Name: Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Découvrez une méthode de coloration argent rapide pour détecter les marqueurs SSR sur gel de polyacrylamide non dénaturant. Ce protocole simplifié réduit le temps de traitement à 7 minutes seulement.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par la Fondation de sciences naturelles de Chine Guangdong (2015A030313500), la plateforme de recherche clé International coopérative provinciale et les grands scientifiques recherche projet de Guangdong l’enseignement supérieur (2015KGJHZ015), la Science et Plan de la technologie du Guangdong Tobacco Monopoly Administration (201403, 201705), Science et technologie Plan de Guangdong de la Chine (2016B020201001), le projet de formation National d’Innovation pour les étudiants de premier cycle (201711078001). La mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cette publication est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou une approbation par le US Department of Agriculture. USDA est un fournisseur de l’égalité des chances et l’employeur.

1. préparation des produits PCR des microsatellites
<ol><li>Préparer tous les produits chimiques et réactifs pour les réactions de PCR dont l’ADN modèle (30 ng/µL), mélange maître de PCR × 2 (contenant 2 × PCR tampon, 0,4 mM de chaque dNTP, 3 mM de MgCl2, 0,1 U/µL de l’ADN polymérase Taq et colorants), 10 µM de chacun avant et marche arrière amorces et eau distillée ou désionisée (dH2O). NOTE : Les marqueurs utilisés dans la présente étude ont été PT51333 (séquence d’amorce en avant : 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' et séquence inverse apprêt : 5 « - TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3 ») et PT50903 (séquence d’amorce en avant : 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' et amorce sens inverse : 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') pour le tabac et CX-43 (séquence d’amorce en avant : 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' et inverser la séquence d’amorce : 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') et CX-157 (séquence d’amorce en avant : 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' et d’inverser la séquence de l’amorce : 5 « - GGACAGCTTCACACATTTGC - 3 ») de chou chinois floraison.</li>
	<li>Préparer 10 µL du mélange PCR amplification en ajoutant 2 µL de l’ADN, 5 µL du mélange maître de PCR × 2, 0.2 µL de chaque amorce vers l’avant et l’inverse amorce et 2,6 µL de dH2O.</li>
	<li>Effectuer la réaction d’amplification PCR dans un thermocycleur avec une étape initiale de 94 ° C pendant 5 min, procédez par 38 cycles de 45 s à 94 ° C pendant la dénaturation, 45 s à 55 ° C pour apprêt recuit et 1 min à 72 ° C pendant l’extension et une étape finale extension de 10 min à 72 ° C ; puis stockez les produits de PCR à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.</li>
</ol>2. préparation des Solutions de Polyacrylamide Gels Casting
<ol><li>Préparer 1 L de 5 × TBE tampon en dissolvant 54 g de base Tris et 27,5 g d’acide borique dans dH2O, en ajoutant 20 mL d’EDTA 0,5 M (pH 8,0) et en ajustant la solution pour un volume final de 1 000 mL avec dH2O. Remarque : Le tampon TBE peut être stocké à température ambiante pendant des mois.</li>
	<li>Préparer 2 L de tampon TBE 0,5 × en ajoutant 200 mL de tampon TBE × 5 dH2O pour un volume final de 2 L et conserver à température ambiante.</li>
	<li>Préparer une solution de gel de polyacrylamide non dénaturants 6 % en dissolvant 29 g d’acrylamide grade de biologie moléculaire et 1 g de qualité biologie moléculaire N, N'-methylenebisacrylamide dans le tampon TBE × 0,5 pour un volume final de 500 mL. Couvrir le flacon de solution avec le papier d’aluminium et de conserver à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. ATTENTION : L’Acrylamide est considéré comme une puissante neurotoxine et doit être manipulé avec soin. Toujours porter des gants pour le pesage de poudre et des solutions de manutention qui le contiennent.</li>
	<li>Préparer une solution à 20 % d’ammonium persulfate (APS) dissoudre 2 g de APS avec dH2O pour un volume final de 10 mL. Il peut être stocké à-20 ° C pour le mois. Remarque : Pour plus de commodité, 10 mL de solution APS 20 % peut être aliquoté dans 1,5 mL ou 2 mL de tubes à centrifuger pour conservation à-20 ° C. Décongeler et bien mélanger avant utilisation.</li>
