Name: Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Découvrez la microdissection de la vascularisation rétinienne chez le poisson-zèbre adulte tg(fli:EGFP). Cette méthode standardisée permet d'analyser rapidement les pathologies vasculaires liées à la néoangiogenèse et au diabète.

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Les auteurs tiens à remercier Katrin Bennewitz et Marlene Hausner pour l’élevage de poisson-zèbre et l’assistance technique. Les auteurs reconnaissent l’appui de la Core Facility Live Cell Imaging Mannheim au Centre de biomédecine et Mannheim de technologie médicale (DFG INST 91027/9-1). Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (International Research Training Group 1874/1 « DIAMICOM », du projet SP5 et SP9 ; Collaborative Research Centre SFB1118, Centre de recherche Collaborative SFB/TR23 projet Z5 et projet B1).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les modèles de néoangiogenèse rétinienne induite par l’hypoxie montrent un nombre accru de bifurcations, angiogéniques choux, superficie vasculaire et une diminution d’intercapillary distance en poisson-zèbre,20. Ces résultats confortent l’idée que le poisson-zèbre est sensible aux complications microvasculaires du diabète21, comme les principales constatations de la rétinopathie diabétique plus tard incluent néoangiogenèse induite par l’hypoxie, ce qui est fortement liée à l’expression du VEGF. Les changements induits par l’hyperglycémie dans la rétine de poisson-zèbre conduisent à l’augmentation de l’épaisseur des navires mais maintiennent l’ensemble22le patterning. Alternant une immersion dans des solutions de glucose pendant 30 jours diminue également l’épaisseur de l' IPL et INL23. L’influence directe des métabolites de la glycémie chez le poisson zèbre comme promoteurs métaboliques de la vasculopathie a également déjà été démontré. Hyperbranching vasculaire supplémentaire a été observée dans le système vasculaire du tronc des embryons de poisson-zèbre après incubation avec méthylglyoxal24. Pour l’instant, il n’y a pas de modèle animal qui offre tous les critères clés de la rétinopathie diabétique. Premiers changements sont trouvent souvent, mais la progression de la rétinopathie diabétique proliférative manque25. Le poisson-zèbre tombe également dans cette définition, comme nous avons vu seulement la néoangiogenèse induite par l’hypoxie ou les changements induits par l’hyperglycémie jusqu'à présent. Les résultats actuels confirment l’idée que le poisson-zèbre est sensible aux changements vasculaires induite par l’hyperglycémie et comme modèle animal peut-être potentiellement montrent une progression de la rétinopathie diabétique proliférante. Selon la force et l’exposition à l’effet médié par l’hyperglycémie, le modèle expérimental de droite pourrait entraîner une ischémie dans certaines zones de la rétine de poisson-zèbre et promouvoir la néoangiogenèse comme les critères clés de la rétinopathie diabétique proliférative. Cependant, comme le poisson-zèbre est un acteur relativement nouveau dans le domaine de la modélisation de pathologies microvasculaires à long terme, des modèles de diabète à venir chez le poisson zèbre fournissent des informations supplémentaires et clarifier son importance par rapport aux autres modèles et leurs pathologies. Par exemple, une en-croix de tg(gata1a:DsRed) poisson-zèbre avec marqué au rouge des érythrocytes dans la ligne de tg(fli:EGFP) pourrait servir à visualiser simultanément hémorragies intraoculaires potentielles à l’avenir zebrafish modèles montrant des microanévrismes comme un facteur prédictif de progression de PDR.
