4.6: Méthodes de purification de biomolécules basées sur la chromatographie

La « chromatographie » fait référence à un large éventail de méthodes utilisées pour isoler un composant d’un mélange complexe, une étape essentielle avant que les propriétés et les activités d’une biomolécule puissent être déterminées. Chaque technique chromatographique a un mécanisme de séparation différent, en fonction de la matrice de l’échantillon et du composé cible. Cette vidéo se concentrera sur les principes et le fonctionnement de deux méthodes communes à la biochimie : la chromatographie d’exclusion stérique et la chromatographie d’affinité.

La chromatographie d’exclusion stérique ou SEC est basée sur la taille des composés dans l’échantillon. Une phase mobile contenant l’échantillon est ajoutée à une colonne avec un matériau poreux : la phase stationnaire. Les molécules de l’échantillon appartiennent à l’une des 3 catégories suivantes.

Les molécules trop grosses pour pénétrer dans les pores parcourent la distance la plus courte à travers la colonne. Toute espèce dont le poids moléculaire est supérieur à cette « limite d’exclusion » sortira de la colonne en même temps. Les molécules suffisamment petites pour pénétrer librement dans les pores seront retenues le plus longtemps, et sortiront de la colonne ensemble. Le poids moléculaire permettant l’entrée complète des pores est la « limite de perméation ».

Seules les molécules situées entre ces limites seront séparées les unes des autres, car elles passent plus ou moins de temps à diffuser dans et hors des pores. Les molécules plus petites sont retenues plus longtemps sur la colonne parce qu’elles passent plus de temps dans la phase stationnaire, tandis que les molécules plus grosses à l’intérieur de ces limites sortent plus tôt.

Les masses moléculaires de 1 à 2 ordres de grandeur se situent dans ces limites. Les colonnes sont choisies en gardant cela à l’esprit, ou plusieurs colonnes peuvent être utilisées en série s’il existe une large gamme de composés souhaités.

Maintenant que vous avez vu la théorie de la SEC, regardons comment elle est mise en œuvre.

Pour commencer la procédure SEC, la colonne doit être équilibrée avec de l’eau désionisée et un tampon de chromatographie. Une fois préparé, le tampon contenant l’échantillon est injecté dans la colonne. Le tampon est ensuite poussé à travers à un faible débit. Un détecteur surveille ce qui sort de la colonne pour déterminer la présence de l’analyte souhaité. Les grosses molécules dont le poids moléculaire est supérieur à la limite d’exclusion sortent de la colonne en même temps. De petites fractions de la colonne sont collectées dans des tubes. La qualité de la molécule cible est testée pour chaque fraction par électrophorèse sur gel ou par d’autres techniques analytiques.

Jetons maintenant un coup d’œil à la chromatographie d’affinité ou AC, l’un des moyens les plus efficaces de purifier les protéines. De nombreuses biomolécules se lient sélectivement à certains ligands, une propriété que l’AC utilise en adhérant un ligand spécifique à la cible à la phase stationnaire.

Lorsque le mélange s’écoule à travers la colonne, les molécules cibles se fixent au ligand et le reste s’écoule à travers. Une fois que le mélange a traversé la colonne, la molécule cible peut être collectée par l’une des deux méthodes d’élution basées sur la spécificité.

On peut dire que l’élution biospécifique a un rôle « normal » ou « inverse ». Dans l’élution biospécifique à rôle normal, on ajoute un agent qui entre en compétition avec le ligand collé pour se lier à la biomolécule cible.

Dans l’élution biospécifique à rôle inverse, un agent entre en compétition avec la cible pour se lier au ligand collé. Le deuxième type d’élution, l’élution « non spécifique », abaisse la liaison cible-ligand en modifiant le pH, la force ionique ou la polarité de la solution. Si une protéine ne se lie pas à un ligand qui peut être immobilisé, la protéine peut être exprimée contenant une « étiquette » : de courtes séquences peptidiques conçues pour se lier au ligand.

L’une d’entre elles est la chromatographie d’affinité d’ions métalliques immobilisés, « IMAC », où un ligand métallique collé, comme le nickel ou le cobalt, se lie aux résidus d’histidine sur la protéine modifiée. Grâce à des techniques de biologie moléculaire, des protéines cibles sont générées avec des résidus d’histidine répétitifs, appelés marqueurs polyhistidines, qui se lient au métal via la chaîne latérale imidazole de l’histidine. Une fois liée, la protéine peut être collectée avec de l’imidazole libre par élution spécifique à rôle inverse et utilisée plus tard dans une grande variété d’applications en aval. Maintenant que vous avez vu la théorie de la chromatographie d’affinité, examinons une procédure IMAC en laboratoire.

Dans l’IMAC, la phase stationnaire peut être ajoutée directement au mélange de la phase mobile et de l’échantillon, permettant la liaison de la protéine his-marquée. Cette boue est ensuite versée dans la colonne, où les composés non liés s’égouttent dans les déchets, tandis que la boue reste. Le récipient à lisier est rincé pour recueillir la résine résiduelle et l’échantillon, qui est ajouté à la colonne.

La résine est agitée pour s’assurer que les composants non liés s’écoulent librement. L’ajout d’un tampon de lavage aide à les évacuer. Une fois que tous les composants non liés ont été éliminés, les déchets sont remplacés par un récipient pour collecter la protéine cible.

Un tampon contenant de l’imidazole est ajouté, agité et laissé au repos pour délier la molécule cible. L’imidazole se lie au métal, remplaçant et libérant la protéine marquée. La protéine libérée est collectée et l’étape de l’imidazole est répétée pour assurer une collecte totale. Pour purifier davantage l’échantillon, la SEC peut être exécutée sur l’échantillon avant l’analyse.

Maintenant que nous avons vu la théorie et le déroulement de ces deux techniques, examinons quelques-unes des façons dont elles sont appliquées dans le domaine biochimique.

Une raison courante de purifier les protéines est d’étudier leur rôle dans la maladie. La mucoviscidose est causée par des défauts de la protéine régulatrice de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose, ou CFTR. Après avoir cultivé la protéine avec un his-tag chez la levure, la chromatographie d’affinité et la chromatographie d’exclusion stérique permettent l’isolement de la protéine, suivie de l’étude de sa fonction.

Dans certains cas, la présence d’une étiquette polyhistidine peut modifier la structure d’une protéine, affectant ainsi sa fonction. Une autre étiquette courante est la protéine de liaison au maltose ou MBP, qui se lie à l’amylose liée dans une colonne. Le maltose est ensuite utilisé pour libérer le complexe. Le MBP peut ensuite être clivé et éliminé avec du SEC pour produire la protéine pure souhaitée.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’exclusion stérique et la chromatographie d’affinité. Il couvrait la théorie des techniques, passait en revue les procédures générales et couvrait certaines des utilisations des techniques.

Merci d’avoir regardé !