Name: La Lambda sélectionnez cII système de détection de Mutation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Apprenez le test de mutagénicité Lambda cII dans des cellules de rongeurs transgéniques. Cette méthode évalue la puissance des agents chimiques et physiques grâce à un gène rapporteur intégré chromosomiquement.

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Nous tenons à souligner la contribution de tous les collègues et collaborateurs à nos études originales, dont les résultats ont été relatés dans ce manuscrit (à titre illustratif). Les auteurs est pris en charge par des subventions du National Institute of Dental et Craniofacial Research de la National Institutes of Health (1R01DE026043) à AB et de l’Université de California Tobacco-Related programme de recherche de la maladie à (AB TRDRP-26IR-0015) et ST (TRDRP-25IP-0001). Les auteurs de l’étude n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données, analyse de données, interprétation des données, rédaction du rapport ou dans la décision de soumettre pour publication.

1. génomiques isolement des fibroblastes embryonnaires de souris
Remarque : Les fibroblastes embryonnaires de souris primaire sont isolés des embryons provenant de souris transgéniques BB avec le bagage génétique de C57BL/6, selon le protocole publié53. Le produit de départ pour ce protocole se compose de 1 x 106 à 1 x 107 cellules de fibroblastes embryonnaires traitées avec un contrôle composé par rapport de test. La récolte et le comptage de ces cellules à l’aide de méthodes standard sont décrits dans les références10,,du5455.
<ol><li>Préparer un (0,3 M saccharose, KCl 60 mM, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, la spermidine 0,5 mM, spermine de 0,15 mM et 2 mM EDTA) de tampon, tampon B (150 mM NaCl et 5 mM EDTA, pH 7,8) et tampon C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM NaCl, EDTA de 20 mM et 1 % SDS) longtemps à l’avance et conserver à température ambiante (RT) jusqu'à une année54,55.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans le tampon de 2 à 4 mL dans un tube à centrifuger conique 15 mL en pipettant également, à plusieurs reprises et descendre à l’aide d’une échelle d’alésage pointe de pipette 1 000 µL.</li>
	<li>Ajouter un volume (2 à 4 mL) tampons A contenant 1 % octylphenoxypolyethoxyethanol (p. ex., Nonidet P40) à l’aide d’une pipette sérologique de verre.</li>
	<li>Incuber le tube sur la glace pendant 5 min.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver le culot avec 10 à 15 mL de tampon une aide d’une pipette sérologique de verre.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 2 à 4 mL de tampon B.</li>
	<li>Ajouter un volume (2 à 4 mL) tampon C contenant 600 µg/mL protéinase K.</li>
	<li>Incuber le tube pendant 3 h à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter RNase A à une concentration finale de 100 µg/mL.</li>
	<li>Incuber le tube pendant 1 h supplémentaires à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter un phénol de volume (2 à 4 mL) (saturé en 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0) alcool :chloroform:isoamyl (25:24:1 vol/vol). NOTE : Phénol peut poser un danger pour la santé graves et doit être manipulé avec une extrême prudence. Phénol est très corrosive pour la peau et facilement absorbé à travers elle et présente d’autres effets. Lorsque manipulation phénol, utilisez toujours le double gantage, portez des lunettes de protection et travailler sous une hotte chimique.</li>
	<li>Bien mélanger en renversant le tube pendant 5 min sur un rotateur de tube à 4 ° C.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Éliminer la phase aqueuse (couche supérieure) dans un nouveau tube à l’aide d’une pipette sérologique de verre.</li>
	<li>Répéter l’extraction de phénol : chloroforme : isoamylique Alcool 1 à 3 fois jusqu'à ce que la phase aqueuse est claire et l’interface n’est plus trouble.</li>
	<li>Ajouter l’acétate de Sodium 3M volume 1/10 (200 – 400 µL), pH 5,2.</li>
	<li>Ajouter 2,5 volume (5 à 10 mL) 100 % d’éthanol (réfrigéré) et inverser le tube doucement à la main pendant 2 à 3 min.</li>
	<li>La bobine de l’ADN avec un crochet de verre et le transférer dans un nouveau tube contenant 1 – 5 mL 70 % éthanol et laver soigneusement. Alternativement, centrifuger le tube à haute vitesse (x 3 500 g) à 4 ° C à l’ADN de granule et laver soigneusement avec de 1 à 5 mL 70 % éthanol.</li>
	<li>Centrifuger le tube à haute vitesse (x 3 500 g) à ta, éliminer le surnageant et sécher l’ADN pendant 10-15 min.</li>
	<li>Dissoudre l’ADN de 10 à 100 µL de tampon de TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5) et stocker à 4 ° C (pour stockage courte d’environ un mois) ou à-20 ° C (pour une plus longue période de stockage). La concentration optimale pour l’ADN pour le dosage de Select cII λ est de 0,5 à 1,0 µg/µL (dans un tampon TE)56.</li>
