Name: CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez l'édition génomique CRISPR/Cas9 pour créer des mutants à knockdown conditionnel chez Plasmodium falciparum. Cette méthode permet d'étudier les fonctions protéiques du parasite du paludisme humain.

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Nous remercions Muthugapatti Kandasamy au cœur microscopie biomédicale Université de Georgie (UGA) pour l’assistance technique et Jose-Juan Lopez-Rubio pour partager les plasmides pUF1-Cas9 et pL6. Ce travail a été soutenu par ARCS Foundation awards à D.W.C. et à H.M.K., accorde des fonds de démarrage UGA à V.M., subventions de la March of Dimes Foundation (Bourse de recherche universitaire Basil o ' Connor Starter) V.M. et US National Institutes of Health (R00AI099156 et R01AI130139) à V.M. et (T32AI060546) à H.M.K.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La mise en œuvre de CRISPR/Cas9 à P. falciparum a augmenté l’efficacité des et diminution de la quantité de temps nécessaire pour modifier le génome du parasite, par rapport aux précédentes méthodes de manipulation génétique. Ce protocole complet décrit les étapes nécessaires pour générer des mutants conditionnels à l’aide de CRISPR/Cas9 à P. falciparum. Alors que la méthode ici est conçue spécifiquement pour la génération de HA -MLG mutants, cette stratégie peut être adaptée pour un large éven...

