Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

L’objectif global de ce protocole de dissection pour le système vasculaire rétinien du poisson-zèbre adulte est de fournir une lecture rapide dans des contextes de pathologies vasculaires à long terme liées à la néoangiogenèse et aux changements structurels par microscopie confocale à fluorescence ou à balayage laser. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des complications microvasculaires telles que le développement de la rétinopathie diabétique. Le principal avantage de cette technique est que l’ensemble du rétinovasculature peut être présenté et analysé dans les processus physiologiques et pathologiques sans aucune application de fluorescence intervasculaire de manière relativement rapide et standardisée.

Pour commencer, transférez six millilitres de solution PFA PBS à quatre pour cent fraîchement préparée par échantillon dans les puits de six plaques de puits. Après avoir euthanasié les poissons-zèbres adultes selon le protocole de texte, placez-les sur du papier absorbant frais et séchez-les. À l’aide d’un scalpel, coupez les têtes derrière l’opercule.

Transférez ensuite les têtes directement dans les puits de fixateur fraîchement préparé. Conservez les plaques contenant les têtes de poisson à quatre degrés Celsius pendant au moins 24 heures pour vous assurer que le fixateur pénètre dans les couches profondes de la rétine. Avec de l’agarose chauffé à deux pour cent, remplissez une boîte de Pétri jusqu’à un tiers et attendez que la gélose soit ferme.

Couvrez la plaque de gélose avec un PBS X pour créer un espace de travail pour disséquer les yeux. Transférez l’échantillon fixé dans la boîte de Pétri. Et en tenant la tête sur la surface coupée avec une pince à épiler, insérez-en une autre, épinglée ensemble sous le globe oculaire au niveau de la cavité orbitale.

Ouvrez lentement la pince à épiler sous l’œil et saisissez le nerf optique. Ensuite, déchirez et détachez soigneusement l’œil. Pour enlever l’un des quatre muscles droits et les deux muscles extraoculaires obliques reliés à l’œil ainsi que le tissu extraoculaire résiduel reliant l’œil à la cavité orbitaire, retenez l’œil à l’aide d’une pince à épiler semi-fermée et, en saisissant la structure avec l’autre pince à épiler, utilisez un mouvement diamétralement pour l’arracher doucement.

Ensuite, utilisez une aiguille jetable de calibre 27 pour percer la cornée à la plage externe. À travers cette ouverture, utilisez les deux pinces à épiler pour tenir la cornée et la déchirer légèrement. Ensuite, travaillez soigneusement pour créer une déchirure centrée de la taille de la pupille respective.

Appliquez une pression sur le côté cornéen du globe oculaire au niveau du bord cornéen externe au-dessus de l’iris. Cela créera une petite bosse et poussera le cristallin à la hauteur de la déchirure cornéenne. Ensuite, passez la pince à épiler sous l’objectif et retirez-la.

Ensuite, retournez l’œil avec le nerf optique vers le haut. Notez que la sclérotique et la cornée sont reliées et forment la tunique fibreuse du bulbe oculaire pour protéger la rétine en forme de coupe. Cette coquille, appelée cornéosclérotique, épargne la zone autour du nerf optique.

Insérez une aiguille à cet arrêt pour créer une ouverture entre la sclérotique et la rétine. Ensuite, en utilisant cet accès avec les deux pincettes, déchirez soigneusement la sclère axialement en bandes pour augmenter l’ouverture autour du nerf optique. Veillez à garder la cornéosclére intacte à la transition vers la circonférence latérale de la cornée.

Avant de retirer la cornéosclère du tissu intraoculaire restant, essayez de sévèrer toutes les connexions, car l’attachement à d’autres structures sera un point critique. Tenez ensuite la sclérotique avec une pince à épiler et, en saisissant le nerf optique avec l’autre et en le retirant, retirez complètement la cornéosclére de l’œil et jetez-la. Cette étape permettra d’obtenir une structure en forme de coupe composée de l’uvée et de la rétine contenant le système vasculaire rétinien.

