plasmide utilisant un commercial gel extraction kit.</li>
</ol>5. plasmide normalisation.
<ol><li>Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 10 µL de l’extrait plasmide et 60 µL d’eau de type I. Mélanger et transférer dans une cuvette de quartz 60 µL ou utiliser 2 µL directement dans un Nanodrop.</li>
	<li>Mesurer les spectres d’absorption entre 230 à 320 nm. Calculer la concentration de plasmide de l’échantillon à l’aide de la formule suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq1v3.jpg"> où D est le facteur de dilution (dans ce cas, c’est 70/10), Ax est l’absorption à x nm et 50 est le facteur de conversion en µg/mL pour le dsDNA.</li>
	<li>Diluer les échantillons à 9,1 ng/µL.</li>
	<li>Transformer des cellules capables d' Escherichia coli (e. coli) (p. ex. XL10 or) suivant la Inoue transformation procédure16 avec 5 µL de l’échantillon dilué.</li>
	<li>Compter le nombre de colonies sur les boîtes de Pétri et notez la dilution. Calculer les unités formant colonie (UFC) avec la formule suivante17: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq2v2.jpg"> où D est le facteur de dilution appliqué de la culture initiale.</li>
	<li>Effectuer un test t non apparié.</li>
</ol>

<ol><li>LePecq, J. B., Paoletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+complex+between+ethidium+bromide+and+nucleic+acids%3A+physical-chemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization.</a> J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).</li>
<li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella%2Fmammalian+microsome+reverse+mutation+assay+%28Ames+test%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).</li>
<li>Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYBR+Green-I%3A+a+new+fluorescent+dye+optimized+for+detection+picogram+amounts+of+DNA+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels.</a> Biophys. J. 66 (A150), (1994).</li>
<li>Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+agarose+gels+stained+with+methylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue.</a> Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).</li>
<li>Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterion-dye+staining+method+for+DNA+in+agarose+gels+using+crystal+violet+and+methyl+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange.</a> Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).</li>
<li>Yang, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+using+a+visible+dye%2C+Nile+blue%2C+in+electrophoresed+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels.</a> Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).</li>
<li>Santillán-Torres, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+stain+for+DNA+in+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel stain for DNA in agarose gels.</a> Trends Genet. 9 (2), 40(1993).</li>
<li>Adkins, S., Burmeister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+in+agarose+gels+as+migrating+colored+bands%3A+applications+for+preparative+gels+and+educational+demonstrations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations.</a> Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).</li>
<li>Cong, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visible+dye-based+staining+method+for+DNA+in+polyacrylamide+gels+by+ethyl+violet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet.</a> Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).</li>
<li>Altman, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+salts+and+formazans%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium salts and formazans.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).</li>
<li>Nineham, A. W. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr50002a004">The chemistry of formazans and tetrazolium salts.</a> Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).</li>
<li>Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+imidazole-%2C+imidazolium%2C+and+tetrazolium-containing+compounds+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).</li>
<li>Paredes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+visible+and+selective+DNA+staining+method+in+gels+with+tetrazolium+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts.</a> Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a Laboratory Manual</a>. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3009026">In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor.</a> Cell. 45 (3), 397-406 (1986).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+M+%22Brock+biology+of+microorganisms%22">Brock biology of microorganisms</a>. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un sensible et un roman basé sur l’ADN, méthode de coloration sur la réduction de NBT et l’utilisation de SG j’ai présenté dans cet article. L’étape critique dans le présent protocole est le temps d’incubation du gel dans le NBT-SG j’ai solution et la concentration de NBT. Le temps de coloration pour les gels d’agarose est plus long que pour les gels d’acrylamide en raison de la plus grande épaisseur de gels d’agarose. Cette méthode ne fonctionne pas bien en présence de SDS comme NBT précipite en contact avec elle. Si le...