Le paludisme est une maladie dévastatrice causée par des protozoaires parasites du genre Plasmodium. P. falciparum, le parasite du paludisme humain mortel la plupart, provoque environ 445 000 décès par an, principalement chez les enfants âgés de moins de cinq1. Les parasites Plasmodium ont un cycle de vie complexe impliquant un moustique vecteur et un hôte vertébré. Tout d’abord, les humains sont infectent lorsqu’un moustique infecté prend un repas de sang. Ensuite, le parasite envahit le foie où il grandit, se développe et se divise pour environ une semaine. Après ce processus, les parasites sont libérées dans la circulation sanguine, où ils subissent la réplication asexuée en globules rouges (hématies). La croissance des parasites dans les globules rouges sont directement responsables des symptômes cliniques associés à paludisme2.
Jusqu'à récemment, la production de transgéniques à P. falciparum était un processus laborieux, impliquant plusieurs cycles de sélection de médicaments qui a pris plusieurs mois et avait un taux d’échec élevé. Cette procédure longue relieson la génération de l’ADN au hasard brise dans la région d’intérêt et la capacité endogène du parasite pour réparer son génome mais réparation homologue3,4,5,6 . Récemment, groupés régulièrement entrecoupées palindromique Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) édition de génome a été avec succès utilisé à P. falciparum7,8. L’introduction de cette nouvelle technologie en recherche sur le paludisme a été essentielle pour faire progresser la compréhension de la biologie de ces parasites Plasmodium mortelles. CRISPR/Cas9 permet un ciblage spécifique des gènes via guide ARN (gRNAs) qui sont homologues au gène d’intérêt. Le complexe gRNA/Cas9 reconnaît le gène par l’intermédiaire de la gRNA et Cas9 introduit ensuite une pause bicaténaires, forçant le déclenchement des mécanismes de réparation de l’organisme9,10. Parce que P. falciparum n’a pas le matériel pour réparer les cassures de l’ADN par jonction fin non homologue, elle utilise des mécanismes de recombinaison homologue et intègre les matrices d’ADN homologues transfectées pour réparer la Cas9/gRNA-induite cassure double brin11,12.
Nous présentons ici un protocole pour la génération de mutants knockdown conditionnelles à P. falciparum en utilisant CRISPR/Cas9 génome édition. Le protocole montre l’utilisation de la ribozyme MLG à des niveaux de protéine conditionnellement knockdown de PfHsp70x (PF3D7_0831700), un chaperon exportés par P. falciparum dans hôte RBCs13,14. Le ribozyme MLG est activé par un traitement avec la glucosamine (qui est converti en glucosamine-6-phosphate dans les cellules) pour s’attacher son ARNm associé, conduisant à une réduction de la protéine14. Ce protocole peut être facilement adapté pour utiliser les autres outils knockdown conditionnelles, comme domaines de déstabilisation ou RNA aptamères4,5,15. Les détails de notre protocole la génération d’un plasmide de réparation consistant en une hémagglutinine (HA) balise et MLG ribozyme séquence flanqué par des séquences de codage qui sont homologues à la PfHsp70x cadre de lecture ouvert (ORF) et 3'-UTR. Nous décrivons également la génération d’un deuxième plasmide à l’expression de la promenade de la gRNA. Ces deux plasmides, ainsi qu’un troisième qui anime l’expression de Cas9, sont transfectés dans des globules rouges et permet de modifier le génome des parasites P. falciparum . Enfin, nous décrivons une réaction en chaîne par polymérase (PCR)-fondée technique pour vérifier l’intégration de la balise et MLG ribozyme. Ce protocole est hautement adaptable pour la modification ou la complète élimination directe de gènes à P. falciparum , améliorer notre capacité à générer de nouvelles connaissances sur la biologie du parasite de la malaria.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>Nous achetons ceux qui sont emballés individuellement</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Cadeau d’Akhil Vaidya lab</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire TPP 6 Plaques</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP Boîtes de culture tissulaire 100 mm (plaque de 12 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>TPP Culture tissulaire 96 Plaques de puits</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP Culture tissulaire 24 Plaques</td><td>de puits MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>T4 DNA polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Unité de filtration pour bouteille</td><td>Steritop Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>Vous pouvez utiliser n’importe quelle taille qui correspond à vos besoins</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Généré par le laboratoire Muralidharan</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pHA-glmS</td><td>Généré par le laboratoire Muralidharan</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Don du laboratoire Jose-Juan Lopez-Rubio</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD</td><td>généré par le laboratoire</td><td></td><td></td>Muralidharan</tr><tr><td>Puf1-cas9 eGFP ARNg</td> généré par le gel NucleoSpin <td>du laboratoire</td><td></td><td></td>Muralidharan</tr><tr><td>et nettoyage par PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td><td>Vous voudrez essayer quelques lots pour savoir quels parasites se développeront dans les meilleurs</td></tr><tr><td>cellules sanguines rouges humaines</td><td>Interstate Blood Bank, Inc</td><td>Envoyez un e-mail ou appelez-les directement pour commander</td><td>Nous utilisons généralement du sang O+</td></tr><tr><td>3D7 ligne de parasite</td><td>Disponible sur demande</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Vous pouvez faire le vôtre, il n’est pas nécessaire d’utiliser exactement cette</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>Nous fabriquons un stock 1000X à 100mg / ml dans l’eau et stockons dans le -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td><td>Dr. Daniel Goldberg’s Lab Washington</td><td>University à St. Louis</td><td>Vous pouvez utiliser votre contrôle de charge préféré pour les western blots. C’est exactement celui que nous utilisons dans notre laboratoire</td></tr><tr><td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td><td>Fabriqué par Roche, vendu par Sigma</td><td>11867423001</td><td>Vous pouvez utiliser votre anticorps anti-HA préféré</td></tr><tr><td>Tubes de 0,6 mL</td><td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Système de coloration manuel (fixateur + solution I et II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>Vous pouvez également utiliser la coloration</td></tr> <tr><td>giemsaLames de microscope givrées Fisherfines Premium - Taille : 3 x 1 po.</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gène édition à faire conditionnel mutants de human parasite du paludisme à p. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Le paludisme est une cause importante de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Cette maladie, qui touche principalement les personnes qui vivent dans les régions tropicales et subtropicales, est causée par une infection par les parasites Plasmodium . Le développement de médicaments plus efficaces pour lutter contre le paludisme peut être accéléré en améliorant notre compréhension de la biologie de ce parasite complexe. La manipulation génétique de ces parasites est essentielle pour comprendre leur biologie ; Toutefois, historiquement le génome de P. falciparum est difficile à manipuler. Récemment, CRISPR/Cas9 génome édition a été utilisé dans les parasites du paludisme, permettant une protéine plus facile étiquetant, génération de passes rabattues protéine conditionnelle et délétion de gènes. CRISPR/Cas9 génome édition s’est avéré pour être un outil puissant pour faire progresser le domaine de la recherche sur le paludisme. Nous décrivons ici une méthode CRISPR/Cas9 pour générer des MLG-base conditionnelles knockdown mutants chez P. falciparum. Cette méthode est très adaptable à d’autres types de manipulations génétiques, y compris le marquage de protéines et les masquages de gène.