Étant donné que la vascularisation rétinienne progresse en une succession d’arcades, évaluation de la distance de perforations et nombre de bifurcations de la superficie totale de vasculaire sont liés à la distance de l’artère centrale de l’optique. Pour éviter les biais dans les paramètres vasculaires mises en recouvrement, un point d’orientation est nécessaire. Le CIO est une telle structure et est très pertinent, étant donné que les domaines d’activité vasculaire se trouvent à proximité spatiale. Pour l’évaluation uniforme, le scan rétinien devrait être divisé en plusieurs sections image rectangulaire avec une distance conforme au CIO. La rétine entière doit être analysée et images numériquement symétriquement distribués. La rétine de poisson-zèbre montre des zones à densité capillaire haute et basse et une répartition inégale des sections de l’image peut conduire à un biais supplémentaire.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
Figure 12 : présentation d’exemple des paramètres vasculaires comme l’affichage de la visualisation de la vascularisation rétinienne. Mesure de la distance de perforations (double flèche rouge) près de l’optique interne cercle (IOC) (A). Trois bifurcations (cercles rouges) près de l' IOC (B). Visualisation du système vasculaire rétinien de poisson-zèbre avec un espace élargi (boîte rouge) montrant un navire de germination (C). Le diamètre du vaisseau mesurée sur une certaine distance (double flèche blanche) de l’artère centrale (croix blanche) (D). Densité de navire est le pourcentage de zone rétinienne occupée en superposant des navires (diagonales rouges) (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Pour mesurer la distance de perforations, il faut définir une certaine distance au CIO en standard (Figure 12 a, flèche double blanche) et dessiner une ligne horizontale imaginaire (Figure 12 a, une ligne blanche horizontale) parallèle au CIO. La distance entre les navires sur cette ligne additionnés et la moyenne arithmétique est égale à la distance de perforations. Bifurcations sont comptées à l’intérieur de chaque image, chaque fois qu’un navire se divise et plus d’un lumen vasculaire continue du point d’origine. Cela inclut également des liens horizontaux entre les capillaires. Il est important de rester cohérent avec l’analyse et de décider quels points de ramifications de compter et de garder ces règles tout au long de l’expérience ensemble pour réduire les variations inutiles. Bourgeonnement vasculaire, comme illustré dans la Figure 12, est un autre paramètre qui peut être compté dans chaque image pour évaluer l’influence sur la vascularisation rétinienne. Angiogénique germes ne suivent pas la succession de type arcade entre artère centrale et CIO et mise au point près de la partie externe de la rétine. Afin d’évaluer certains diamètres de navire, il faut toujours un point d’orientation d'où une distance définie marque la mesure spot. Origine de l’artère centrale à l’intérieur de la rétine fournit ces indications pour les vaisseaux de la tige principale (Figure 12D, blanc Croix). La superficie occupée par les navires (Figure 12F, diagonales rouges) comme un pourcentage de la surface rétinienne ensemble est la densité vasculaire et indirectement correspond à la zone avasculaire.
Un balayage confocal complète d’un échantillon devrait être composé de plusieurs images de détails élevés pour permettre la visualisation des petite hypersprouting capillaire. Pour optimiser les temps et les ressources consacrées à cette étape, une procédure automatisée de labourage doit être utilisée avec une profondeur d’analyse générale pour chaque tuile. Montage inégale de la rétine peut augmenter considérablement le temps passé pour balayer le système vasculaire avec un microscope confocal. Dans une approche optimale on voudrait analyser uniquement la couche vasculaire (Figure 13 b, boîte blanche), mais l’inclusion partielle de la GCL est souvent nécessaire.Laissant une longueur excessive du nerf optique après troncature, ainsi que les coupes à réaliser le montage plat étant trop court, peut conduire à montage inégale.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
Figure 13 : Comparaison de HE coloration autofluorescence dans la rétine de poisson-zèbre adulte. Système vasculaire rétinien en bref dessus GCL (A). Système vasculaire rétinien (boîte blanche) montrant vert un signal EGFP et couches rétiniennes présentant de fort autofluorescence (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Comme la bonne préparation de la vascularisation rétinienne de poisson-zèbre a besoin d’une formation préalable, un petit échantillon avec dissecteurs non formés et des résultats de préparation fortement variables sont une principale limite de la technique. Alors que la préparation des yeux de poisson-zèbre de tg(fli:EGFP) donne un aperçu rapide de l’état du système vasculaire, la technique utilise toujours environ 20 min de temps de travail par la rétine pour un chercheur expérimenté. Toutes ces étapes de préparation pour la vascularisation rétinienne doivent être effectuée sous un microscope à dissection et dissecteurs il fallait rester concentré tout le temps comme une étape imprudente peut induire potentiellement bris de navire. Le dissecteur doit pratiquer régulièrement car une absence prolongée de préparation réduit la probabilité d’un dissecteur de maintenir l’intégrité du navire.