Ensuite, créez une rupture dans la couche choroïdienne et RPE en tenant une aiguille de calibre 27 sur le côté de la tasse restante tout en grattant la surface extérieure avec le bord de la pointe de l’aiguille. Utilisez la rupture comme point d’accès pour saisir la couche choroïdienne et RPE et utilisez les deux pinces à épiler pour la déchirer en bandes en gardant la connexion à l’iris intacte. Ensuite, passez une pince à épiler sous l’iris et déplacez-la dans un circuit de l’extérieur tout en créant une tension en tirant sur la couche choroïdienne et RPE abandonnée et détachez la structure combinée.

Si des parties de l’iris ne peuvent pas être retirées et rester connectées à la rétine en forme de coupe après l’ablation de la couche choroïdienne et de l’EPR, utilisez un autre point de rupture naturel que l’œil du poisson-zèbre adulte présente à l’intérieur de la couche photoréceptrice. De la même manière, il est démontré qu’il enlève l’iris. Grattez la rétine en forme de coupe restante pour induire des interruptions dans la couche photoréceptrice.

Utilisez ensuite l’accès créé pour retirer la couche tout en gardant intacte la connexion éventuelle avec l’iris. Ensuite, passez la pince à épiler sous l’iris et continuez dans un circuit comme démontré plus haut dans cette vidéo pour détacher la structure combinée. Il est crucial de déconnecter l’iris de son tissu sous-jacent de manière judicieuse, car il bloquera la fluorescence directement au-dessus du cercle optique interne lors de la visualisation des vaisseaux.

Une approche trop directe peut entraîner la rupture du navire. Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort de microdissection avec un tranchant droit de deux points cinq millimètres pour couper le nerf optique le plus près possible de la rétine. Cela permettra un meilleur montage à plat du tissu.

Pour monter et visualiser le système vasculaire rétinien, utilisez un X PBS pour laver la rétine disséquée deux fois pendant cinq minutes chacune. Placez une goutte de PBS sur une lame de verre. Ensuite, à l’aide d’une spatule de laboratoire avec une extrémité de microcuillère, transférez la rétine dans la gouttelette.

À l’aide d’une pince à épiler, maintenez le tissu en place tout en utilisant un scalpel pour couper la structure en forme de coupe afin de créer une forme plate de quatre ou cinq pétales, selon la taille de la rétine. Avec un bout de papier fin, aspirez le PBS restant, en prenant soin de ne pas toucher la rétine. Enduisez ensuite la rétine montée à plat dans un support de montage et couvrez-la avec la lamelle.

Faites attention à ne pas créer de mousse car les bulles d’air peuvent déformer la visualisation des vaisseaux rétiniens. Utilisez du vernis à ongles pour sceller le couvercle. Enfin, effectuez une microscopie à fluorescence ou à balayage laser pour visualiser le système vasculaire rétinien.

Voici un exemple morphologique de la vascularisation rétinienne chez le poisson-zèbre EGFP de mouche transgénique adulte visualisé avec un microscope à fluorescence et un deuxième exemple imagé avec un microscope confocal à balayage laser qui réduit la fluorescence de fond. La structure rétinienne révélée présente un schéma très organisé. L’artère optique pénètre dans la rétine au niveau de la tête du nerf optique et, dans la plupart des échantillons, se propage dans cinq à sept vaisseaux principaux.

Les vaisseaux principaux se ramifient ensuite en une succession d’arcades et se connectent au cercle optique interne ou IOC, également appelé veine circonférentielle, encerclant le disque optique à la périphérie de la rétine montée plate. La rétine du poisson zèbre adulte est composée des couches suivantes de l’intérieur vers l’extérieur. La couche de cellules ganglionnaires, la couche plexiforme interne, la couche nucléaire interne, la couche plexiforme externe, la couche nucléaire externe, la couche photoréceptrice et l’épithélium pigmenté rétinien.

L’estimation des paramètres vasculaires à partir de la visualisation du système vasculaire rétinien est présentée ici. Le système vasculaire rétinien interne est situé sur la couche de cellules ganglionnaires tandis que les capillaires cordiaux seraient associés à l’épithélium pigmenté rétinien. Une fois formée, cette technique peut être réalisée en moins de 20 minutes si elle est exécutée correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de vous rappeler de vous entraîner régulièrement, car une absence prolongée de préparation réduit le résultat de l’intégrité du navire. Suite à cette procédure, le diabète et les pathologies neurovasculaires peuvent être analysés chez le poisson-zèbre adulte.