Figure 1montre une représentation schématique des plasmides utilisés dans cette méthode, mais aussi un exemple d’une mutation de bouclier. Comme un exemple de comment identifier les parasites mutants après la transfection, résultats de PCR pour vérifier l’intégration de la construction deMLG HA - sont indiquées à la Figure 2. Une image représentative d’une plaque de clonage est montrée à la Figure 3<...

Les auteurs décrivent une méthode pour générer des MLG-base conditionnelles mutants knockdown de Plasmodium falciparum à l’aide de CRISPR/Cas9 génome édition.

CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la biologie du parasite humain du paludisme, P.Falciparum, en aidant à découvrir la fonction protéique par knockdown conditionnel. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une génération relativement facile de mutants conditionnels par rapport aux méthodes précédentes. Pour commencer, allez à Chop Chop et sélectionnez Fasta Target’Under Target, coller les 200 paires de base à partir des trois extrémités principales de l’image de lecture ouverte d’un gène et 200 paires de base dès le début des trois UTR principaux du gène.Sous In’select P.Falciparum’and select CRISPR/Cas9'under Using’Next, cliquez sur Trouver les sites cibles Sélectionnez une séquence d’ARN gRNA à partir des options présentées, en donnant la préférence à l’ARN gRNA le plus efficace qui est le plus proche du site de modification et qui a le moins de sites hors cible. Achetez la séquence de gRNA et son complément inverse comme électrophoresis purifiés de gel de polyacrylamide. La séquence gRNA utilisée pour cibler PfH-sp70x se trouve dans le protocole texte.Ajouter 40 microgrammes chacun d’ADN pMK-U6, pUF1-Cas9 et pHA-glmS dans un tube de c

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Génétique

Des détails sont présentés sur la façon dont le cartographie QTL avec une carte génétique basée sur la séquence génomique complète peut être utilisé pour identifier un gène de résistance aux médicaments chez Toxoplasma gondii et comment cela peut être vérifié avec le système CRISPR / Cas9 qui modifie efficacement une cible génomique, dans ce cas le Gène de résistance aux médicaments.

Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Ici, nous décrivons un protocole pour introduire un KO de gène dans l'amastigote extracellulaire de Trypanosoma cruzi, utilisant le système CRISPR/Cas9. Le phénotype de croissance peut être suivi soit par le comptage cellulaire de la culture amastigote axenique ou par la prolifération des amastigotes intracellulaires après l'invasion de cellules hôtes.

Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 est de plus en plus utilisé pour caractériser la fonction des gènes dans les organismes non modèles. Ce protocole décrit comment générer des lignées knock-out de Culex pipiens,de la préparation de mélanges d’injection à l’obtention et à l’injection d’embryons de moustiques, ainsi que la façon d’élever, de croiser et de dépister les moustiques injectés et leur progéniture pour les mutations souhaitées.

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Ce protocole détaille les étapes de la mutagenèse ciblée CRISPR/Cas9 chez les mouches du sable : collecte d’embryons, injection, élevage et identification d’insectes ainsi que sélection de mutations d’intérêt.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjection embryonnaire pour CRISPR/Cas9 Mutagenesis

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Le protocole décrit comment obtenir des modifications dirigées par le site dans le génome des moustiques du paludisme anophèles en utilisant le système φC31 . Les modifications décrites comprennent à la fois l’intégration et l’échange de cassettes transgéniques dans le génome des lignes d’amarrage portant attP.

Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Cet article détaille un protocole d’identification rapide des indels induits par CRISPR/Cas9 et la sélection de lignées mutantes chez le moustique Aedes aegypti à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution.

Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti

Ce protocole décrit comment effectuer une édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM pour construire un modèle précis de maladie du poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e.

Édition de base efficace sans PAM pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zSpRY-ABE8e

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Nous décrivons ici un protocole détaillé d’édition du génome par micro-injection embryonnaire chez le moustique A. aegypti à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9.

Édition du génome du moustique de la fièvre jaune Aedes aegypti à l’aide de CRISPR-Cas9

Découvrez l'édition génomique CRISPR/Cas9 pour créer des mutants à knockdown conditionnel chez Plasmodium falciparum. Cette méthode permet d'étudier les fonctions protéiques du parasite du paludisme humain.

CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum

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