</ol>2. in Vitro emballage réaction
<ol><li>Par une réaction d’emballage, addition de ~ 5 µg d’ADN génomique (volume final : 8 – 12 µL, ADN génomique a été isolé dans la Section 1 de souris fibroblastes embryonnaires traités in vitro avec une substance d’essai ou de contrôle) dans un tube de microtubes contenant le premier mélange réactionnel (~ 10 µL). NOTE : Interne établi ou λ commercialement disponible emballage extraits sont utilisés dans des laboratoires différents. Dans l’emballage commercial extrait kit utilisé ici56 (voir la Table des matières), tubes rouges figurant le premier mélange de réaction (~ 10 µL) et les tubes bleus contenaient le deuxième mélange de réaction (~ 70 µL pour au moins 5 réactions).</li>
	<li>Incuber le tube pendant 90 min à 30 ° C.</li>
	<li>Ajouter le volume requis (~ 12 µL) de la deuxième mélange de réaction dans le tube.</li>
	<li>Incuber le tube pour une supplémentaire de 90 min à 30 ° C.</li>
	<li>
Ajouter 1,1 mL de tampon de SM dans le tube. NOTE : 1 mL de cette solution (c.-à-d., mélange réactionnel emballages) sera utilisé pour dépistage λ cII-mutants. Le reste servira pour le titrage.<ol>
<li>Préparer le tampon SM en mélangeant 5,8 g de NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) et gélatine de 2 % (p/v) de 5 mL. Ajouter dH2O pour un volume final de 1 litre, autoclave pendant 30 min. magasin à température ambiante pendant 1 an.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vortex le tube contenant l’échantillon d’ADN emballée pour 10 s à ta (agitation vigoureuse).</li>
	<li>Impulsion tourner le tube dans un magasin sur la glace et de microcentrifuge jusqu'à utilisation. Si l’échantillon ne va pas être utilisé le jour même de l’emballage, ajouter 50 µL de chloroforme par mL d’ADN emballée échantillonner, vortex, doucement et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.</li>
</ol>3. préparer la Culture bactérienne d’e. coli G1250
<ol><li>
Au moins deux jours avant l’ensemencement, faire quelques plaques de strie bactérienne d' Escherichia coli (e.coli) G1250 sur plaques de gélose TB1-kanamycine.
	<ol>
<li>Préparer des boîtes de gélose de TB1-kanamycine comme suit. Mix 5,0 g de NaCl peptone de caséine 10,0 g et 12,0 g de gélose. Ajouter 800 mL dH2O. Ajouter 1 mL 0,1 % Thiamine chlorhydrate. Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH ou HCl. Add dH2O pour un volume final de 1 litre.</li>
		<li>Bien mélanger et stériliser pendant 30 min. laisser refroidir jusqu'à 55 ° C. Ajouter 50,0 mg kanamycine et mélanger. Verser dans des plats de Pétri stériles 100 mm (20 à 25 mL par plat). Stocker les plaques à 4 ° C pendant deux semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber les boîtes de strie bactérienne dans un incubateur fixe 30 ° C pendant au moins 24 h.</li>
	<li>
Un jour avant l’ensemencement, mélanger 10 mL de milieu liquide TB1 avec 100 µL de solution de4 M MgSO maltose-1 20 % (p/v) dans un tube à fond conique stérile de 50 mL à bouchon vissé.
	<ol>
<li>Préparer un milieu liquide TB1 comme suit. Mix 5.0 g NaCl peptone de caséine 10,0 g, ajouter 800 mL dH2O, chlorhydrate de Thiamine de 0,1 % de 1 mL et ajuster le pH à 7,0 avec NaOH ou HCl. Puis ajoutez dH2O pour un volume final de 1 litre, bien mélanger et stériliser pendant 30 min. stockent le milieu à RT jusqu'à trois mois.</li>
		<li>Préparer 20 % (p/v) Maltose-1 M MgSO4 comme suit. Mélanger 20,0 g Maltose et 24,6 g MgSO4. 7H2O, puis ajoutez dH2O pour un volume final de 100 mL. Filtre à stériliser et conserver à 4 ° C pendant 6 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensemencer le milieu liquide contenant plusieurs colonies de la plaque de strie bactérienne à l’aide d’un stérile de boucle inoculer56.</li>
	<li>Incuber le milieu liquide du jour au lendemain à 30 ° C secouant incubateur avec agitation vigoureuse (250 – 300 tr/min).</li>
	<li>Le jour de l’électrodéposition, centrifuger le tube conique contenant la culture liquide G1250 à 1 500 x g pendant 10 min à RT pour granuler les cellules bactériennes.</li>
	<li>Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de 10 mM MgSO4.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance d’un 01:10 par dilution de la suspension cellulaire à longueur d’onde 600 nm à l’aide d’un UV-Vis spectrophotomètre (p. ex., 100 µL de la suspension cellulaire + 900 µL 10 mM MgSO4)56.</li>
	<li>Diluer la suspension cellulaire à une finale de l’OD600 de 0,5 à 10 mM MgSO4. La suspension préparée de G1250 e. coli avec OD600 = 0,5 est dénommé « la culture d’électrodéposition G1250 ».</li>
	<li>Conserver la culture de placage de G1250 sur la glace et l’utilisation dans 1-2 h.</li>