	<li>Préparer une solution diluée de bind-silane en dissolvant 3 µL de bind-silane en 0,997 mL d’éthanol à 95º contenant 0,5 % d’acide acétique. Il peut être stocké à 4 ° C pendant des semaines. ATTENTION : Bind-silane est toxique, portez des gants lorsque vous manipulez la solution et garder la chambre ventilée.</li>
</ol>3. préparation des Gels de Polyacrylamide pour l’électrophorèse
<ol><li>Laver un ensemble de plaques de verre et les entretoises avec un détergent dans l’eau du robinet, suivie d’un rinçage complet avec dH2Air O. sécher les plaques en les définissant dans une plaque Etendoir.</li>
	<li>Disperser, 1 mL de solution de bind-silane sur la surface intérieure de la dalle de verre rectangulaire et sec pendant 5 min. Remarque : Si la solution de bind-silane n'est pas répartie uniformément sur la surface de la plaque, le gel peut être détaché pendant la coloration et entraîner un effet de coloration insatisfaisant.</li>
	<li>Disperse 1 mL de repousser-silane sur la surface intérieure d’une plaque de verre cranté avec un écouvillon, essuyer l’excès repousser-silane avec papier de soie et laisser sécher pendant 5 min. Remarque : Si le repel-silane ne pas uniformément enduire la surface de la plaque de verre, cela pourrait endommager le gel en privant partiellement.</li>
	<li>Assembler les plaques de verre avec entretoises avec la plaque de l’encoche sur le dessus et serrez les deux côtés de l’Assemblée avec coulée de pinces.</li>
	<li>Versez la quantité appropriée (40 mL) de solution d’un gel de polyacrylamide non dénaturants 6 % dans un bécher pour l’ensemble de la plaque de largeur 33 cm × 10 cm de hauteur et entretoise épaisseur de 1,5 mm, ajouter 20 µL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 200 µLfresh 20 % APS et mélanger doucement. Remarque : La quantité appropriée (40 mL) de solution de gel a été calculée à partir du volume interne des deux plaques d’entretoises (30 cm sur 8,5 cm × 0,15 cm) d’épaisseur. En ce qui concerne la quantité de TEMED et APS pour la polymérisation du gel, il y a un rapport standard de la solution de gel TEMED et APS basé sur la référence17. La solution de gel décrite ci-dessus est stockée à 4° C. Si la solution de gel est stockée à température ambiante, 20 µL de TEMED et 100 µL de 20 % APS doit être utilisé. Remuer doucement le mélange de la solution de gel avec une baguette de verre pour éviter les bulles d’air dans la solution.</li>
	<li>Versez la solution immédiatement et soigneusement dans les plaques de verre assemblées le long du bord de la plaque à encoche, remplir l’espace presque jusqu’au sommet et insérer le peigne. Ajouter un petit volume de solution de gel sur le peigne. NOTE : Gardez les plaques de verre horizontal pour éviter le gel de la fuite. Éliminez les bulles avec un crochet de bulle, si nécessaire.</li>
	<li>Laisser le gel à durcir durant 30 min à température ambiante. NOTE : Le temps de polymérisation peut changer avec la température de la solution de gel et de l’environnement.</li>
	<li>Une fois le gel est entièrement polymérisation, retirer les pinces de coulée et positionner la plaque sertie dans l’unité de cuve d’électrophorèse de la plaque crantée orienté vers le réservoir tampon supérieur et grand étau pour fixer la plaque réglé sur l’unité du réservoir.</li>
	<li>Versez 1 L de tampon TBE 0,5 × dans chacun de la tige et les cavités inférieures. Retirer le peigne et rincer tous les puits avec un tampon à l’aide d’une pipette ou une seringue. Remarque : Veiller à ce que le gel "sandwich" en bas de la plaque est complètement trempée dans un tampon sans les bulles.</li>
</ol>4. DEROULEMENT gelées
<ol><li>Charger environ 1 µL du produit PCR dans chaque puits du gel polyacrylamide. Charger une échelle de taille d’ADN sur les deux côtés du gel ainsi que des échantillons de produits PCR. Fixer le couvercle de sécurité à la chambre supérieure de tampon.</li>
	<li>Connectez les câbles d’alimentation, correspondant à la couleur rouge à rouge et noir sur noir. Exécutez le gel à une tension constante de 110 V jusqu'à ce que le colorant atteint une position définie, normalement pendant environ 70 min. NOTE : Le temps de la tension et la course est réglable selon la taille des produits PCR.</li>
</ol>5. coloration pour la détection de marqueurs microsatellites dans un Non-Gel de Polyacrylamide à l’argent
<ol><li>Après électrophorèse, vider la mémoire tampon de la chambre haute dans un grand bécher via la vanne. Détacher les pinces de côté, retirer les plaques de l’appareil, soigneusement séparer la plaque de verre entaillé le long d’un côté avec une spatule et veillez à ce que le gel reste attaché à l’autre plaque de verre recouverte de bind silane.</li>
