Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants

L’objectif global de ce protocole est d’introduire une méthode de coloration à l’argent optimisée pour une détection rapide, facile et peu coûteuse des marqueurs SSR dans les gels de polyacrylamide non dénaturants. Le génotypage rapide des marqueurs SSR peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche et de l’application génétiques, telles que l’analyse de la diversité génétique et la sélection assistée par marqueurs dans les programmes de sélection moléculaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à mettre en œuvre, qu’elle prend moins de temps et qu’elle utilise moins de réactifs chimiques que les autres protocoles de détection des marqueurs SSR.

Cette méthode évite les étapes de fixation, d’arrêt et de lavage que l’on trouve dans les protocoles conventionnels. Et ne nécessite que les deux étapes principales de l’imprégnation et du développement. Des images claires peuvent être produites à l’aide de ce protocole car aucun bruit de fond ne permet de détecter sans ambiguïté les modèles de bandes SSR.

On peut analyser environ 800 échantillons d’ADN par jour en utilisant cette technique, qui a été utilisée avec succès dans la recherche sur le tabac et le chou chinois en fleurs. Après avoir préparé les produits PCR et les solutions de gel conformément au protocole de texte, utilisez un détergent dans l’eau du robinet pour laver un ensemble de plaques de verre et d’entretoises, suivi d’un rinçage complet à l’eau distillée. Placez les plaques dans un séchoir à assiettes pour les faire sécher à l’air.

Dispersez un millilitre de solution de Bind-silane sur la surface intérieure d’une plaque de verre rectangulaire et séchez-la pendant cinq minutes. Ensuite, dispersez un millilitre de Repel-silane sur la surface intérieure d’une plaque de verre entaillée avec un coton-tige, et utilisez un papier de soie pour essuyer l’excès de solution avant de laisser la plaque sécher à l’air libre pendant cinq minutes. Assemblez les plaques de verre avec des entretoises avec la plaque crantée sur le dessus.

Et utilisez des pinces de coulée pour serrer les deux côtés de l’ensemble. Ensuite, versez une quantité appropriée de solution de gel de polyacrylamide non dénaturante à 6 % dans un bécher pour l’ensemble de plaques. Ajoutez 20 microlitres de TEMED et 200 microlitres de frais 20 %APS et mélangez délicatement.

Versez immédiatement et soigneusement la solution dans les plaques de verre assemblées le long du bord de la plaque crantée, en remplissant l’espace presque jusqu’en haut. Et insérez le peigne. Ajoutez ensuite un petit volume de solution de gel sur le peigne et laissez le gel prendre à température ambiante pendant 30 minutes.

Lorsque le gel est entièrement polymérisé, retirez les pinces de coulée et positionnez la plaque dans l’unité de réservoir d’électrophorèse avec la plaque crantée tournée vers le réservoir tampon supérieur. Utilisez de grandes pinces pour fixer le jeu de plaques à l’unité de réservoir. Versez un litre de tampon 0,5 X TBE dans chacune des chambres supérieure et inférieure.

Retirez ensuite le peigne et utilisez une pipette ou une seringue remplie de tampon pour bien rincer tous les puits. Pour faire fonctionner le gel de polyacrylamide, chargez environ un microlitre de produit PCR dans chaque puits. Chargez également une échelle d’ADN à chaque extrémité.

Fixez ensuite le couvercle de sécurité à la chambre tampon supérieure. Connectez les fils à l’alimentation, en faisant correspondre le code couleur rouge à rouge et noir à noir. Faites fonctionner le gel à une tension constante de 110 volts jusqu’à ce que le colorant atteigne une position définie.

Normalement, pendant environ 70 minutes. Après l’électrophorèse, ouvrez la vanne et vidangez le tampon de la chambre supérieure dans un grand bécher. Détachez les pinces latérales et retirez la plaque de l’appareil.

