Un modèle de poisson zèbre du diabète sucré et de la mémoire métabolique

Mémoire métabolique est le phénomène par lequel les complications du diabète persistent et progresser sans entrave, même après euglycémie est atteint pharmaceutique. Nous décrivons ici un modèle de poisson zèbre diabète sucré qui est unique en ce qu'elle permet d'examiner des éléments mitotiquement transmissibles épigénétiques de mémoire métabolique

L’objectif global de cette procédure est de générer un modèle de poisson-zèbre du diabète sucré de type 1, qui peut être utilisé pour découvrir la base moléculaire des complications du diabète sucré et, plus important encore, pour déterminer la base génétique de leur persistance. Ceci est accompli en induisant d’abord l’hyperglycémie avec une série d’injections du médicament diabétogène STZ, et l’incubation du poisson à une température réduite. Ensuite, après trois semaines, la glycémie à jeun est déterminée pour s’assurer que l’état hyperglycémique a été induit et le médicament est arrêté pour initier la récupération des cellules bêta

Ensuite, la nageoire caudale est amputée et laissée se régénérer pour isoler les composants génétiquement transmissibles de la mémoire métabolique et pour éliminer les facteurs potentiellement compliquants de l’environnement hyperglycémique précédent. Enfin, un test de régénération des nageoires est effectué pour documenter une réduction persistante de la régénération des nageoires et identifier les changements induits dans le tissu transecté via un test d’intérêt. Le principal avantage du modèle du poisson-zèbre diabétique par rapport aux modèles existants est que la mémoire métabolique peut être étudiée dans un véritable environnement glycémique à l’été à ce que l’on verrait chez les patients après une greffe de pancréas.

Nous nous attendons à ce que le modèle soit utilisé pour la découverte des modifications épigénétiques qui sous-tendent la mémoire métabolique et la persistance des complications diabétiques. Pour générer du poisson zèbre avec diabète sucré, préparez un réservoir de récupération avec de l’eau de poisson normale et un réservoir d’eau de poisson anesthésique avec une dilution de un à 1000 de deux phénoxyéthanol sous une hotte. Préparez une solution à 0,3 % de STREPTOZOTOCINE ou STZ en ajoutant six milligrammes de STZ à deux millilitres de chlorure de sodium à 0,09 %, et placez immédiatement la solution sur de la glace dans un tube séparé. Aliquote suffisamment de solution saline pour le contrôle.

Les poissons remplissent une seringue d’un demi-CC équipée d’une aiguille de calibre 27 et demi avec le STZ ou des solutions de contrôle, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit piégée. Anesthésiez un seul poisson en le plaçant dans de l’eau anesthésique et en attendant que le mouvement de nage cesse, environ une à deux minutes. Une fois anesthésié, placez brièvement le poisson sur une serviette en papier pour absorber tout excès d’eau, puis placez le poisson dans un bateau et pesez-le.

Ensuite, placez le poisson sur une surface ferme. Ensuite, insérez l’aiguille au-delà du biseau dans la face postérieure du péritoine ventral et injectez soit 0,35 milligramme par gramme de TZ, soit un volume équivalent de solution de contrôle dans la cavité péritonéale du poisson après l’injection. Placez le poisson dans le réservoir d’eau de récupération et surveillez-le pour s’assurer qu’il n’y a pas d’activité de baignade normale.

Après avoir injecté suffisamment de poissons pour l’expérience, transférez-les dans des bassins vivants normaux et maintenez-les à une température de 22 à 24 degrés Celsius. La température réduite est essentielle pour une induction efficace de l’hyperglycémie afin d’induire un état prolongé d’hyperglycémie très élevée, suivez un calendrier d’injections fréquentes pendant la phase d’induction, suivies d’injections d’entretien hebdomadaires comme indiqué ici pour collecter du sang. Pour déterminer le FBGL, préparez un tube PCR étiqueté pour chaque échantillon de sang contenant cinq microlitres de solution saline normale.