	<li>Faire 1 L de solution d’imprégnation fraîches en dissolvant 1,5 g de AgNO3 dans 1 L de dH2O. préparer 1 L de solution de développement fraîches dissoudre 10 g de NaOH dans 900 mL de dH2O, ajouter 1 mL de 37 % de formaldéhyde et s’adapter à un volume final de 1 L à l’aide de dH2O. NOTE : Porter des gants et manipuler les produits chimiques ci-dessus et les solutions avec soin. Il n’est pas nécessaire de conserver les solutions et les étapes correspondantes avec les solutions dans l’obscurité.</li>
	<li>Rincez soigneusement la plaque de gel et verre avec ample dH2O pour retirer le tampon d’électrophorèse, puis placer la plaque avec le gel vers le haut sur un plateau en plastique et submerger le gel dans 1 L de solution d’imprégnation. Placez le plateau sur un agitateur.</li>
	<li>Secouez le plateau à 60 tr/min pendant 3-4 min. NOTE : Secouant de temps peut être ajustée selon l’épaisseur de gel et de la concentration de nitrate d’argent dans la solution d’imprégnation.</li>
	<li>Déplacez le plateau hors de la solution d’imprégnation et le déposer sur un autre bac. Rincer la solution d’imprégnation résiduel hors de la surface de la plaque et le gel à l’aide d’ample dH2O deux fois pour les 3-5 s de chaque.</li>
	<li>Placer la plaque avec le gel vers le haut sur un autre plateau, plonger la plaque dans 1 L de solution de développement, puis secouez le plateau à 50 tr/min pendant environ 3 min. surveiller l’apparition de l’ADN des fragments et arrêter le développement lorsque le ratio le plus élevé du signal de l’ADN de fragments au bruit de fond est observée (cette étape prend environ 3 min).</li>
	<li>Rincez la plaque et le gel avec un grand dH2O deux fois et sécher la plaque de gel avec un papier de soie.</li>
	<li>Scannez le gel à l’aide d’un scanner approprié. Une résolution de 300 dpi permet une visualisation claire de fragments d’ADN. Le gel peut également être photographié à l’aide d’une caméra.</li>
	<li>Le marquage chromosomique des microsatellites peut être marqué basée sur les fragments d’ADN dans l’image.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiang%2C+GL+%22Plant+breeding+from+laboratories+to+fields%22">Plant breeding from laboratories to fields</a>. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).</li>
<li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/1360138596868981">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li>
<li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genic+microsatellite+markers+in+plants%3A+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li>
<li>Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSR+markers%3A+a+tool+for+species+identification+in+Psidium+%28Myrtaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae).</a> Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li>
<li>Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+silver+staining+of+DNA+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).</li>
<li>Liang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+effective+method+for+silver+staining+of+PCR+products+separated+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).</li>
<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li>
<li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).</li>
<li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li>
<li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li>
<li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li>
<li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Data%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li>
<li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="https://scholars.opb.msu.edu/en/publications/a-low-cost-high-throughput-polyacrylamide-gel-electrophoresis-sys-3">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li>
<li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Le lavage de gel après l’imprégnation est une étape cruciale. Volume de l’eau et le temps lavage insuffisant pourrait l’élimination incomplète des solution d’imprégnation sur la surface de la plaque et le gel et provoquer dans un fond sombre. Le temps de développement approprié est une autre étape clé, développement excessif peut se traduire par un fond brun foncé avec une image de faible contraste de fragments d’ADN. En outre, l’étape d’imprégnation altèrent l’efficacité coloration des fragments d’ADN. Bien qu’allonger ...