En outre, l’affichage supplémentaire par immunohistochimie (IHC) est encore limitée, que seul un petit nombre d’anticorps validés sur les tissus humains et les rongeurs travaillent avec le poisson-zèbre. Expérimentateurs intéressés par IHC sont invités à rechercher des anticorps spécifiques à poisson-zèbre, surtout lorsque vous travaillez avec nouveaux objectifs. Par ailleurs, il est recommandé d’utiliser les lignes de journaliste zebrafish supplémentaires qui sont utiles pour étudier les cellules au-delà de la vascularisation dans les yeux. Cette stratégie, cependant, est beaucoup de temps, car il faut quelques mois pour produire des lignées de poisson-zèbre adulte qui transportent plusieurs reporters transgéniques.
Néanmoins, le poisson-zèbre pose une gamme unique d’avantages. Ils sont relativement petits et se reproduisent facilement. Ils peuvent se développer rapidement au stade adulte et leurs embryons sont optimales pour le dépistage des drogues. Le champ croît rapidement et plus la littérature devient accessible. Avec la capacité de générer des débouchures de gène à une vitesse rapide et une abondance de lignes de journaliste de fluorescence transgène, le choix pour le poisson-zèbre est seulement retenu par la question de recherche choisie.

Le diabète sucré est une maladie métabolique, définie par une hyperglycémie résultant de la sécrétion d’insuline dysfonctionnelle ou réponse tissulaire insuffisante à l’insuline sécrétée. L’OMS estime que 422 millions d’adultes étaient atteintes de diabète sucré en 20141 et la prévalence du diabète dans le monde devrait passer de 8 à 10 % de la population jusqu’en 20352, faisant de diabète l’un des domaines de recherche principaux dans le cours des prochaines décennies. Vivre avec hyperglycémie chronique entraîne des complications microvasculaires à long terme, y compris la polyneuropathie, la néphropathie et rétinopathie diabétique. La gestion et la prévention de ces complications sont difficiles ; en effet, diabète devient la cause la plus fréquente d’insuffisance rénale terminale (IRT), qui conduit à la dialyse2, et le diabète est la principale cause de cécité chez les adultes d’âge mûr3.
Les causes initiales de dommages microvasculaires dans le œil diabétique sont une hyperglycémie chronique, altération métabolique, ainsi que certains facteurs de risque (p. ex., hypertension, dyslipidémie), conduisant à la dysfonction endothéliale vasculaire, pericyte d’abandon, et régression capillaire qui se traduit par des manchons vasculaires acellulaires. L’ischémie rétinienne qui en résulte est la cause de la néovascularisation et l’augmentation de la perméabilité vasculaire favorisant le développement de la rétinopathie diabétique proliférante (PDR)4. Rétinopathie diabétique a été généralement détectée dans 37 % des patients atteints de diabète, tandis que la vue en danger de la rétinopathie diabétique a été constatée chez 12 % de la cohorte européenne blanche filtrée dans l' étude UKADS5. Le traitement actuel peut prévenir seulement d’autres complications et n’est pas en mesure de restaurer pleinement les dégâts déjà provoqués. Photocoagulation panrétinienne, en plus du contrôle de la glycémie, est la thérapie standard pour la rétinopathie diabétique proliférante (PDR) mais affecte les tissus sains adjacents ainsi. Des interventions anti-VEGF montrent des résultats prometteurs comme alternative au laser traitement6,7, mais en fin de compte, traitement ciblé spécialisé et les nouveaux médicaments sont nécessaires pour gérer le nombre croissant de patients à risque de perte de la vision.