</ol>4. les échantillons d’ADN emballées de placage
<ol><li>
Par un échantillon d’ADN emballé, préparer les seize stérile 14 x 100 mm2 fond rond tubes et des plaques de gélose TB1 seize. Dix de chaque jeu sera utilisé pour le dépistage et six pour le titrage (trois pour le titre 20) et trois pour titre 100.
	<ol>
<li>Préparer des boîtes de gélose de TB1 comme suit. Mix 5.0 g NaCl peptone de caséine 10,0 g et 12,0 g Agar, puis ajoutent 800 mL dH2O et chlorhydrate de Thiamine 0,1 % 1 mL. Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH ou HCl et ajoutez dH2O pour un volume final de 1 L.</li>
		<li>Bien mélanger et stériliser pendant 30 min. laisser le mélange refroidir à 55 ° C, puis versez-la dans des plats de Pétri stérile 100 mm (20 à 25 mL par plat). Stocker les plaques à 4 ° C pendant deux semaines. Remarque : Les géloses TB1 doivent être préparés au moins 24 h avant son utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquote 200 µL de la culture de placage G1250 dans chaque tube à fond rond.</li>
	<li>
Pour le titrage, faire une dilution au 1/100 de l’échantillon d’ADN emballée et mélanger bien au Vortex (c.-à-d., 10 µL emballés d’échantillon ADN + 990 µL de tampon de SM).</li>
	<li>Ajouter 20 µL de la dilution au 1/100 à chacun des trois tubes de 20 titres.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de la dilution au 1/100 à chacun des trois titre 100 tubes.</li>
	<li>
Pour le dépistage, ajouter 100 µL de la 'pur ' emballé échantillon d’ADN de chacun des tubes de dix projection.</li>
	<li>Traiter tous les tubes titrage et dépistage (tubes de 2 x 3 + 10 = 16), comme suit : mélangez bien au Vortex pendant environ 10 s et puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre à l’hôte de e. coli pour adsorber les phages.</li>
	<li>
Ajouter 2,5 mL TB1 fondu au micro-ondes haut agar (refroidi à 55 ° C) pour chaque titre ou dépistage tube, mélanger immédiatement au Vortex (doucement), et verser dans le titre approprié ou plaques de gélose TB1 de dépistage.
	<ol>
<li>Préparer TB1 albums agar comme suit. Mix 5.0 g NaCl peptone de caséine 10,0 g et 7,0 g Agar, puis ajouter le chlorhydrate de Thiamine de 0,1 % mL 800 dH2O. Ajouter 1 mL, puis ajuster le pH à 7,0 avec NaOH ou HCl. Enfin, ajoutez dH2O pour un volume final de 1 litre.</li>
		<li>Bien mélanger et stériliser pendant 20 à 25 min. magasin à la température ambiante pendant trois mois.</li>
		<li>Avant utilisation, faire fondre l’agar d’Albums de TB1 préparé dans un four à micro-ondes, bien mélanger et laisser refroidir à 55 ° C dans un bain d’eau. Remarque : Le haut de TB1 fondu et refroidi est ajouté au contenu de chaque titre ou tube de dépistage et après avoir mélangé, est versé dans le titre approprié ou les boîtes de gélose de dépistage TB1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laisser les plaques pendant 15 à 30 min à température ambiante, avec le couvercle entrouvert pour éviter la condensation.</li>
	<li>Inverser les plaques et placer les plaques de dix projection dans un incubateur stationnaire 24 ° C et incuber pendant 46 à 48 h (p. ex., conditions sélectives) et les six plaques de titre dans un incubateur stationnaire 37 ° C et incuber pendant 24 h/nuit (c.-à-d., conditions non sélectifs). Remarque : Pour l’assurance de la qualité et la normalisation des résultats, contrôle disponible dans le commerce phage solutions contenant un mélange de type sauvage et mutantes cII et mutants connus sont plaquées avec les échantillons d’ADN emballées et incluses dans tous les test court56.</li>
</ol>5. examen du titre et des planches de dépistage pour déterminer la cII Mutant fréquence
<ol><li>Après les 24 h/nuit d’incubation à 37 ° C, compter le nombre de plaques formé dans chacune des trois titre 20 plaques et titre 100 plaques. Pour identifier plus facilement les plaques, tenir la plaque à côté d’une boîte à lumière blanche et sur un fond sombre avec couvercle enlevé (voir Figure 2).</li>
	<li>Faire une moyenne (moyenne) du nombre de plaques comptée dans chaque titre 20 plaques et titre 100 (triple, chacune).</li>
	<li>Choisissez le nombre moyen de l’ensemble des plaques de titre qui tombe le plus proche de la plage de 50 à 200 plaques par plaques ensemble.</li>
	<li>Calculer le nombre total de plaques projeté dans les plaques de dix projection comme suit : Total des plaques projetés = (nombre moyen de plaques dans le groupe choisi de titre plaques ÷ nombre de µL de la dilution utilisée par plaque de titre choisi) x facteur de Dilution x nombre de µL de l’échantillon d’ADN emballée par dépistage [100 µL/plaque] x nombre de dépistage des plaques [10]. NOTE : par exemple, si le nombre moyen des plaques par plaques dans l’ensemble du titre 20 plaques est 128 et le nombre correspondant à l’ensemble du titre 100 plaques est 478, le nombre 128 serviront pour le calcul du nombre total de plaques projeté , comme suit : (128 ÷ 20) x 100 [facteur de dilution] x 100 [µL/plaque] x 10 [plaques] = 640 000 Cela revient à multiplier le nombre moyen des plaques de 5 000 ou 1 000, si le nombre moyen est issu des comtes de titre 20 plaques ou titre 100 plaques, respectivement.</li>