Le développement de marqueurs PCR a révolutionné la science de la génétique des plantes et reproduction1. Marqueurs microsatellites (SSR) sont parmi les marqueurs d’ADN plus polyvalents et les plus couramment utilisés. Leur génome large couverture, abondance, spécificité du génome et répétabilité sont quelques-uns des mérites des microsatellites en plus de leur héritage codominant pour la détection des hétérozygotes génotypes2. Plusieurs études ont utilisé des microsatellites pour étudier la diversité génétique, suivre ascendance, établir des cartes de liaison génétique et cartographier les gènes pour les caractères économiquement importants3,4.
Produits PCR des microsatellites sont couramment séparés par électrophorèse sur agarose ou gel de polyacrylamide et puis visualisées avec coloration à l’argent ou sous une lumière UV après coloration au bromure d’éthidium. Coloration à l’argent de fragments d’ADN en gels de polyacrylamide est plus sensible que les autres coloration méthodes5,6 et a été largement utilisée pour détecter des fragments d’ADN comme marqueurs SSR7.
Comme de nombreuses techniques de laboratoire d’analyses biologiques, coloration à l’argent des gels de polyacrylamide a augmenté depuis son tout d’abord rapporté qu’une technique de visualisation de fragment dans 19798. La technique a été initialement modifiée pour la détection de fragments d’ADN par Bassam al. 6 en 1991 et ensuite amélioré par Sanguinetti et collaborateurs9 en 1994. La méthode a été optimisée en dernier quelques décennies6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Toutefois, la plupart de ces versions mises à jour des protocoles ont encore quelques inconvénients tels que la forte demande technique et long temps pour fixation de traitement et montage6, qui limitent l’application de ces protocoles7, 11. Un protocole optimal qui allie faible coût avec le rendement élevé de détection de fragment d’ADN est absolument nécessaire pour l’application systématique de coloration dans la recherche biologique à l’argent.
En outre, gel de polyacrylamide peuvent être divisée en dénaturants et non-dénaturisation de gels de polyacrylamide, et les deux peuvent être utilisés pour la détection des marqueurs à l’aide de la méthode de coloration à l’argent. L’effet et la résolution qui ne diffèrent pas significativement, mais non-dénaturisation de gels de polyacrylamide sont plus faciles à traiter et prendre moins de temps16.
Sur la base de la recherche précédente15, l’objectif de la présente étude est de décrire une coloration protocole en détail pour la détection rapide, facile et peu coûteux des microsatellites dans un gel de polyacrylamide non dénaturants optimisée à l’argent.