Ensuite, à l’aide d’une spatule, séparez soigneusement la plaque de verre crantée le long d’un côté et assurez-vous que le gel reste attaché à l’autre plaque de verre recouverte de Bind-silane. Ensuite, préparez un litre de solution d’imprégnation fraîche en dissolvant 1,5 gramme de nitrate d’argent dans un litre d’eau distillée. Préparez ensuite un litre de solution de développement fraîche en dissolvant 10 grammes d’hydroxyde de sodium dans 900 millilitres d’eau distillée.

Ajoutez un millilitre de formaldéhyde à 37 % et utilisez de l’eau distillée pour ajuster à un volume final d’un litre. Avec beaucoup d’eau distillée, rincez soigneusement le gel et la plaque de verre pour éliminer le tampon d’électrophorèse. Placez ensuite la plaque avec le gel vers le haut dans un plateau en plastique et immergez le gel dans un litre de solution d’imprégnation.

Secouez doucement le plateau sur un shaker à 60 tr/min pendant trois à quatre minutes. Transférez la plaque hors de la solution d’imprégnation dans un autre plateau. Ensuite, utilisez beaucoup d’eau distillée pour rincer la solution d’imprégnation résiduelle de la surface de la plaque et du gel deux fois pendant trois à cinq secondes chacune.

L’étape de lavage du gel après l’imprégnation est essentielle. Lavage insuffisant ma cause élimination incomplète de la solution d’imprégnation. Et aboutir à un arrière-plan sombre.

Placez l’endroit avec le gel vers le haut dans un autre plateau. Immergez la plaque dans un litre de solution de développement, puis secouez doucement le plateau à 50 tr/min pendant environ trois minutes. Surveiller l’apparition des fragments d’ADN et arrêter le développement lorsque le rapport le plus élevé entre le signal des fragments d’ADN et le bruit de fond est observé.

Le temps de développement approprié est une autre étape clé. Un développement excessif peut entraîner un fond brun foncé avec une image à faible contraste de fragments d’ADN. Rincez deux fois la plaque et le gel avec beaucoup d’eau distillée et utilisez du papier de soie pour sécher la plaque de gel.

Ensuite, utilisez un scanner et le logiciel approprié pour scanner le gel à 300 DPI et ajustez la luminosité et le contraste pour obtenir une visualisation claire des bandes d’ADN. Enfin, notez le motif de bandes des marqueurs SSR en fonction de la taille des fragments d’ADN dans l’image. Les amplicons PCR présentés ici ont été produits à l’aide des paires d’amorces SSR correspondantes dans le chou chinois et le tabac en fleurs.

Après électrophorèse, les gels de polyacrylamide ont été colorés à l’aide du protocole de coloration à l’argent démontré dans cette vidéo. Ce qui a détecté sans ambiguïté les motifs de bandes des marqueurs SSR. Pour comparer l’efficacité de détection de différents protocoles de coloration à l’argent, les produits PCR des marqueurs SSR ont été séparés à l’aide de PAGE et visualisés à l’aide de cinq protocoles de coloration à l’argent publiés et d’une sixième méthode démontrée dans cette vidéo.

Le protocole présenté ici avait le bruit de fond le plus faible et le contraste le plus élevé des fragments d’ADN, de sorte qu’il produisait la plus grande clarté d’image. Des six protocoles testés, la méthode présentée ici prend le moins de temps et nécessite le moins de réactifs chimiques et d’étapes de processus. Enfin, cette figure montre la sensibilité du protocole mesurée à l’aide d’une dilution en série d’un marqueur d’ADN de 50 à 2000 pb sur un gel de polyacrylamide non dénaturant de 10 nanogrammes par bande dans la voie 1 à 9,8 picogrammes par bande d’ADN dans la voie 11.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept minutes si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prévenir la contamination croisée des solutions d’imprégnation et de développement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour génotyper rapidement les marqueurs SSR.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter simplement et efficacement les marqueurs SSR dans un gel de polyacrylamide non dénaturant en utilisant la coloration à l’argent. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs chimiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des gants doivent toujours être portées lors de l’exécution de cette procédure.