	<li>Suite de 46 à 48 h d’incubation à 24 ° C, compter le nombre total de plaques formées dans les plaques de dix projection (suivez les instructions fournies dans la Section 5.1). Remarque : La fréquence des mutants cII est calculée en divisant le nombre total de plaques formées dans les plaques de dépistage par le nombre total de plaques projeté. À l’aide de l’exemple ci-dessus, si le nombre total de plaques comptées dans les plaques de dix projection est 112, la fréquence des mutants cII pour cet échantillon d’ADN serait 112 ÷ 640 000 = 17,5 x 10-5.</li>
</ol>6. vérification de la Putative λ cII Mutants, Amplification par PCR et séquençage de l’ADN
<ol><li>La plaque en question avec un embout de la pipette stérile, de large diamètre de noyau et expulser (par pipetage de haut en bas) dans un tube de microcentrifuge stérile contenant 500 µL de tampon stérile de SM.</li>
	<li>Incuber pendant au moins 2 h à température ambiante, ou à 4 ° C durant la nuit, pour permettre les particules phagiques éluer avec l’agar plug.</li>
	<li>Dans un tube à fond rond2 stérile 14 x 100 mm, 200 µL de la culture de placage G1250 se mêlent 1 µL de la solution de phage fourrés et incuber 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Plaque à l’aide de 2,5 mL de 55 ° C fondu TB1 albums agar et incuber la plaque à 24 ° C pendant 46 – 48 h (conditions sélectives), tel que décrit dans les Sections 4.8 – 4.10.</li>
	<li>Une fois les plaques secondaires ont formé, utiliser un embout de la pipette pour prélever soigneusement un λ vérifié bien isolé seul cII-plaque mutant (évitez de toucher l’agar inférieur). NOTE : Peuvent les plaques mutant putatif cII sert à deux fins : (i) objets de placage peut parfois être confondu avec plaques de petite taille ; et (ii) une carotte d’agarose d’une plaque de dépistage peut-être contenir des phage(s) non-mutant avec un phage mutant. Plaques secondaires d’une faible densité peuvent fournira un modèle mutant non contaminé pour PCR et l’analyse subséquente de la séquence ADN.</li>
	<li>Transférer la plaque dans un tube de microcentrifuge contenant de l’eau bidistillée 25 µL par pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Placer le tube dans l’eau bouillante pendant 5 min.</li>
	<li>Centrifuger à vitesse maximale (18 000 x g) pendant 3 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Transférer 10 µL du liquide surnageant immédiatement dans un nouveau tube de microcentrifuge contenant 40 µL d’une PCR mastermix dans laquelle les concentrations finales des réactifs sont 1 x Taq PCR tampon, 10 pmol chaque des amorces et inverses, 12,5 nmol de chaque dNTP et 2.5 U du Taq ADN polymérase. Remarque : Les amorces et inverses sont comme suit : 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (postes -68 à -50 par rapport à la cII start codon) et 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (postes +345 à 365 par rapport à la cII codon de début), respectivement.</li>
	<li>Amplifier le modèle en utilisant les paramètres suivants : une dénaturation de 3 min à 95 ° C, suivi de 30 cycles de 30 s à 95 ° C, 1 min à 60 ° C et 1 min à 72 ° C, avec une extension finale de 10 min à 72 ° C.</li>
	<li>Purifier le produit PCR bp 432 contenant le gène de la cII et bordant les régions à l’aide de kits de purification PCR commercialement disponibles, selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Effectuer le séquençage de l’ADN à l’aide d’une plate-forme de séquençage approprié et d’analyser les séquences d’ADN qui en résultent afin de détecter des mutations dans le transgène cII (voir remarque ci-dessous). NOTE : Ceci est mieux assurée en alignement avec la séquence de cII de référence en utilisant le logiciel, comme le serveur d’alignement de séquence T-café basée sur le web. Pour obtenir des instructions sur la façon d’utiliser le programme, visitez : <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le test de sélection cII λ est utilisé pour la détection des mutations dans le transgène cII récupéré de l’ADN génomique de cellules provenant d’organes/tissus de BB rongeurs3. Le génome de ces animaux transgéniques contient plusieurs copies en tandem du vecteur navette λLIZ chromosomiquement intégrées, qui transporte la cII (294 bp) et lacI (1 080 bp) transgènes, comme le Rapporteur mutationnel gènes1, 2</sup...