Les modèles de recherche établis sur les animaux de la rétinopathie diabétique ne partagent pas tous les aspects de la physiopathologie humaine. Utilisation de la bonne espèce pour répondre aux besoins précis de la question de la recherche scientifique est une des parties plus importantes de l’installation expérimentale. L’embryon de poisson zèbre (Danio rerio) est déjà largement utilisée en recherche de développement et fournit une expérience pratique optimale à coup de masse ou le knockout gènes spécifiques via les morpholinos ou la technique CRISPR/Cas98. Ces méthodes peuvent facilement être utilisés chez le poisson zèbre pour étudier les gènes qui ont été identifiés par les études d’association pangénomique à grande échelle (GWAS), générant un aperçu des mécanismes particuliers de la progression de la maladie et de la susceptibilité9. Peu de temps générationnel, grandes quantités de progéniture, facile et peu coûteux manutention et dosage soutien grandissant ont augmenté la pertinence du modèle poisson-zèbre, surtout compte tenu de son grand potentiel pour la modélisation de maladies métaboliques. Conservation des mécanismes biologiques chez le poisson zèbre a été établie comme base pour le développement de la thérapie pharmacologique. Par exemple, l’antidiabétique metformine et simvastatine anti-cholestérol montrent « traiter » les conditions dans les modèles de cAMP/dexaméthasone-induced haute PEPCK expression et riche en cholestérol hypercholestérolémie induite par l’alimentation10 , 11 , 12. cet avancée aperçu global des mécanismes métaboliques conservés est étayée par le nombre croissant de modèles de diabète du poisson-zèbre, grâce à des expériences telles que : alternance d’incubation dans des solutions de glucose, Streptozotocine ablation des cellules bêta, bêta cellulaire nitroréductase ablation utilisant le métronidazole prodrogue, diabète monogénique médié par l’inactivation du gène pdx1 ou knockout, ainsi que des modèles de résistance à l’insuline accrue dans le muscle squelettique 12. ces déjà établi les protocoles, les détails mentionnés ci-dessus de l’espèce, et la possibilité de manipuler efficacement le génome dans un grand nombre d’échantillons tous démontrer les avantages du poisson-zèbre pour étudier les mécanismes conduite de processus morbides complexes comme la capacité pour dépister les interventions pharmacologiques.
Une compréhension générale de l’anatomie oculaire de base poisson-zèbre (Figure 1) est nécessaire pour le dissecteur afin d’utiliser le poisson-zèbre comme modèle pour angiopathie rétinienne. Le œil de poisson-zèbre a six muscles extraoculaires, rectus quatre et deux muscles obliques qui insèrent à l’extérieur du globe à la sclère13. La cornée est le tissu transparent recouvre la lentille et continue directement dans la sclérotique, qui forme l’enveloppe extérieure de le œil. La sclérotique est opaque, a une surface réfléchissante partiellement léger et est fortement pigmentée. L’objectif lui-même est plus en forme de boule que l’homologue humain. La rétine se compose de trois couches nucléaires des cellules neuronales alors que la vascularisation rétinienne apport d’oxygène est étroitement liée à la couche de cellules de ganglion interne mais ne forme pas un réseau sous-rétinienne. Les vaisseaux choroïdienne, en revanche, se trouvent entre la sclérotique et la rétine et sont associées à l’épithélium pigmenté rétinien (RPE). Ce réseau capillaire fournit l’oxygène pour les parties extérieures de la rétine14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
Figure 1 : représentation schématique de le œil de poisson-zèbre adulte. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Visualisation directe de la vascularisation rétinienne est possible par l’utilisation du poisson-zèbre tg(fli:EGFP) transgénique ligne15. La protéine fluorescente verte exprimée sous contrôle du promoteur fli dans les cellules endothéliales du système vasculaire est la base pour la visualisation via un laser scanning microscope dans les étapes ultérieures. Ceci est réalisé via la dissection de la rétine de poisson-zèbre et son ensemble-montage du tissu. Ce modèle transgénique fournit une lecture rapide vasculaire sans apport d’étiquetage intravasculaire ou entier-Montez l’immunohistochimie. Pour analyser la rétinopathie diabétique chez le poisson zèbre, une routine de préparation étape par étape et normalisée doit être utilisée par chaque dissecteur.Le protocole de préparation suivant fournit aux autres groupes de recherche la possibilité d’évaluer facilement les modifications vasculaires dans les récipients exposés de le œil de poisson-zèbre adulte et donnera des orientations afin d’établir une routine de dissection optimisée pour le poisson-zèbre de la rétine.

