Coloration fluorescente à l’argent : une technique pour visualiser les protéines totales dans les gels de polyacrylamide

La coloration fluorescente à l’argent des protéines dans les gels de polyacrylamide utilise des sondes fluorogéniques pour détecter et quantifier les protéines.

Commencez avec un gel de polyacrylamide avec des protéines, séparés en bandes par électrophorèse. Trempez-le dans un mélange fixateur d’éthanol et d’acide acétique, qui empêche les bandes de se diffuser en dénaturant les protéines.

Lavez le gel pour éliminer les résidus d’acide acétique et d’éthanol. Plongez le gel dans la teinture au nitrate d’argent. Les ions d’argent se lient fortement aux groupes chargés négativement dans les protéines.

Incuber dans l’obscurité. Rincez le gel à l’eau ultra-pure pour éliminer les complexes d’ions d’argent non liés.

Immergez le gel dans une solution en développement contenant une sonde fluorogénique multi-composants - TPE-4TA. Cette sonde anionique cible les ions d’argent liés à la protéine, formant des agrégats insolubles qui activent les propriétés fluorogéniques de la sonde, conférant ainsi une fluorescence.

Comme l’activation de la fluorescence dépend de l’agrégation, les sondes non liées n’émettent aucun signal, ce qui permet une coloration totale des protéines avec une émission de fond réduite.

Incuber le gel dans l’obscurité avec une agitation douce, assurant un développement fluorogénique complet. Transférez le gel dans un tampon de décoloration pour éliminer les sondes non liées. Enfin, imagez le gel pour obtenir l’intensité du signal de bande. Tracez l’intensité du signal de fluorescence par rapport à la courbe de protéine standard pour calculer la quantité totale de protéines dans l’échantillon.

Après l’électrophorèse, immergez le gel dans une solution de 100 millilitres contenant de l’éthanol et de l’acide acétique sur un agitateur orbital, et incubez deux fois pendant 30 minutes chacune, à température ambiante tout en agitant à 50 tr/min. Ensuite, lavez le gel trois fois avec de l’eau ultra-pure dans un récipient propre, chaque lavage durant 10 minutes.

Tout d’abord, dissolvez 0,01 gramme de nitrate d’argent dans 10 millilitres d’eau ultrapure pour préparer une solution mère avec une concentration de 0,1 %. Ajoutez 100 microlitres de cette solution mère dans 100 millilitres d’eau ultrapure pour obtenir la solution de travail au nitrate d’argent. Dans une hotte, immergez le gel dans 100 millilitres de la solution de travail de nitrate d’argent dans une chambre en verre scellée.

Utilisez du papier d’aluminium pour protéger le gel de la lumière pendant l’imprégnation et incubez pendant 1 heure en secouant à 50 tr/min sur un agitateur orbital. Après cela, lavez le gel deux fois avec de l’eau ultra-pure dans un récipient propre, chaque lavage utilisant environ 100 millilitres d’eau et durant 60 secondes.

Il est important d’utiliser de l’eau ultra-pure pour nettoyer le gel après l’étape d’imprégnation à l’argent afin de minimiser les taches de fond.

Tout d’abord, ajoutez 50 millilitres d’eau ultra-pure à 3 milligrammes de colorant TPE-4TA. Sonicez la solution pendant 3 minutes et ajoutez 5 microlitres de 1 solution molaire d’hydroxyde de sodium entre chaque séance de sonication, pour aider à dissoudre le colorant, généralement jusqu’à trois fois. Ensuite, vérifiez la fluorescence de la solution sous une lampe UV de 365 nanomètres pour vous assurer que le colorant est complètement dissous. Seules les solutions faibles ou non émissives indiquent une dissolution complète.

Pour préparer la solution de développement fluorogène, ajoutez 10 millilitres de la solution mère de TPE-4TA à 90 millilitres d’eau ultrapure. Utilisez un pH-mètre pour vérifier le pH de la solution. Réglez la solution à un pH compris entre 7 et 9, en utilisant une solution d’hydroxyde de sodium diluée ou d’acide acétique, si le pH est hors plage.

Ensuite, transférez le gel dans un récipient propre et refermable avec 100 millilitres de solution de développement fluorogénique, et assurez-vous que le gel est complètement immergé. Fermez le récipient et couvrez-le pour le protéger de la lumière. Agitez le récipient pendant la nuit sur un agitateur orbital à 50 tr/min et à température ambiante.

Transférez le gel dans un récipient propre et détachez-le dans 100 millilitres d’éthanol à 10 % pendant 30 minutes. Ensuite, rincez le gel à l’eau ultra-pure pendant 5 minutes. Le gel peut être visualisé sur un trans-illuminateur de paillasse, ou imagé sur une machine de documentation de gel au canal de 365 nanomètres ou au canal de 302 nanomètres.