Avec les progrès de la biochimie et de biologie moléculaire, les études portant sur l’ADN ont exigé des meilleures techniques pour analyser l’ADN. La première méthode pour la coloration de l’ADN a été de coloration, qui est très sensible mais manque de sélectivité à l’argent et ne permet pas la récupération de l’échantillon. Plus tard, le développement de coloration fluorescente d’ADN a permis la quantification sélective de l’ADN avec la possibilité de récupération de l’échantillon. L’un des colorants fluorescents premières utilisées pour la quantification de l’ADN de bromure d’éthidium1, ce qui est mutagène2. Cependant, maintenant il y a des colorants fluorescents améliorés plus sécuritaires et plus sensibles, tels que GelRed et SYBR Green I (SG je)3; mais tous ces colorants fluorescents nécessitent l’utilisation d’un Transilluminateur UV de (UV) ou d’un fluorimètre.
Il existe des autres techniques de coloration visiblement ADN, tels que le bleu de méthylène4 et cristal violet5,6,7,8,9, mais tous d'entre eux souffrent de sensibilité réduite et sélectivité. Les sels de tétrazolium sont sensibles à la réduction des composés organiques et lorsque cela se produit, ils forment un insoluble et coloré de formazan précipiter10,11. Récemment, certains sels de tétrazolium bivalents ont démontré à lier à l’ADN en raison de leurs anneaux de tétrazolium positive12.
Dans une récente publication13a proposé une nouvelle technique visible pour souiller et de quantifier l’ADN en gels de polyacrylamide, en utilisant la réduction d’un sel de tétrazolium bivalent appelé nitrobleu de tétrazolium (NBT) et des colorants fluorescents comme le bromure d’éthidium, GelRed, SYBR Green I et SYBR Gold. Cette réaction a travaillé en présence de lumière bleue ou la lumière du soleil et a permis la récupération de l’échantillon en améliorant la qualité par rapport à l’usage du SG j’ai avec un Transilluminateur UV. L’objectif du présent document est de fournir un protocole détaillé de la technique de coloration à l’aide de tétrazolium sels.

<table><tbody><tr><td>Nitro blue tétrazolium</td><td>Gold Biotechnology</td><td>298-83-9</td><td>réactif utilisé dans la coloration</td></tr><tr><td>SYBR Green I 10000X</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S7563</td><td>réactif utilisé dans la coloration</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>utilisé pour extraire le plasmide du gel dans le test d’intégrité</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM 1331</td><td>utilisé pour faire des courbes d’étalonnage et comme référence pour couper la bande dans le test d’intégrité</td></tr><tr><td>Agar Agar Merck</td><td></td><td></td><td>utilisé pour fabriquer des plaques de culture LB-ampicilline&nbsp ;</td></tr><tr><td>chlorure de sodium</td><td>Merck</td><td>1064045000</td><td>utilisé pour fabriquer des plaques de culture de LB-ampicilline.</td></tr><tr><td>extrait de levure</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>utilisé pour fabriquer des plaques de culture d’ampicilline LB&nbsp ;</td></tr><tr><td>peptone</td><td>Merck</td><td>72161000</td><td>utilisé pour fabriquer des plaques de culture d’ampicilline LB&nbsp ;</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>761</td><td>utilisé pour fabriquer des gels de polyacrylamide</td></tr><tr><td>persulfate d’ammonium</td><td>Calbiochem</td><td>2310</td><td>utilisé pour fabriquer des gels de polyacrylamide</td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>invitrogen</td><td>15512-023</td><td>utilisé pour fabriquer des gels de polyacrylamide bisacrylamide</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA</td><td>146072</td><td>utilisé pour fabriquer des gels de polyacrylamide</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Merck</td><td>1083821000</td><td>utilisé pour fabriquer un tampon TAE et un tampon tris-HCl de gel de polyacrylamide non dénaturant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td>utilisé pour fabriquer un tampon TAE</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Merck</td><td>1 000 632 500</td><td>utilisé pour fabriquer un tampon TAE</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Merck</td><td>16802</td><td>utilisé pour fabriquer</td></tr> un <tr><td>spectrophotomètre</td> tampon TAE <td>Tecan</td><td>infinite 200 pro</td><td>utilisé pour quantifier le plasmide</td></tr> <tr><td>d’ADNunité de purification d’eau</td><td>Merck</td><td>Elix 100</td><td>utilisée pour fabriquer de l’eau de type 1 (ASTM) utilisée en spectrophotométrie et en dilutions</td></tr> <tr><td>d’ADN° eau</td><td></td><td></td> distillée <td>utilisée dans les gels, les milieux de culture, les colorations et les solutions générales</td></tr><tr><td>HCl</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-03</td><td>utilisé pour fabriquer un tampon tris-HCl de gel de polyacrylamide non dénaturant</td></tr><tr><td>Colorant de chargement d’ADN 6X Thermo-Fisher</td><td></td><td>R0610</td><td></td></tr><tr>Source lumineuse LED <td>bleue de 5 mm</td><td>Jinyuan electronics</td><td>SP-021</td><td>utilisée dans le protoboard de test d’intégrité</td></tr><tr><td></td><td>Support de source lumineuse et circuit</td> <td>KANDH</td><td>KH102</td>&nbsp ;</tr><tr><td>Pile 9 V</td><td>Duracell-utilisée</td><td></td> <td>pour alimenter la</td></tr><tr><td>chambre d’électrophorèse horizontale</td> de la LED <td>Biorad</td><td>1704486EDU</td><td>utilisée pour fabriquer et exécuter du gel d’agarose en essai d’intégrité,</td></tr><tr><td>kit d’électrophorèse verticale</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU,</td><td>utilisé pour faire fonctionner des gels de polyacrylamide dans les courbes d’étalonnage,</td></tr><tr><td>alimentation</td>, <td>Biorad</td><td>1645050&nbsp ;</td><td>utilisé pour alimenter l’électrophorèse</td></tr></tbody></table>

