Récolte de venin toxines d’Assassin Bugs et autres insectes hétéroptères

Bien que beaucoup d’insectes dans le sous-ordre des hétéroptères (Insecta : Hemiptera) sont venimeux, leur composition du venin et les fonctions de leurs toxines venin sont pour la plupart inconnues. Ce protocole décrit les méthodes pour récolter des hétéroptères venins pour davantage de caractérisation, utilisant l’électrostimulation, de harcèlement et dissection de la glande.

Les punaises assassines sont un groupe d’insectes qui utilisent le venin pour paralyser et prédigérer leurs proies. Cependant, bien que les venins d’animaux soient intéressants en tant que nouveaux médicaments, insecticides et outils scientifiques, les toxines qu’ils produisent sont presque entièrement non caractérisées. L’une des raisons en est que les punaises assassines sont moins connues que les arthropodes venimeux emblématiques tels que les araignées et les scorpions.

Une autre raison est que, jusqu’à récemment, peu d’informations étaient disponibles sur la façon de récolter leurs toxines. Dans cette vidéo, nous présenterons des méthodes qui permettront aux chercheurs de récolter avec succès les toxines du venin des insectes assassins, ainsi que des insectes apparentés tels que les punaises d’eau géantes tueuses de poissons. Le protocole un décrit comment récolter le venin par électrostimulation.

Tout d’abord, collectez les insectes appropriés. Les adultes et les grandes nymphes sont les plus faciles à travailler. L’idéal est d’utiliser des insectes deux à sept jours après l’alimentation, pour s’assurer que les insectes ont accumulé des stocks de venin mais ne meurent pas de faim.

Préparez une paire de pinces avec des électrodes aux extrémités et connectez-les à une alimentation électrique. Idéalement, cette alimentation devrait être un électrostimulateur capable de délivrer des impulsions de cinq millisecondes à cinq Hertz. Utilisez des tensions de crête comprises entre 15 et 25 volts pour les petits ou les gros insectes, respectivement.

Si vous n’avez pas d’électrostimulateur, utilisez des tensions constantes de cinq à 12 volts. Retenez l’insecte à l’aide d’élastiques et d’une plate-forme en mousse. Placez la trompe de l’insecte dans un tube collecteur.

Un tube pipette P200 est idéal pour la plupart des insectes assassins. En option, une petite quantité d’eau peut être ajoutée à la pointe avant la récolte, pour assurer une récupération maximale du venin. Appliquez du gel conducteur sur les électrodes, allumez l’alimentation électrique et appliquez la pince à épiler électrifiée sur l’insecte.

Expérimentez avec une gamme de points de contact tout en surveillant l’expulsion du venin de la trompe. Conservez le venin à des températures glaciales pour éviter la digestion autoprotéolytique. Répétez l’électrostimulation avec un nouveau tube de pipette jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de venin.

Le protocole deux décrit comment récolter le venin en provoquant une réaction défensive. Préparez et maîtrisez un insecte comme décrit ci-dessus, en insérant la trompe dans une pointe collectrice. Harcelez doucement l’insecte pour provoquer une réaction défensive, sans blesser l’animal.

Parfois, le simple fait de retenir l’animal ou d’insérer la trompe dans le tube de collecte peut provoquer une réaction défensive accompagnée de l’expulsion du venin de la trompe. Si ce n’est pas le cas, touchez doucement l’animal sur le thorax, les pattes, l’abdomen et surtout les antennes, pour provoquer le venin. Dans le protocole trois, dans la forme écrite de cet article, nous décrivons également comment récolter le venin des espèces qui crachent du venin de manière défensive.

Le protocole quatre décrit comment récolter le venin directement des glandes à venin par dissection. Anesthésier les animaux en les exposant au dioxyde de carbone pendant 10 minutes. Insérez trois broches dans l’abdomen postérieur pour maintenir l’insecte au sol sans percer les glandes à venin.

