Optimisation de Microdissection Laser-Capture d’isolement de Ganglia entérique de tissu humain frais-congelé

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le système nerveux entérique, telles que le profil d’expression des ganglions entériques dans les intestins des humains adultes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour obtenir des rendements élevés d’ARN à partir de ganglions entériques humains tout en préservant au maximum la qualité de l’ARN. Commencez par le tissu intestinal coupé en longueurs de 20 centimètres.

Tout d’abord, coupez le tissu adipeux et conjonctif. Évitez d’entailler la séreuse, ce qui peut entraîner des dommages structurels au plexus myentérique. Ensuite, faites une incision longitudinale sur toute la longueur de l’échantillon paré, de préférence au site d’attache mésentérique.

Ensuite, disséquez et jetez le taeniae coli du côlon afin que le tissu puisse s’aplatir. Maintenant, étalez l’intestin, côté muqueuse vers le bas, sur une planche à découper réfrigérée. Ensuite, coupez des bandes de 1,25 centimètre de large sur toute la longueur du tissu.

Au fur et à mesure qu’ils sont coupés, transférez chaque morceau dans une solution de stockage de tissu réfrigérée pour un stockage temporaire. Ensuite, coupez chaque bande en segments de deux à 1,5 centimètres de long. Après avoir coupé une bande en segments, épongez les segments pour les sécher.

Il est important que le tissu soit très sec afin que des cristaux de glace ne se forment pas sur le tissu lorsqu’il est gelé. Maintenant, disposez les morceaux de tissu séchés, côté muqueuse vers le haut, sur un moule en plastique froid et jetable. Ensuite, aplatissez chaque pièce à l’aide d’une pince incurvée pour éliminer les bulles d’air emprisonnées.

Les tissus se dilatent à mesure qu’ils s’aplatissent. Après avoir aplati les segments de tissu, évaluez leur épaisseur avant de les congeler. Si nécessaire, poussez les bords de l’échantillon vers l’intérieur jusqu’à ce que l’échantillon intestinal approche de son épaisseur d’origine.

Maintenant, transférez le moule de base chargé sur une boue de glace sèche et de 2-méthylbutane. Le tissu devrait geler complètement en 30 à 60 secondes. Ensuite, séchez immédiatement le fond du moule à l’aide de lingettes froides qui ont été conservées sur de la glace sèche.

Maintenant, vérifiez l’échantillon. Prenez note de tous les échantillons qui n’apparaissent pas plats. Ensuite, enveloppez le moule dans du papier d’aluminium pré-étiqueté et refroidi avant utilisation.

Ensuite, couvrez le papier d’aluminium d’une couche de pellicule plastique pour minimiser la déshydratation. Conservez les échantillons sur de la glace jusqu’à ce qu’ils puissent être entreposés à moins 80 degrés Celsius. Après avoir préparé le matériel requis, versez un monticule de TFM de trois à cinq millimètres sur un grand porte-échantillon de cryostat et transférez immédiatement l’échantillon intestinal, côté séreuse vers le haut, sur le TFM.

Après quelques secondes à température ambiante, transférez le porte-échantillon dans de la glace carbonique et couvrez-le de glace carbonique en poudre. Avant de trancher, assurez-vous que le TFM se trouve sous le plan du plexus myentérique. Ensuite, montez le porte-échantillon dans la tête d’échantillon du cryostat et alignez l’échantillon avec la pale du cryostat.

Faites en sorte que le plan du plexus myentérique soit parallèle à la lame de coupe. Maintenant, faites des sections de huit microns à travers la séreuse et le muscle longitudinal jusqu’à atteindre le plexus myentérique. Pour localiser le plexus myentérique, montez un échantillon et colorez-le avec un colorant aqueux, tel que 1 % de violet cristallin.

Pour continuer, identifiez la jonction entre les couches musculaires longitudinales et circulaires. Au début de la section, la séreuse sera marquée par la présence de tissu conjonctif. Une partie de la graisse mésentérique restante peut également être présente le long de la séreuse.