adn coloration méthode basée sur la précipitation de formazan induite par l’exposition à la lumière bleue

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

Méthodes de coloration de l’ADN sont très importants pour la recherche biomédicale. Nous avons conçu une méthode simple qui permet la visualisation de l’ADN à le œil nu par la formation d’un précipité de couleur. Il fonctionne en trempant l’acrylamide ou de gel agarose de l’ADN dans une solution de 1 x (équivalent à 2,0 µM) SYBR Green I (SG j’ai) et 0,20 mM nitrobleu de tétrazolium qui produit un violet précipiter de formazan lorsqu’ils sont exposés aux rayons du soleil ou plus précisément la lumière bleue. Aussi, récupération des tests ADN ont été effectuées en utilisant un plasmide ampicillin résistant dans un gel teinté avec notre méthode. Un plus grand nombre de colonies a été obtenu avec notre méthode qu’avec la traditionnelle coloration à l’aide de SG j’ai avec éclairage ultraviolet. La méthode décrite est rapide, précis et non toxique pour la détection de l’ADN, ce qui permet la visualisation des biomolécules à « l’oeil nu » sans un Transilluminateur et est peu coûteux et approprié pour l’utilisation sur le terrain. Pour ces raisons, notre ADN nouvelle coloration méthode a ses avantages potentiels pour la recherche et l’industrie.

Un précipité de formazan violets s’affiche où se trouve l’ADN (vérifié par spectrométrie de masse à13). Dans l’expérience, une échelle d’ADN a été chargée pour faire une courbe d’étalonnage (Figure 3). Le protocole fonctionne pour les gels d’acrylamide et de gel d’agarose, mais il a une plus faible intensité et prend plus de temps dans l’agarose. Cependant, l’utilisation de gels d’agarose permet la récupération de l’échantillon à l’aid...

Cette méthode permet la coloration sélective et quantification de l’ADN en gels en trempant le gel dans un SYBR Green I / Nitro tétrazolium bleu solution et puis exposer au soleil ou une source de lumière bleue. Cela produit un précipité visible et ne nécessite presque aucun équipement, ce qui est idéal pour utilisation sur le terrain.