Découpez une courte incision médiane dans la surface ventrale de l’abdomen à l’aide d’un scalpel miniature. Utilisez des ciseaux miniatures pour étendre la ligne médiane dans la direction antérieure de la tête, en prenant soin de couper uniquement l’exosquelette et de ne pas endommager les structures internes. Pour exposer les structures internes, faites plusieurs coupes latérales s’étendant de l’incision médiane jusqu’au côté de l’insecte.

L’exosquelette ventral entre chacune des deux coupes peut ensuite être épinglé vers l’arrière pour révéler les structures internes. Inondez le plateau de dissection à l’aide d’une solution saline jusqu’à ce que l’insecte soit submergé, ce qui permet aux structures internes de flotter et d’être plus facilement visualisées. Les glandes à venin apparaîtront comme des structures allongées translucides s’étendant de chaque côté du tube digestif.

À l’aide d’une pince à épiler et de microciseaux, retirez soigneusement le tissu conjonctif et nerveux et la trachée, en essayant de ne pas rompre le tube digestif ou les glandes à venin. La glande principale est reconnaissable à sa structure caractéristique, avec des lobes antérieurs et postérieurs, et deux canaux se rejoignant au niveau du hile. Pour les punaises assassines, et peut-être d’autres hétéroptères, presque toutes les toxines sont stockées dans les lumières des deux lobes de la glande principale.

Par conséquent, après avoir libéré la glande principale de la trachée et du tissu conjonctif, les deux canaux menant au hile peuvent être coupés et la glande à venin principale collectée. Si la glande accessoire est également souhaitée, elle est généralement étroitement opposée à l’intestin et peut être identifiée sans ambiguïté en traçant les canaux à partir du hile. Dans tous les cas, veillez à ne pas casser les glandes prématurément et à ne pas perdre le venin dans la solution saline environnante.

Si les lobes de la glande principale doivent être séparés, faites-le rapidement après l’avoir retiré de la solution saline et procédez immédiatement à la récolte du contenu des lumières de la glande, comme décrit aux étapes 4.6 et 4.7 du manuscrit écrit. Les résultats varieront en fonction du sous-protocole exact et de l’espèce d’insecte utilisée. Les premier et deuxième sous-protocoles présentés dans cette vidéo ont montré comment récolter les toxines du venin par électrostimulation et harcèlement, respectivement.

Ces deux méthodes produisent généralement un liquide concentré contenant environ 50 à 250 milligrammes par mil de protéines et plus de 100 composants à base de protéines, y compris des enzymes, des toxines formant des pores et des peptides. Le principal avantage de ces deux protocoles est qu’ils sont rapides, non létaux et que le venin n’est pas contaminé par le tissu glandulaire. Le plus grand inconvénient de la récolte par électrostimulation ou harcèlement est que la source glandulaire du venin obtenu est inconnue et que la teneur en protéines du venin récolté peut différer selon le protocole.

De plus, l’électrostimulation et le harcèlement ne sont pas efficaces pour toutes les espèces prédatrices d’hétéroptères. Dans le dernier sous-protocole, nous avons montré comment disséquer les glandes à venin engorgées pour récolter directement les toxines. Cette technique produit également un cocktail de protéines diverses, bien que dans ce cas, les toxines du venin puissent montrer une certaine contamination par le tissu glandulaire.

Cependant, un avantage de la récolte des toxines à partir de glandes disséquées est que le compartiment glandulaire d’origine est connu exactement. En conclusion, nous encourageons les chercheurs à choisir une méthode de récolte appropriée à leur question de recherche. Par exemple, les études sur la biologie de l’utilisation du venin au sein d’une espèce bénéficieront de l’utilisation de plusieurs techniques de récolte.

Pour les études de bioprospection, une seule méthode de récolte des venins de plusieurs espèces peut être plus économique, selon la conception expérimentale spécifique. Nous espérons que cette vidéo et l’article qui l’accompagne aideront les chercheurs à récolter le venin des punaises assassines et d’autres insectes hétéroptères, ce qui est une condition préalable à la compréhension de sa composition, de sa bioactivité et de son évolution.