<table><tbody><tr><td>Master mix PCR (Green Taq Mix)</td><td>Vazyme Biotech Co. Ltd, Chine</td><td>#P131-03</td><td></td></tr><tr><td>50-2000 bp DNA Ladder</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>#170-8200</td><td></td></tr><tr><td>DL500 Marqueur d’ADN</td><td>Takara Bio Inc., Japon</td><td>#3590A</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Chine</td><td>#77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Chine</td><td>#10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, Chine</td><td>#6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Chine</td><td>#79-06-1</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-méthylène-bis-acrylamide</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Chine</td><td>#110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sangon Biotech Shanghai, Chine</td><td>#110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, Chine</td><td>#7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bind-silane</td><td>Solarbio Pékin, Chine</td><td>#B8150</td><td></td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chine</td><td>#7761-88-8</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Chine</td><td>#50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Usine</td> de <td>réactifs chimiques NaOH Guangzhou, Chine</td><td>#1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Usine de réactifs chimiques de Guangzhou, Chine</td><td>#64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Chine</td><td>#497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, Chine</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Usine de réactifs chimiques de Guangzhou, Chine#</td><td>7697-37-2</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3.5H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chine</td><td>#10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Eriochrome black T(EBT)</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, Chine</td><td>#1787-61-7</td><td></td></tr><tr><td>Plateau en plastique</td><td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,</td> <td>China-TS-1</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>Qilinbeter JiangSu,</td> <td>Chine-BenQ</td><td></td></tr> <tr><td>M800 Scanner</td><td>BenQ,</td><td></td> Chine-DYY-6C <td></td></tr><tr><td>Alimentation</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory,</td> <td>Chine-Haut</td><td></td></tr> <tr><td>tout au long des systèmes de gel verticaux, JY-SCZF</td><td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Chine</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