Un large éventail de modèles animaux transgéniques et les systèmes de détection de mutation ont été développés pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères. Parmi ceux-ci, des souris transgéniques de Big Blue (dénommé ci-après BB) et le λ Select cII système de détection de Mutation ont été employées pour des expériences de mutagénicité par ce groupe et de nombreuses autres recherches groupes dans le monde1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Pour les 16 dernières années, nous avons étudié les effets mutagènes des divers agents physiques ou chimiques, à l’aide de ces animaux transgéniques ou traitement avec un composé leurs cultures de cellules de fibroblastes embryonnaires correspondant et par la suite analysé la phénotype et génotype du transgène cII par le λ Select cII dosage et le séquençage de l’ADN, respectivement10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. le génome de ces animaux transgéniques contient un vecteur bactériophage λ navette (λLIZ) intégré sur le chromosome 4 une multi-copie tête-à-queue concatemer1,2,25. Le vecteur navette λLIZ porte deux gènes mutationnelle, à savoir la lacI et cII transgènes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. le λ Select cII est basé sur la récupération des vecteurs navettes λLIZ partir de l’ADN génomique des cellules provenant d’organes/tissus d’animaux transgéniques1,2,25 . Les vecteurs navettes λLIZ récupérés sont ensuite emballés dans têtes de phage λ capables d’infecter un hôte indicateur Escherichia coli. Par la suite, les bactéries infectées sont cultivés en sélectif permettant de notation et de l’analyse des mutations dans le cII transgène1,3.
Ici, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour le dosage de Select cII λ, qui se compose de l’isolement de l’ADN génomique des cellules et des organes d’animaux transgéniques traités in vitro/in vivo avec un test de récupération composé, de le λLIZ navette vecteurs de l’ADN génomique, emballage des vecteurs dans des phages λ infectieuse, une infection de l’hôte Escherichia coli avec les bactériophages, identification de la cII-mutants dans des conditions sélectives afin de déterminer la fréquence des mutants cII , et Analyse de séquence d’ADN pour établir le spectre de mutation cII . Le protocole peut être appliqué aux souris/rat transgénique cell cultures traitées in vitro avec un agent chimique/physique des intérêts, ou tissus/organes des animaux correspondants traités in vivo avec le test agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Une présentation schématique de l’essai de Select cII λ est illustrée à la Figure 1.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratories, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Qualité bactériologique</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Kit de séquençage de cycle</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Caséine Peptone</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>QIAkit de purification PCR rapide</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 réactions de purification PCR</td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Taq5000 ADN Polymérase&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>Aucun Chlorhydrate</td></tr> de <tr><td>thiamine</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract</td><td>Stratagene Corp., acquis par BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 réactions d’emballage</td></tr><tr><td>Tris Base Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>Aucun</td></tr></tbody></table>