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Roth</td><td>6771.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*6H20</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H20</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogénophosphate</td><td>Roth</td><td>2370.1</td><td></td></tr><tr><td>Sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (MS-222,Tricaïne)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo-Fischer</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Greiner Bio one</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à six puits</td><td>StarLab</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>BD 300900</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pince à épiler</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection Ciseaux</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Lame en verre</td><td>Carl Roth</td><td>H872.1</td><td></td></tr><tr><td>Lame de recouvrement 22mmx22mm</td><td>neoLab</td><td></td><td></td>103512222</tr><tr><td>Scalpel</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>FEA111</td><td></td></tr><tr><td>Epi-Illumination</td><td>Leica</td><td>10446389</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope à fluorescence MZ10 F</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser SP5 DS</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope M80</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ligne Zebrafish: Tg(fli :EGFP), ABTL wildtype</td><td>NA</td><td>NA</td><td>voir Référence 15</td></tr><tr><td>Mayer' s hématoxyline</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml ; hne</td><td>0088663</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % d’éosine</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml ; hne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>99,9 % éthanol</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Merck</td><td>1 071 501 000</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Roth</td><td>4436.2</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Emsure</td><td>606-001-00-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM 2165</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:egfp) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

La rétinopathie diabétique est la principale cause de cécité chez les adultes d’âge moyen. L’augmentation de la prévalence du diabète dans le monde entier fera la prévention des complications microvasculaires du diabète l’un des domaines de recherche principaux des prochaines décennies. Traitement ciblé spécialisé et nouveaux médicaments thérapeutiques sont nécessaires pour gérer le nombre croissant de patients à risque de perte de la vision. Le poisson-zèbre est un modèle animal établi pour des questions de développement en recherche avec une augmentation de pertinence pour la modélisation des processus métaboliques maladie multifactorielle. Les avantages de l’espèce permettent une visualisation optimale et drogue à haut débit, dépistage des approches, combinées à la forte capacité d’assommer les gènes d’intérêt. Nous décrivons ici un protocole qui permettra de faciliter l’analyse du système vasculaire rétinienne tg(fli:EGFP) adult poisson zèbre comme une lecture rapide en paramètres de pathologies vasculaires à long terme, liées aux dommages néoangiogenèse ou navire. Ceci est réalisé via la dissection de la rétine de poisson-zèbre et son ensemble-montage du tissu. Visualisation des vaisseaux exposés est alors obtenue par microscopie confocale le reporter EGFP verte exprimée dans la vascularisation rétinienne adulte. Manipulation correcte du tissu mènera à de meilleurs résultats et moins de rupture de cuve interne pour assurer la visualisation de la structure vasculaire intacte. La méthode peut être utilisée dans des modèles de poisson-zèbre de vasculopathies rétiniennes liées à l’évolution de l’architecture du navire ainsi que néoangiogenèse.