un rapide argent coloration protocole permettant simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un gel de polyacrylamide non dénaturants

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) est un des marqueurs plus efficaces utilisés dans la recherche en génétique animale et végétale et des programmes de sélection moléculaire. Coloration à l’argent est une méthode largement utilisée pour la détection des marqueurs dans un gel de polyacrylamide. Cependant, les protocoles classiques coloration à l’argent sont techniquement exigeants et chronophage. Comme de nombreux autres laboratoires biologiques techniques, protocoles de coloration à l’argent ont été constamment optimisés pour améliorer l’efficacité de la détection. Nous rapportons ici une coloration méthode significativement réduit les coûts de réactif et améliore la clarté de la résolution et la photo de détection simplifié à l’argent. La nouvelle méthode nécessite deux étapes principales (imprégnation et développement) et trois réactifs (nitrate d’argent, d’hydroxyde de sodium et formaldéhyde) et seulement 7 min de traitement pour un gel de polyacrylamide non dénaturant. Par rapport aux protocoles indiqués précédemment, cette nouvelle méthode est plus facile, plus rapide et utilise moins de réactifs chimiques pour la détection de la SSR. Par conséquent, ce protocole de coloration à l’argent simple, peu coûteux et efficace bénéficiera de cartographie génétique et la sélection assistée par une génération rapide de données marqueur SSR.

Les amplicons PCR ont été produits en utilisant les paires d’amorces SSR correspondantes en floraison pak-choï et le tabac. Après électrophorèse, les gels de polyacrylamide sont colorées à l’aide de l’argent qui précède souillant le protocole, qui a détecté sans ambiguïté les patrons des bandes des microsatellites (Figure 1).
Pour comparer l’efficacité de la détection des différent argent souillant ...

Nous rapportons ici un protocole qui nécessite seulement trois réactifs et 7 min de traitement et est adapté pour la Géneration rapide des données de SSR de qualité dans l’analyse génétique de coloration à l’argent simple et peu coûteuse.

Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

L’objectif global de ce protocole est d’introduire une méthode de coloration à l’argent optimisée pour une détection rapide, facile et peu coûteuse des marqueurs SSR dans les gels de polyacrylamide non dénaturants. Le génotypage rapide des marqueurs SSR peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche et de l’application génétiques, telles que l’analyse de la diversité génétique et la sélection assistée par marqueurs dans les programmes de sélection moléculaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à mettre en œuvre, qu’elle prend moins de temps et qu’elle utilise moins de réactifs chimiques que les autres protocoles de détection des marqueurs SSR.Cette méthode évite les étapes de fixation, d’arrêt et de lavage que l’on trouve dans les protocoles conventionnels. Et ne nécessite que les deux étapes principales de l’imprégnation et du développement. Des images claires peuvent être produites à l’aide de ce protocole car aucun bruit de fond ne permet de détecter sans ambiguïté les modèles de bandes SSR.On peut analyser environ 800 échantillons d’ADN par jour en utilisant cette technique, qui a été utilisée avec succès dans la recherche sur le tabac et le chou chinois en fleurs. Après avoir préparé les produits PCR et les solutions de gel conformément au protocole de texte, utilisez un détergent dans l’eau du robinet pour laver un ensemble de plaques de verre et d’entretoises, suivi d’un rinçage complet à l’eau distillée. Placez les plaques dans un séchoir à assiettes pour les faire sécher à l’air.Dispersez un millilitre de solution de Bind-silane sur la surface intérieure d’une plaque de verre rectangulaire et séchez-la pendant cinq minutes. Ensuite, dispersez un millilitre de Repel-silane sur la surface intérieure d’une plaque de verre entaillée avec un coton-tige, et utilisez un papier de soie pour essuyer l’excès de solution avant de laisser la plaque sécher à l’air libre pendant cinq minutes. Assemblez les plaques de verre avec des entretoises avec la plaque crantée sur le dessus.Et utilisez des pinces de coulée pour serrer les deux côtés de l’ensemble. Ensuite, versez une quantité appropriée de solution de gel de polyacrylamide non dénaturante à 6 % dans un bécher pour l’ensemble de plaques. Ajoutez 20 microlitres de TEMED et 200 microlitres de frais 20 %APS et mélangez délicatement.Versez immédiatement et soigneusement la solution dans les plaques de verre assemblées le long du bord de la plaque crantée, en remplissant l’espace presque jusqu’en haut. Et insérez le peigne. Ajoutez ensuite un petit volume de solution de gel sur le peigne et laissez le gel prendre à température ambiante pendant 30 minutes.Lorsque le gel est entièrement polymérisé, retirez les pinces de coulée et positionnez la plaque dans l’unité de réservoir d’électrophorèse avec la plaque crantée tournée vers le réservoir tampon supérieur. Utilisez de grandes pinces pour fixer le jeu de plaques à l’unité de réservoir. Versez un litre de tampon 0,5 X TBE dans chacune des chambres supérieure et inférieure.Retirez ensuite le peigne et utilisez une pipette ou une seringue remplie de tampon pour bien rincer tous les puits. Pour faire fonctionner le gel de polyacrylamide, chargez environ un microlitre de produit PCR dans chaque puits. Chargez également une échelle d’ADN à chaque extrémité.Fixez ensuite le couvercle de sécurité à la chambre tampon supérieure. Connectez les fils à l’alimentation, en faisant correspondre le code couleur rouge à rouge et noir à noir. Faites fonctionner le gel à une tension constante de 110 volts jusqu’à ce que le colorant atteigne une position définie.Normalement, pendant environ 70 minutes. Après l’électrophorèse, ouvrez la vanne et vidangez le tampon de la chambre supérieure dans un grand bécher. Détachez les pinces latérales et retirez la plaque de l’appareil.Ensuite, à l’aide d’une spatule, séparez soigneusement la plaque de verre crantée le long d’un côté et assurez-vous que le gel reste attaché à l’autre plaque de verre recouverte de Bind-silane. Ensuite, préparez un litre de solution d’imprégnation fraîche en dissolvant 1,5 gramme de nitrate d’argent dans un litre d’eau distillée. Préparez ensuite un litre de solution de développement fraîche en dissolvant 10 grammes d’hydroxyde de sodium dans 900 millilitres d’eau distillée.Ajoutez un millilitre de formaldéhyde à 37 % et utilisez de l’eau distillée pour ajuster à un volume final d’un litre. Avec beaucoup d’eau distillée, rincez soigneusement le gel et la plaque de verre pour éliminer le tampon d’électrophorèse. Placez ensuite la plaque avec le gel vers le haut dans un plateau en plastique et immergez le gel dans un litre de solution d’imprégnation.Secouez doucement le plateau sur un shaker à 60 tr/min pendant trois à quatre minutes. Transférez la plaque hors de la solution d’imprégnation dans un autre plateau. Ensuite, utilisez beaucoup d’eau distillée pour rincer la solution d’imprégnation résiduelle de la surface de la plaque et du gel deux fois pendant trois à cinq secondes chacune.L’étape de lavage du gel après l’imprégnation est essentielle. Lavage insuffisant ma cause élimination incomplète de la solution d’imprégnation. Et aboutir à un arrière-plan sombre.Placez l’endroit avec le gel vers le haut dans un autre plateau. Immergez la plaque dans un litre de solution de développement, puis secouez doucement le plateau à 50 tr/min pendant environ trois minutes. Surveiller l’apparition des fragments d’ADN et arrêter le développement lorsque le rapport le plus élevé entre le signal des fragments d’ADN et le bruit de fond est observé.Le temps de développement approprié est une autre étape clé. Un développement excessif peut entraîner un fond brun foncé avec une image à faible contraste de fragments d’ADN. Rincez deux fois la plaque et le gel avec beaucoup d’eau distillée et utilisez du papier de soie pour sécher la plaque de gel.Ensuite, utilisez un scanner et le logiciel approprié pour scanner le gel à 300 DPI et ajustez la luminosité et le contraste pour obtenir une visualisation claire des bandes d’ADN. Enfin, notez le motif de bandes des marqueurs SSR en fonction de la taille des fragments d’ADN dans l’image. Les amplicons PCR présentés ici ont été produits à l’aide des paires d’amorces SSR correspondantes dans le chou chinois et le tabac en fleurs.Après électrophorèse, les gels de polyacrylamide ont été colorés à l’aide du protocole de coloration à l’argent démontré dans cette vidéo. Ce qui a détecté sans ambiguïté les motifs de bandes des marqueurs SSR. Pour comparer l’efficacité de détection de différents protocoles de coloration à l’argent, les produits PCR des marqueurs SSR ont été séparés à l’aide de PAGE et visualisés à l’aide de cinq protocoles de coloration à l’argent publiés et d’une sixième méthode démontrée dans cette vidéo.Le protocole présenté ici avait le bruit de fond le plus faible et le contraste le plus élevé des fragments d’ADN, de sorte qu’il produisait la plus grande clarté d’image. Des six protocoles testés, la méthode présentée ici prend le moins de temps et nécessite le moins de réactifs chimiques et d’étapes de processus. Enfin, cette figure montre la sensibilité du protocole mesurée à l’aide d’une dilution en série d’un marqueur d’ADN de 50 à 2000 pb sur un gel de polyacrylamide non dénaturant de 10 nanogrammes par bande dans la voie 1 à 9,8 picogrammes par bande d’ADN dans la voie 11.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept minutes si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prévenir la contamination croisée des solutions d’imprégnation et de développement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour génotyper rapidement les marqueurs SSR.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter simplement et efficacement les marqueurs SSR dans un gel de polyacrylamide non dénaturant en utilisant la coloration à l’argent. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs chimiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des gants doivent toujours être portées lors de l’exécution de cette procédure.