la lambda sélectionnez cii système de détection de mutation

The Lambda Select cII Mutation Detection System

Un certain nombre de modèles animaux transgéniques et les systèmes de détection de mutation ont été développé pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères. Parmi ceux-ci, les souris transgéniques et le Lambda (λ) Select cII système de détection de Mutation ont été employés pour des expériences de mutagénicité par de nombreux groupes de recherche dans le monde entier. Ici, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour le test de mutation cII sélectionnez Lambda, qui peut être appliqué à des cellules de souris/rats transgéniques ou les animaux correspondants traitement avec un agent chimique/physique d’intérêt. Le protocole se compose des étapes suivantes : (1) isolement de l’ADN génomique des cellules ou des organes/tissus d’animaux transgéniques traitent in vitro ou in vivo, respectivement, avec un composé ; (2) récupération du vecteur navette lambda portant un gène de journaliste mutationnelle (c.-à-d., cII transgène) de l’ADN génomique ; (3) emballage des vecteurs sauvés dans les bactériophages infectieuses ; (4) infectant une bactérie hôte et mise en culture dans des conditions sélectives pour permettre la propagation des mutations induites cII ; et (5) marquant la cII-mutants et ADN de séquence analyse afin de déterminer la fréquence des mutants cII et spectre de mutation, respectivement.

Fonction de distribution de données, tests paramétriques ou non paramétriques sont utilisés pour déterminer l’importance de la différence dans la fréquence des mutants cII entre les groupes de traitement et de contrôle (c'est-à-direinduite par rapport aux fréquences mutants spontanés) . Comparaison des fréquences mutant induit cII inter-groupe de différence de traitement faite par divers (par paire) les tests statistiques, selon le cas. Le hypergéométriques test...

Les auteurs décrivent un protocole détaillé pour le test de la mutation de la cII Lambda sélectionnez en cellules de rongeurs transgéniques ou les animaux correspondants traités avec un agent chimique/physique d’intérêt. Cette approche a été largement utilisée pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères.