Nous démontrons ici deux exemples morphologiques typiques de la vascularisation rétinienne chez le poisson zèbre adulte tg(fli:EGFP) : une fois visualisé avec un microscope à fluorescence (Figure 9 a) et une fois avec un confocal laser scanning microscope (Figure 9 b). La structure rétinienne révélée montre un patron très organisés. Forte autofluorescence est vu dans la rétine de poisson-zèbre, quand visualisé à l’aide d’un microscope à fluorescence. Ainsi, une visualisation des que la couche vasculaire par un balayage confocal est conseillée de réduire la fluorescence de fond et augmenter le contraste. Pour le plus rapide d’acquisition de photo ou de situations où les données qualitatives sont assez, le microscope à fluorescence est une alternative intéressante.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
Figure 9 : photos représentatives du système vasculaire rétinien tg(fli:EGFP) adultes zebrafish. Deux exemples morphologiques typiques de la vascularisation rétinienne figurent : l’artère centrale optique se propage dans les vaisseaux principaux 5-7, qui ensuite créer de branchement dans une succession d’arcades. Tous les autres navires déversent dans la veine circonférentielle (CV) limitant la partie extérieure de chaque pétale. Visualisation par microscopie de fluorescence à 2,5 x grossissement (A). Visualisation de la vascularisation rétinienne par laser confocale, microscopie par un balayage combinée de la tuile du seule image 5 x 5 (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
L’artère optique pénètre la rétine à la tête du nerf optique et, dans la plupart des échantillons, se répand dans les 5-7 navires principaux (Figure 10 a). Les principaux navires puis créer de branchement dans une succession d’arcades et de se connecter à optique cercle intérieur (IOC), aussi appelé la veine circonférentielle (CV), encerclant le disque optique dans la périphérie de la rétine montée plate (voir Figure 10 b). Le CIO est le veineux drainant le sang artériel vers le bord interne du globe oculaire (bulbus oculi). La vascularisation rétinienne de poisson-zèbre montre également les secteurs de forte activité vasculaire avec le branchement des capillaires et angiogéniques germination (Figure 10). Cette activité vasculaire est principalement située dans la proximité proche au CIO. Il est important de noter que l’oeil même peut démontrer les deux activités hautes et basses vasculaires dans différentes régions de la rétine (comparer la Figure 10 b et Figure 10). En général, le système vasculaire rétinien du poisson-zèbre montre plus d’espace avasculaire et moins capillaires entre les branches principales par rapport à, par exemple, la rétine de souris17. Les deux yeux de chaque échantillon devrait être analysés car les vaisseaux peuvent varier entre les deux et inspection du singulier peut conduire à la partialité.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
Figure 10 : magnifiée des zones de visualisation de vascularisation rétinienne poisson zèbre adulte tg(fli:EGFP). L’artère optique ramification dans les vaisseaux principaux (A). Capillaires rétiniens dans une zone de faible activité vasculaire connectez à cercle optique (CIO) dans le bas de l’image (B). Capillaires rétiniens dans une zone de forte activité vasculaire se connecter à l' IOC (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Une architecture hautement conservée de couches neuronales est déjà présente chez le poisson zèbre d’environ 72 h après la fécondation (hpf) partir18. La rétine de poisson-zèbre adulte montre les couches suivantes de l’intérieur vers l’extérieur (Figure 11) : couche de cellules de ganglion (GCL), couche plexiforme interne (IPL), la couche nucléaire interne (INL), la couche plexiforme externe (OPL), couche nucléaire externe (ONL), couche de photorécepteur (PL), et l’épithélium pigmenté rétinien (RPE). L’estimation des paramètres vasculaires de visualisation du système vasculaire rétinien est illustrée à la Figure 12. La vascularisation rétinienne interne se trouve sur la couche de cellules de ganglion (GCL) (Figure 13 b, boîte blanche) alors que la choroïde capillaires seraient associés à l’épithélium pigmenté rétinien (RPE).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
Figure 11 : il a une coloration de le œil de poisson-zèbre adulte. Vue d’ensemble de coupe transversale de l’oeil entier après le retrait de la lentille (A). 19 (B)les yeux des couches rétiniennes du poisson-zèbre adult. Indication (flèche noire) du point de rupture naturelle au PL (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, nous discutons d’une méthode de protocole qui permettra une analyse simple du système vasculaire rétinienne tg(fli:EGFP) adult poisson zèbre comme une lecture rapide en paramètres de pathologies vasculaires à long terme, liées à la néoangiogenèse et changements structurels.