a-fast-silver-staining-protocol-enabling-simple-efficient-detection

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Après la séparation par des méthodes électrophorétiques des protéines dans un gel peut être détectée par des méthodes de coloration de plusieurs. Coloration des protéines au bleu de Coomassie, coloration à l'argent, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sont démontrées dans cette vidéo.

Coloration protéines dans les gels

Cette vidéo est de populariser une colloïdale Coomassie G-250 protocole de coloration en fonction de...

Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche pour générer des sondes DNAzyme fluorogènes qui peuvent être appliqués à mettre en place un simple, «mix-and-lire" immunofluorescence pour la détection bactérienne. Ces sondes d'ADN spécifiques catalyser le clivage d'un chromophore de modification d'ADN-ARN substrat chimérique en présence d'un mélange brut extracellulaire (LEC) produite par une bactérie spécifique, traduisant ainsi la détection de bactéries dans la génération du signal de...

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode de coloration à l’argent des gels de polyacrylamide pour la visualisation des protéines totales à l’aide de sondes fluorogéniques.

Coloration fluorescente à l’argent : une technique pour visualiser les protéines totales dans les gels de polyacrylamide

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure de coloration combinée au bleu d’Alcian et à l’argent de fragments d’oligosaccharides de glycosaminoglycane sulfatés. Cette technique de coloration combinée amplifie considérablement les bandes de polymères de glycosaminoglycanes de différentes longueurs dans les gels de polyacrylamide.

Coloration à l’argent des glycosaminoglycanes sulfatés : une méthode de coloration pour la visualisation des glycosaminoglycanes sulfatés dans des gels de polyacrylamide

Cette vidéo présente une technique de séparation dénaturante à base de polyacrylamide pour les protéines. Cette technique permet d’identifier avant tout les protéines en fonction de leur poids moléculaire.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium pour l’analyse des protéines : une technique pour séparer et visualiser les protéines en fonction de leur poids moléculaire

Nous décrivons ici un protocole optimisé de électrophorétiques Assays Mobility Shift fluorescentes (FEMSA) en utilisant SOX-2 protéines purifiées avec infrarouges fluorescentes sondes d'ADN marquées par un colorant comme une étude de cas pour aborder une question biologique importante.

Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

Plus courantes analyse de contenu des contenus stomacaux des macroinvertébrés sont visuels. Exigeant la connaissance intense sur la diversité morphologique des proies, ils manquer doux corsé proies et, en raison de la forte fragmentation des proies, sont presque impossibles pour certains organismes, y compris les amphipodes. Nous fournissons des approches génétiques détaillées, roman de macroinvertébrés proie d’identification dans le régime alimentaire des amphipodes.

Protocole de laboratoire pour les Analyses de contenu Gut génétiques de macroinvertébrés aquatiques Using Group-specific ADNr amorces

Cette méthode permet la coloration sélective et quantification de l’ADN en gels en trempant le gel dans un SYBR Green I / Nitro tétrazolium bleu solution et puis exposer au soleil ou une source de lumière bleue. Cela produit un précipité visible et ne nécessite presque aucun équipement, ce qui est idéal pour utilisation sur le terrain.

ADN coloration méthode basée sur la précipitation de Formazan induite par l’exposition à la lumière bleue

Nous décrivons ici un protocole détaillé décrivant un fluorescent nouvelle coloration pour la détection de protéines totales dans les gels de polyacrylamide. Le protocole utilise une sonde de turn-on argent ionique spécifique fluorescence, qui permet de détecter Ag+-complexes de protéine et élimine certaines limitations des taches argent chromogène traditionnels.

Fluorescent coloration à l’argent des protéines dans les Gels de Polyacrylamide

Ce rapport décrit des techniques pour isoler et purifier les glycosaminoglycanes sulfatés (GAN) à partir d’échantillons biologiques et une approche d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour approximer leur taille. Les GG contribuent à la structure des tissus et influencent les processus de signalisation via l’interaction électrostatique avec les protéines. La longueur du polymère GAG contribue à leur affinité de liaison pour les ligands apparentés.

Détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent

Découvrez une méthode de coloration argent rapide pour détecter les marqueurs SSR sur gel de polyacrylamide non dénaturant. Ce protocole simplifié réduit le temps de traitement à 7 minutes seulement.

Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants (Vidéo) | JoVE Journal

Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants

Explorer plus de vidéos