Évaluation de la prolifération des kératinocytes sur deux et trois dimensions des substrats de collagène de Type I

Cette vidéo montre comment préparer deux types différents de substrats de culture cellulaire en utilisant le collagène de type I et la méthode de culture bidimensionnelle et tridimensionnelle. La méthode de culture tridimensionnelle est considérée à l’environnement biologique, démontrant comment préparer facilement un substrat de culture tridimensionnel est utile pour des études. Dans de nombreux types de cellules, malgré l’utilisation du même collagène, le comportement cellulaire varie considérablement entre les substrats bidimensionnels et tridimensionnels.

En utilisant le substrat de culture tridimensionnel, le comportement cellulaire qui est plus semblable à ceux des organismes vivants pourrait être facilement examiné. Cette méthode est très simple et nécessite un minimum de reagent spécial. La démonstration visuelle est critique, car alors que nous voulons démontrer que cette méthode est facilement tentée, le gel tridimensionnel est fragile, et sa manipulation correctement est très importante.

Pour commencer, préparez le milieu culturel approprié. Pour commencer à préparer le collagène, placez 10 x PBS, de l’eau déionisée, du collagène, une plaque de culture de 96 puits et un tube vide de deux millilitres sur la glace. À l’aide d’une pipette, ajouter 1,12 millilitres d’eau déionisée au tube vide de deux millilitres.

Ajouter 200 microlitres de 10x PBS à l’eau déionisée, et secouer doucement le tube plusieurs fois. Immédiatement avant l’utilisation, ajouter 0,66 millilitres de collagène au tube de deux millilitres. Secouez doucement et rapidement le tube plusieurs fois.

Verser 100 microlitres de cette solution de collagène dans chaque puits de la plaque de culture de 96 puits, en s’assurant de couvrir toute la surface des puits. Secouez doucement la plaque à l’aide d’un mouvement de gauche à droite. Incuber la plaque de culture dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Inclinez ensuite la plaque pour confirmer la gelation du collagène et déplacez la plaque de culture sur un banc propre. Verser délicatement 150 microlitres de K110 sur les gels en pipetting le long du mur du puits. Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après cela, déplacez la plaque de culture à un banc propre. Immédiatement avant la culture cellulaire, utilisez une pipette pour jeter doucement le K110. Utilisez d’abord une pipette pour ajouter quatre microlitres de collagène à 1,2 millilitres d’acide chlorhydrique millimolaire dans un tube de 1,5 millilitre, et mélangez doucement.

Verser 100 microlitres de ce mélange de collagène dans chaque puits d’une nouvelle plaque de culture de 96 puits. Secouez doucement la plaque en mouvement de gauche à droite et incubez à température ambiante pendant une heure. Après cela, jeter la solution de collagène.

À l’aide d’une pipette, bien laver chaque puits avec du PBS. Ajouter 150 microlitres de 1%BSA et PBS à chaque puits de la plaque de culture, et incuber à température ambiante pendant une heure. Avant la culture cellulaire, jetez la solution 1%BSA.

Pour commencer, préparez les cellules FEPE1L-8 et l’inhibiteur K110, trypsine et trypsine tel que décrit dans le protocole de texte. Retirez soigneusement le milieu du plat de culture et utilisez une pipette pour ajouter trois millilitres de trypsine de 0,05 %. Remettre le plat dans l’incubateur de dioxyde de carbone et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez la microscopie de contraste de phase au grossissement 10x pour vérifier le détachement cellulaire de la surface du plat de culture. Ajouter trois millilitres d’inhibiteur de la trypsine et utiliser une pipette pour recueillir les cellules détachées dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes.

Après cela, jeter le supernatant, et resuspendre la pastille en 10 millilitres de K110. Utilisez la microscopie de contraste de phase à 10x grossissement pour compter les cellules, et diluer les cellules avec K110 à une densité cellulaire de 50.000 cellules par millilitre. Ensemencer délicatement 0,1 millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de culture en pipetting le long de la paroi du puits.

Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la durée appropriée. Mélanger d’abord 130 microlitres de sel de tétrazolium et de WST-8 avec 1,3 millilitres de K110 préchauffé dans un tube de deux millilitres. Déplacez la plaque de culture sur un banc propre, et utilisez une pipette pour jeter doucement le K110 des puits.

Lavez doucement et nonherent les cellules avec K110. Ajouter ensuite 110 microlitres de K110 mélangés avec WST-8 à chaque puits. Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Après cela, déplacez la plaque de culture à un banc propre. Recueillir 100 microlitres du milieu conditionné de chaque puits et le déplacer dans les puits d’une nouvelle plaque de culture de 96 puits. À l’aide d’un lecteur de microplaque, mesurez l’absorption à 450 nanomètres et estimez le nombre de cellules viables.

La morphologie cellulaire est observée sur les formes non fibreux et fibrilles sont montrés ici. Dans les deux premières heures de la culture, les cellules adhèrent et se propagent sur les deux formes de collagène. Trois jours après l’ensemencement, les cellules sous forme non fibreuse continuent de se propager, et le nombre de cellules augmente, tandis que les cellules sous forme fibril montrent une propagation limitée.

Les cellules FEPE1L-8 continuent de proliférer sous la forme non fibreuse de collagène de type I et sur les surfaces de vaisselle non traitées. En revanche, les cellules ne prolifèrent pas sur la forme fibril. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que le gel tridimensionnel est très fragile.

Il faut faire attention à ce que la solution ou les conseils n’entrent pas en contact direct avec les gels. Cette méthode peut être modifiée de nombreuses façons. Par exemple, pour mélanger les composants membranaires de l’échantillon, on peut faire un substrat de culture cellulaire qui imite une membrane du sous-sol.

Dans de nombreux cas, les fonctions de la matrice extracellulaire dans les corps vivants sont inconnues. Pour la culture des cellules sur la culture tridimensionnelle, on peut examiner la fonction de la composante matricielle extracellulaire qui est plus similaire au corps vivant. En appliquant des techniques tridimensionnelles de culture du gel, on peut tester efficacement la concentration de médicaments dans les cellules.

Ce protocole, basé sur son but, pourrait être utilisé pour développer des substrats complexes de culture tridimensionnelle en mélangeant d’autres composants EGM ou des facteurs de croissance pendant les gelations.