ADN coloration méthode basée sur la précipitation de Formazan induite par l’exposition à la lumière bleue

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Le protocole de coloration de l’ADN comporte trois étapes générales. La première consiste à mettre le gel dans une solution de SYBR Green I et de nitro blue tetrazolium, également connu sous le nom de NBT. Le gel est ensuite agité pendant 25 minutes s’il s’agit d’un gel de polyacrylamide et une heure s’il s’agit d’un gel d’agarose.La dernière étape consiste à exposer le gel à une source de lumière bleue telle que des LED bleues ou la lumière du soleil. Au cours de cette étape, des bandes de précipités apparaissent. Ces bandes ont une corrélation directe avec la concentration d’ADN et le gel peut ensuite être numérisé dans un scanner de bureau afin de quantifier l’ADN.Pour le gel de polyacrylamide, un gel de polyacrylamide non dénaturant est préparé. Le gel est ensuite chargé avec les échantillons et le processus d’électrophorèse commence. SYBR Green I est dilué à 1,2X et les solutions millimolaires NBT 20 sont maintenant préparées.Le gel est placé dans un récipient en plastique et 16,75 mils de SYBR Green I dilué et 325 mils de NBT à 20 millimolaires sont ajoutés. Ensuite, le récipient est recouvert de Parafilm et de papier d’aluminium et agité à 60 tr/min pendant 25 minutes. Enfin

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Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Ici, nous présentons une méthode simple pour effectuer une hybridation in situ de l’ADN en fluorescence (DNA ISH) pour visualiser des séquences hétérochromatiques répétitives sur des chromosomes montés sur lame. La méthode nécessite un minimum de réactifs et elle est polyvalente pour une utilisation avec des sondes courtes ou longues, différents tissus et la détection avec des signaux basés sur la fluorescence ou non.

Méthode simple pour l&#39;ADN fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation des chromosomes écrasé

Nous décrivons un montage entier hybridation in situ (MC-WISH) procédure chromogène multi-cible dans embryons de drosophile intactes permettant la détection simultanée et spécifique de trois modes de distribution de l'ARNm différents en comparant précipités de couleur.

Multi-cible chromogénique totalité montage<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation pour la comparaison des gènes domaines d&#39;expression dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Comprendre la fonction des processus essentiels chez les bactéries est difficile. Microscopie à fluorescence avec des colorants spécifiques à la cible peut éclairer clé dans la progression de la croissance et cycle cellulaire des cellules microbiennes. Ici, Agrobacterium tumefaciens est utilisé comme une bactérie modèle pour mettre en évidence les méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour la caractérisation des processus essentiels.

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Nous présentons ici un protocole pour utiliser thiazole orange pour la détection de l’ADN dans les expériences d’électrophorèse de gel. L’utilisation d’orange thiazole permet d’éliminer le bromure d’éthidium, et la détection par fluorescence peut être réalisée avec UV ou lumière bleue.

Électrophorèse d’ADN à l’aide de Thiazole Orange au lieu de bromure d’éthidium ou autres colorants

Ici, nous présentons une implémentation de MATLAB de la détection automatisée et de la description quantitative des gouttelettes de lipide dans les images de microscopie de fluorescence des cellules de fission et de levure en herbe.

Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à l'aide du traitement automatisé de l'image

Le protocole décrit l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux avec une tache de gel d’ADN disponible dans le commerce, l’acquisition d’une série de time lapse de cellules étiquetées en direct par microscopie d’illumination structurée super-résolution (SR-SIM), et le suivi automatique du mouvement nucléoïde.

Étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux pour la microscopie d’illumination structurée time-lapse

Les antibiotiques étiquetés fluorescents sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour étudier de multiples aspects de la résistance aux antimicrobiens. Cet article décrit la préparation des antibiotiques fluorescents marqués et leur application à l’étude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Les sondes peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de résistance bactérienne (p. ex., efflux) par spectrophotométrie, cytométrie du débit et microscopie.

Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Ce protocole introduit une méthodologie de dépistage fluorométrique optimisée pour identifier les inhibiteurs naturels de produits et petites molécules de la synthèse protéique. Sa praticité le rend adapté à la fois à l’enseignement de premier cycle en techniques de découverte de médicaments et à la mise en œuvre dans des campagnes de chimie médicinale.

Un protocole basé sur la fluorescence pour le dépistage préliminaire des inhibiteurs de synthèse protéique provenant de sources naturelles

Découvrez une méthode de coloration de l'ADN dans les gels utilisant SYBR Green I et NBT avec exposition à la lumière bleue. Cette technique simple permet une quantification fiable sur le terrain avec un équipement minimal.

ADN coloration méthode basée sur la précipitation de Formazan induite par l’exposition à la lumière bleue

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