La Lambda sélectionnez cII système de détection de Mutation

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

L’objectif global de ce protocole est de visualiser les procédures par étapes impliquées dans le test de mutation Lambda Select cII dans des cellules cultivées de rongeurs transgéniques ou des animaux correspondants traités avec des agents chimiques et physiques d’intérêt. Cette méthode d’essai peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les mutations, telles que : un composé d’essai est-il mutagène ? Et si c’est le cas, quelle est la puissance d’un mutagène ?Induit-il des mutations spécifiques à une séquence ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle est un composé minime à pratiquement n’importe quel composé d’essai. La méthode peut être utilisée pour des tests de mutagénicité dans des cellules de mammifères à l’aide d’un gène rapporteur intégré chromosomiquement.Pour constituer une réaction d’emballage unique, ajoutez cinq microgrammes d’ADN génomique dans un tube de micro-centrifugeuse contenant le premier mélange réactionnel. Ensuite, incubez le tube à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après l’incubation, ajoutez 12 microlitres du deuxième mélange réactionnel dans le tube et laissez reposer encore 90 minutes à 30 degrés Celsiu

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici nous démontrons un protocole simple de créer une bibliothèque aléatoire mutant pour une séquence cible donnée. Nous montrons comment cette méthode, qui est réalisée in vivo chez Escherichia coli, peuvent être couplées avec des sélections fonctionnelles d'évoluer de nouvelles activités enzymatiques.

Protocoles de sélection mutagenèse et fonctionnelles pour l&#39;évolution dirigée de protéines dans les E. coli</em

Cette vidéo démontre le rôle de la réaction en chaîne par polymérase numérique dans l’identification de la mutation indel dans un échantillon d’ADN. La haute précision et la sensibilité de la ddPCR permettent une détection précise et cohérente des mutations rares présentes dans un échantillon, même à de faibles niveaux. Il permet d’identifier et de quantifier les mutations indel dans différentes régions du génome, fournissant ainsi des informations précieuses sur les mécanismes de mutation et...

Réaction en chaîne par polymérase numérique pour la détection de mutations indel dans des gènes cibles

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines.

Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

Cet article décrit une technique de détection des mutations de basse fréquence dans ADNct, ER-suiv. Cette méthode se distingue par son utilisation unique de correction d’erreur bidirectionnelle, un fond spécial filtre et acquisition moléculaire efficace.

Détection des Mutations rares dans ADNct à l’aide de prochaine génération séquençage

Le séquençage de prochaine génération (NGS) est un outil puissant pour la caractérisation génomique qui est limité par le taux élevé d’erreurs de la plateforme (~0.5–2.0%). Nous décrivons nos méthodes de séquençage de l’erreur-corrigé qui nous permettent d’éviter le taux d’erreur NGS et détecter les mutations aux fractions d’allèle variant aussi rares que 0,0001.

Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN

Quantitative des cellules tueuses récepteur immunoglobuline-like (KIR) saisie semi-automatique (qKAT) est une méthode simple, haut-débit et rentable pour copier le numéros gènes de type KIR pour leur application dans les études d’association de la population et de la maladie.

qKAT : quantitatif semi-Automated typage des cellules tueuses-gènes de récepteurs immunoglobuline-like

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Cet article présente l’application d’une méthode de détection à basse fréquence basée sur le séquençage de Sanger dans le lymphome angio-immunoblastique. Fournir une base pour l’application de cette méthode à d’autres maladies.

PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger pour la détection de mutations somatiques à basse fréquence

Ce protocole décrit un simple adhésif à base de bandes approche pour l'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivie d'une détection rapide des cellules de l'ensemble...

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

Le présent article décrit les étapes nécessaires pour isoler et caractériser l'ARN polymérase variantes fidélité des virus à ARN et la façon d'utiliser les données de fréquence de mutation pour confirmer les modifications fidélité dans la culture de tissus.

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

Apprenez le test de mutagénicité Lambda cII dans des cellules de rongeurs transgéniques. Cette méthode évalue la puissance des agents chimiques et physiques grâce à un gène rapporteur intégré chromosomiquement.

La Lambda sélectionnez cII système de détection de Mutation

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