Ensuite, la feuille de la couche musculaire longitudinale externe devient visible Une fois la frontière entre les couches musculaires longitudinale et circulaire atteinte, une partie des ganglions entériques sera observée. Dans les prochaines sections, le plexus myentérique deviendra très évident avec de grandes bandes de ganglions présentes dans une seule section. Maintenant, collectez des coupes en série pour la microdissection par capture laser.

Refroidissez les diapositives du PEN dans le cryostat pendant cinq à 10 secondes et utilisez-les pour monter les sections. Les meilleures sections auront beaucoup de neurones et de glies. Maintenant, procédez à la coloration puis à la déshydratation des sections comme décrit dans le protocole de texte.

Pour vous préparer, insérez une cartouche de capuchons LCM dans la platine du microscope LCM. Ensuite, chargez l’exemple de diapositive sur la platine et acquérez une image d’ensemble de la diapositive. Identifiez l’emplacement souhaité pour le LCM et chargez un capuchon sur la lame.

Ensuite, alignez le laser infrarouge et ajustez la puissance et la durée du laser pour un point de capture de 20 à 30 microns de diamètre. Ensuite, décrivez les ganglions souhaités à collecter. Assurez-vous de rester dans les limites de la zone de collection sur le capuchon, qui est affiché sous la forme d’un cercle vert.

Pour chacun des ganglions délimités par une trace de coupe UV, ajustez les points IR de manière à ce qu’il y ait au moins un point IR tous les 100 à 500 microns pour vous assurer que les ganglions seront tous collectés lorsque le capuchon sera retiré de l’échantillon. Ensuite, appuyez sur le bouton IR UV Cut pour procéder à la collecte de tous les ganglions marqués. Une fois les collectes terminées, déplacez le capuchon vers un nouvel emplacement et répétez le processus de collecte.

Cela peut être répété pendant 60 à 80 minutes. Lorsque le capuchon LCM est chargé avec suffisamment de ganglions, transférez-le à un poste de contrôle qualité. S’il y a des débris sur le capuchon, essuyez-le à l’aide d’un pinceau à pointe fine préparé pour l’utilisation de l’ARN.

Utilisez une pointe de pipette pour tout débris difficile à enlever. Ensuite, fixez le capuchon sur un tube de microfuge de 0,5 millilitre rempli de 230 microlitres de tampon de lyse de l’ARN. Retournez le bouchon, faites-le tourbillonner brièvement, puis incubez l’échantillon à température ambiante pendant 30 minutes.

Plus tard, centrifugez l’échantillon pendant cinq minutes à 5 000 g ou plus, puis transférez le tube de microfuge dans de la glace sèche. L’échantillon est maintenant prêt pour l’extraction de l’ARN. En prélevant deux capuchons de ganglions entériques par échantillon, plus d’un nanogramme d’ARN a été obtenu, ce qui est suffisant pour le RNA-Seq, et l’ARN était d’excellente qualité.

L’intégrité de l’ARN de l’échantillon montré est de 8,3. Des échantillons présentant des indices d’intégrité de 7,5 et 6,9 ont également été prélevés. Au total, plus de 95 % de tous les échantillons préparés ont été suffisamment bons pour le RNA-Seq.

La qualité des ensembles de données RNA-Seq a été évaluée à l’aide d’un pipeline bioinformatique. Le biais d’extrémité indique que les échantillons ont été séquencés avec succès et qu’ils n’ont présenté qu’un biais d’extrémité modeste de trois premiers essais. Un graphique du biotype du gène montre que les résultats du séquençage étaient largement cohérents.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour collecter des réplicats biologiques d’ARN à partir de ganglions entériques de qualité et de quantité suffisantes pour le RNA-Seq en aussi peu que huit à 12 heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important que les échantillons d’intestin humain soient congelés aussi plats que possible. Cela vous permettra de collecter de très grandes sections transversales de ganglions entériques humains qui sont rapidement et facilement traitées par microdissection par capture laser.