Après avoir anesthésié le poisson, épongez l’excès d’eau, placez le poisson sur une lame de microscope et, à l’aide d’un scalpel, retirez la tête à la base de l’opercule, recueillez le sang qui est libéré sur la lame et ajoutez-le rapidement dans le tube PCR de solution saline stérile et normale en pipetant de haut en bas pour vous assurer que le sang ne coagule pas, placez immédiatement l’échantillon sur de la glace. Déterminez le volume de l’échantillon de sang en mesurant le volume total du liquide dans le tube et en soustrayant les cinq microlitres de solution saline. Transférez cinq microlitres de sang dilué de chaque tube PCR dans un tube de micro-fuge de 1,5 millilitre et utilisez le kit de dosage du chrome quantique conformément aux instructions du fabricant pour déterminer la concentration de glucose dans le sang.

Après avoir anesthésié un poisson, placez-le dans une boîte de Pétri et sous une lunette de dissection, utilisez un scalpel stérile de taille 10 pour amputer la nageoire du carpolot en coupant une ligne droite proximale au premier point de ramification de la trachée lipidique pour la phase de croissance régénérative du test. Placez le poisson dans un réservoir de récupération à 33 degrés Celsius pour imager les nageoires en régénération. Après avoir anesthésié un poisson, écartez la nageoire de manière à ce qu’elle soit complètement déployée et utilisez une lunette de dissection équipée d’une caméra et du logiciel NIS element.

Collectez des images à un grossissement x pour mesurer la croissance régénérative. Imprimez les images et utilisez le logiciel image J et un bloc-notes pour tracer toute la zone de nouvelle croissance afin d’assurer la précision du traçage. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’ombres ou de gouttelettes d’eau et prenez chaque mesure cinq fois pour calculer la moyenne.

Pour normaliser les mesures, mesurez la longueur du site d’amputation le long de l’axe ventral dorsal et divisez la zone précédemment déterminée par cette mesure. Après avoir généré un groupe de poissons DM et leurs témoins à 21 jours, déterminez le FBGL pour un sous-ensemble du groupe et divisez les poissons DM en deux sous-groupes pour la durée de l’expérience. Continuez les injections hebdomadaires de STZ pour l’un des groupes pendant que les contrôles de DM pour le deuxième groupe cessent les injections de STZ et incubent le poisson à température normale.

En 14 jours, ces poissons-zèbres rétabliront un contrôle normal de l’insuline et de la glycémie dans le sang grâce à la régénération du pancréas. Ces poissons sont maintenant appelés mémoire métabolique ou MM, les poissons au jour 30 après l’élimination du médicament amputent les nageoires du carpoloton des poissons témoins DM et MM comme démontré plus tôt dans cette vidéo pour permettre la croissance du tissu à mémoire métabolique. Remettez le poisson dans des conditions d’eau normales pour la régénération des nageoires pendant 30 jours au jour 60.

Effectuez une deuxième amputation dans le tissu qui a été régénéré au cours de la période de 30 à 60 jours et effectuez un test de régénération de la nageoire câline, isolez le tissu et effectuez un test d’intérêt. Le poisson-zèbre diabétique de type 1 présente non seulement les complications secondaires connues de la rétinopathie et de la néphropathie, mais présente également une complication supplémentaire : une régénération altérée de la nageoire cajolée, comme on peut le voir ici 72 heures après l’amputation. Cette complication persiste en raison de la mémoire métabolique chez les poissons qui ont rétabli un contrôle normal de la glycémie après une période d’hyperglycémie, comme le montre ici, le poisson zèbre mm présente un déficit de régénération des nageoires d’environ 40 % par rapport aux poissons témoins, et l’altération a été observée jusqu’à 150 jours après l’amputation.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’initier l’état hyperglycémique chez le poisson zèbre, de mesurer la glycémie à jeun, d’effectuer des études de régénération des nageoires et, finalement, de générer des poissons à mémoire métabolique.