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

L’objectif global de ce protocole de dissection pour le système vasculaire rétinien du poisson-zèbre adulte est de fournir une lecture rapide dans des contextes de pathologies vasculaires à long terme liées à la néoangiogenèse et aux changements structurels par microscopie confocale à fluorescence ou à balayage laser. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des complications microvasculaires telles que le développement de la rétinopathie diabétique. Le principal avantage de cette technique est que l’ensemble du rétinovasculature peut être présenté et analysé dans les processus physiologiques et pathologiques sans aucune application de fluorescence intervasculaire de manière relativement rapide et standardisée.Pour commencer, transférez six millilitres de solution PFA PBS à quatre pour cent fraîchement préparée par échantillon dans les puits de six plaques de puits. Après avoir euthanasié les poissons-zèbres adultes selon le protocole de texte, placez-les sur du papier absorbant frais et séchez-les. À l’aide d’un scalpel, coupez les têtes derrière l’opercule.Transférez ensuite les têtes directement dans les puits de fixateur fraîchement préparé. Conservez les plaques contenant les têtes de poisson à quatre degrés Celsius pendant au moins 24 heures pour vous assurer que le fixateur pénètre dans les couches profondes de la rétine. Avec de l’agarose chauffé à deux pour cent, remplissez une boîte de Pétri jusqu’à un tiers et attendez que la gélose soit ferme.Couvrez la plaque de gélose avec un PBS X pour créer un espace de travail pour disséquer les yeux. Transférez l’échantillon fixé dans la boîte de Pétri. Et en tenant la tête sur la surface coupée avec une pince à épiler, insérez-en une autre, épinglée ensemble sous le globe oculaire au niveau de la cavité orbitale.Ouvrez lentement la pince à épiler sous l’œil et saisissez le nerf optique. Ensuite, déchirez et détachez soigneusement l’œil. Pour enlever l’un des quatre muscles droits et les deux muscles extraoculaires obliques reliés à l’œil ainsi que le tissu extraoculaire résiduel reliant l’œil à la cavité orbitaire, retenez l’œil à l’aide d’une pince à épiler semi-fermée et, en saisissant la structure avec l’autre pince à épiler, utilisez un mouvement diamétralement pour l’arracher doucement.Ensuite, utilisez une aiguille jetable de calibre 27 pour percer la cornée à la plage externe. À travers cette ouverture, utilisez les deux pinces à épiler pour tenir la cornée et la déchirer légèrement. Ensuite, travaillez soigneusement pour créer une déchirure centrée de la taille de la pupille respective.Appliquez une pression sur le côté cornéen du globe oculaire au niveau du bord cornéen externe au-dessus de l’iris. Cela créera une petite bosse et poussera le cristallin à la hauteur de la déchirure cornéenne. Ensuite, passez la pince à épiler sous l’objectif et retirez-la.Ensuite, retournez l’œil avec le nerf optique vers le haut. Notez que la sclérotique et la cornée sont reliées et forment la tunique fibreuse du bulbe oculaire pour protéger la rétine en forme de coupe. Cette coquille, appelée cornéosclérotique, épargne la zone autour du nerf optique.Insérez une aiguille à cet arrêt pour créer une ouverture entre la sclérotique et la rétine. Ensuite, en utilisant cet accès avec les deux pincettes, déchirez soigneusement la sclère axialement en bandes pour augmenter l’ouverture autour du nerf optique. Veillez à garder la cornéosclére intacte à la transition vers la circonférence latérale de la cornée.Avant de retirer la cornéosclère du tissu intraoculaire restant, essayez de sévèrer toutes les connexions, car l’attachement à d’autres structures sera un point critique. Tenez ensuite la sclérotique avec une pince à épiler et, en saisissant le nerf optique avec l’autre et en le retirant, retirez complètement la cornéosclére de l’œil et jetez-la. Cette étape permettra d’obtenir une structure en forme de coupe composée de l’uvée et de la rétine contenant le système vasculaire rétinien.Ensuite, créez une rupture dans la couche choroïdienne et RPE en tenant une aiguille de calibre 27 sur le côté de la tasse restante tout en grattant la surface extérieure avec le bord de la pointe de l’aiguille. Utilisez la rupture comme point d’accès pour saisir la couche choroïdienne et RPE et utilisez les deux pinces