La Lambda sélectionnez cII système de détection de Mutation

L’objectif global de ce protocole est de visualiser les procédures par étapes impliquées dans le test de mutation Lambda Select cII dans des cellules cultivées de rongeurs transgéniques ou des animaux correspondants traités avec des agents chimiques et physiques d’intérêt. Cette méthode d’essai peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les mutations, telles que : un composé d’essai est-il mutagène ? Et si c’est le cas, quelle est la puissance d’un mutagène ?

Induit-il des mutations spécifiques à une séquence ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle est un composé minime à pratiquement n’importe quel composé d’essai. La méthode peut être utilisée pour des tests de mutagénicité dans des cellules de mammifères à l’aide d’un gène rapporteur intégré chromosomiquement.

Pour constituer une réaction d’emballage unique, ajoutez cinq microgrammes d’ADN génomique dans un tube de micro-centrifugeuse contenant le premier mélange réactionnel. Ensuite, incubez le tube à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après l’incubation, ajoutez 12 microlitres du deuxième mélange réactionnel dans le tube et laissez reposer encore 90 minutes à 30 degrés Celsius.

Après 90 minutes, ajoutez 1,1 millilitre de tampon SM dans le tube. Ensuite, faites un vortex vigoureux dans le tube avec l’ADN emballé à température ambiante pendant environ 10 secondes. Donnez rapidement un tour d’impulsion dans la micro-centrifugeuse.

Laissez ensuite le tube sur de la glace jusqu’à utilisation. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de chloroforme pour chaque millilitre d’ADN emballé. Si l’échantillon ne doit pas être traité le jour même, agitez doucement l’échantillon et conservez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines.

Préparez 16 tubes stériles à fond rond et 16 plaques de gélose TB1 pour un seul échantillon d’ADN emballé. Utilisez dix tubes pour le criblage et six pour le titrage. Ensuite, aliquote 300 microlitres de culture de placage G1250 dans chaque tube à fond rond.

Ensuite, pour titir, ajoutez 10 microlitres d’ADN emballé à 990 microlitres de tampon SM et une dilution de 1:100. Ensuite, vortex l’échantillon. Ajoutez 20 ou 100 microlitres de la solution d’ADN 1:100 dans chacun des trois tubes de titre 20 ou 100 respectivement.

À des fins de dépistage, ajoutez 100 microlitres de l’échantillon d’ADN emballé non dilué dans chacun des 10 tubes de dépistage. Traitez l’ensemble des 16 tubes de titrage et de criblage. Agitez les tubes pendant 10 secondes pour mélanger les composants.

Ensuite, incubez les tubes à température ambiante pendant 30 minutes pour que l’hôte E.coli absorbe les phages. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de gélose supérieure TB1 fondue. Maintenez cette température de 55 degrés Celsius jusqu’aux tubes de titrage et de criblage appropriés.

Après l’ajout, tourbillonnez immédiatement les tubes doucement. Maintenant, versez la gélose TB1 dans le titre approprié ou la plaque de gélose TB1 de criblage. Laisser reposer les assiettes pendant 15 à 30 minutes à température ambiante.

Une fois que la gélose s’est solidifiée, retournez et laissez les 10 plaques de criblage dans l’incubateur fixe à 24 degrés Celsius pendant 46 à 48 heures. Laissez les six plaques de titre restantes dans un incubateur fixe à 37 degrés Celsius pendant la nuit ou une journée. Après l’incubation à 37 degrés Celsius, comptez le nombre de plaques formées dans toutes les plaques des 3 titres 20 et 100.

Après l’incubation à 24 degrés Celsius, comptez le nombre de plaques formées dans les 10 plaques de criblage. Pour vérifier les plaques mutantes putitives, carottez la plaque avec une pointe de pipette stérile à large calibre. Transférez ensuite la plaque dans un tube de micro-centrifugeuse stérile rempli de 500 microlitres de tampon SM stérile.

Ensuite, incubez le tube de micro-centrifugeuse à température ambiante pendant au moins deux heures à température ambiante. Ensuite, mélangez un microlitre de solution de phage carotté avec 200 microlitres de culture de placage G1250 dans un tube stérile à fond rond. Incuber ensuite le mélange à température ambiante pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, mettez la solution de phage évidée dans 2,5 millilitres de gélose supérieure TB1 fondue et incubez à 24 degrés Celsius pendant 46 à 48 heures. Une fois que les plaques secondaires sont visibles, utilisez une pointe de pipette pour prélever une seule plaque mutante Lambda cII bien isolée. Transférez plusieurs fois la plaque dans un tube de micro-centrifugeuse rempli de 25 microlitres d’eau distillée double dans une pipette.

Laissez le tube sur de l’eau bouillante pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez le tube à 18 000 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Immédiatement après la centrifugation, transférez 10 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse contenant 40 microlitres du mélange maître PCR.

Après amplification par PCR, purifier le produit para-amplifié à base 432 avec le gène cII et ses régions flanquantes incorporées à l’aide du kit de purification par PCR. Ensuite, séquencez le transgène cII à l’aide d’un analyseur d’ADN pour détecter les mutations. Les plaques obtenues dans les plaques du titre 20 et du titre 100 sont clairement visibles en les tenant à côté d’une boîte à lumière blanche et sur un fond sombre.

Ici, le graphique à barres illustre le pouvoir mutagène de divers produits chimiques dans les composés physiques testés. Cela se fait en analysant l’ampleur de l’augmentation de la fréquence relative du mutant cII isolée des blastes de fibres embryonnaires de souris. Le graphique à barres représente tous ces réactifs de test montrant une augmentation statistiquement significative de la fréquence du mutant cII.

Ensuite, les spectres de mutation du transgène cII dans les blastes de fibres embryonnaires de souris irradiés par UVB sont mis en évidence. Le graphique circulaire montre une augmentation significative de la fréquence relative de la transition de la cytidine à la thymidine simple ou en tandem au niveau des dinucléotides de pyrimidine par rapport au témoin. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit à dix heures si elle est correctement exécutée, hors temps de préparation à la plaque de stries bactériennes en culture.

Dans le séquençage de l’ADN, après l’évaluation des mutants cII. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’analyse de mutation d’un composé testé dans un système modèle in vitro.