à épiler pour la déchirer en bandes en gardant la connexion à l’iris intacte. Ensuite, passez une pince à épiler sous l’iris et déplacez-la dans un circuit de l’extérieur tout en créant une tension en tirant sur la couche choroïdienne et RPE abandonnée et détachez la structure combinée.Si des parties de l’iris ne peuvent pas être retirées et rester connectées à la rétine en forme de coupe après l’ablation de la couche choroïdienne et de l’EPR, utilisez un autre point de rupture naturel que l’œil du poisson-zèbre adulte présente à l’intérieur de la couche photoréceptrice. De la même manière, il est démontré qu’il enlève l’iris. Grattez la rétine en forme de coupe restante pour induire des interruptions dans la couche photoréceptrice.Utilisez ensuite l’accès créé pour retirer la couche tout en gardant intacte la connexion éventuelle avec l’iris. Ensuite, passez la pince à épiler sous l’iris et continuez dans un circuit comme démontré plus haut dans cette vidéo pour détacher la structure combinée. Il est crucial de déconnecter l’iris de son tissu sous-jacent de manière judicieuse, car il bloquera la fluorescence directement au-dessus du cercle optique interne lors de la visualisation des vaisseaux.Une approche trop directe peut entraîner la rupture du navire. Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort de microdissection avec un tranchant droit de deux points cinq millimètres pour couper le nerf optique le plus près possible de la rétine. Cela permettra un meilleur montage à plat du tissu.Pour monter et visualiser le système vasculaire rétinien, utilisez un X PBS pour laver la rétine disséquée deux fois pendant cinq minutes chacune. Placez une goutte de PBS sur une lame de verre. Ensuite, à l’aide d’une spatule de laboratoire avec une extrémité de microcuillère, transférez la rétine dans la gouttelette.À l’aide d’une pince à épiler, maintenez le tissu en place tout en utilisant un scalpel pour couper la structure en forme de coupe afin de créer une forme plate de quatre ou cinq pétales, selon la taille de la rétine. Avec un bout de papier fin, aspirez le PBS restant, en prenant soin de ne pas toucher la rétine. Enduisez ensuite la rétine montée à plat dans un support de montage et couvrez-la avec la lamelle.Faites attention à ne pas créer de mousse car les bulles d’air peuvent déformer la visualisation des vaisseaux rétiniens. Utilisez du vernis à ongles pour sceller le couvercle. Enfin, effectuez une microscopie à fluorescence ou à balayage laser pour visualiser le système vasculaire rétinien.Voici un exemple morphologique de la vascularisation rétinienne chez le poisson-zèbre EGFP de mouche transgénique adulte visualisé avec un microscope à fluorescence et un deuxième exemple imagé avec un microscope confocal à balayage laser qui réduit la fluorescence de fond. La structure rétinienne révélée présente un schéma très organisé. L’artère optique pénètre dans la rétine au niveau de la tête du nerf optique et, dans la plupart des échantillons, se propage dans cinq à sept vaisseaux principaux.Les vaisseaux principaux se ramifient ensuite en une succession d’arcades et se connectent au cercle optique interne ou IOC, également appelé veine circonférentielle, encerclant le disque optique à la périphérie de la rétine montée plate. La rétine du poisson zèbre adulte est composée des couches suivantes de l’intérieur vers l’extérieur. La couche de cellules ganglionnaires, la couche plexiforme interne, la couche nucléaire interne, la couche plexiforme externe, la couche nucléaire externe, la couche photoréceptrice et l’épithélium pigmenté rétinien.L’estimation des paramètres vasculaires à partir de la visualisation du système vasculaire rétinien est présentée ici. Le système vasculaire rétinien interne est situé sur la couche de cellules ganglionnaires tandis que les capillaires cordiaux seraient associés à l’épithélium pigmenté rétinien. Une fois formée, cette technique peut être réalisée en moins de 20 minutes si elle est exécutée correctement.Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de vous rappeler de vous entraîner régulièrement, car une absence prolongée de préparation réduit le résultat de l’intégrité du navire. Suite à cette procédure, le diabète et les pathologies neurovasculaires peuvent être analysés chez le poisson-zèbre adulte.

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