Utilisation des essais d'entrée virale et de l'analyse moléculaire de l'amarrage pour l'identification des candidats antiviraux contre le Coxsackievirus A16

Ce protocole peut aider à la découverte de petites molécules antivirales potentielles grâce à une approche axée sur le mécanisme. Le moment de l’analyse d’addition détermine à quelle étape de l’infection la petite molécule présente son activité antivirale. L’amarrage moléculaire prédit l’interaction entre la petite molécule et les protéines virales.

Pour évaluer l’influence des médicaments sur les cellules hôtes avant l’infection virale, les cellules rd de semence dans les plaques de 12 puits à deux fois 10 à la cinquième cellules par densité de placage de puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% pendant la nuit. Le lendemain matin, traitez chaque puits de la monomeuse RD avec un composé d’essai d’intérêt, en triplicate, à des concentrations non toxiques dans un millilitre de milieu basal pendant une ou quatre heures.

À la fin de l’incubation du traitement, laver les cellules avec un millilitre de PBS avant d’ajouter 50 unités de formation de plaques de virus dans 300 microlitres de milieu basal par puits pendant une heure, avec basculement toutes les 15 minutes. À la fin de l’incubation de l’infection, laver les cellules avec PBS et superposer les cellules avec un millilitre de milieu basal frais contenant 0,8% de méthylcellulose. Après 72 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez chaque puits avec deux millilitres de PBS et fixez les cellules avec 0,5 millilitres de formaldéhyde de 37% par puits pendant 15 minutes.

À la fin de la fixation, laver les puits avec du PBS et tacher les cellules avec 0,5 millilitres de solution violette cristalline de 0,5 % par puits. Après deux minutes, laver les puits avec un doux jet d’eau et laisser sécher l’assiette. Ensuite, placez la plaque sur une boîte de lumière blanche pour compter et calculer le pourcentage de cellules infectées par le coxsackievirus selon la formule.

Pour l’analyse moléculaire de l’amarrage, téléchargez des molécules 3D des composés d’essai de PubChem. Si une molécule n’a pas de structure 3D téléchargée, téléchargez la structure 2D ou utilisez la séquence de cordes SMILE pour transformer la structure en molécule 3D via un programme moléculaire approprié. Ensuite, téléchargez une unité d’assemblage biologique viral à partir de la Banque de données protéiques RCSB.

À l’aide d’un programme de bio-informatique approprié, supprimez les solvants du fichier Protein Data Bank, remplacez les chaînes latérales incomplètes à l’aide des données de la bibliothèque rotamer Dunbrack 2010 et ajoutez des hydrogènes et des charges à la structure tel qu’indiqué précédemment. Pour amarrer les composés d’essai sur l’unité de virus préparée, téléchargez le fichier composé d’essai dans la chimère de l’Université de Californie à San Francisco en tant que ligand et sélectionnez l’ensemble de la protéine virale préparée comme récepteur pour effectuer l’amarrage aveugle. Pour l’amarrage supplémentaire, confinez le site d’amarrage sur la protéine virale aux régions d’intérêt dérivées des résultats d’amarrage aveugle en réduisant davantage le volume de recherche.

Téléchargez ensuite le fichier d’amarrage dans un système graphique moléculaire approprié pour analyser les positions du mode de liaison. Sélectionnez le ligand pour trouver des contacts polaires du composé à la protéine virale, en identifiant les contacts polaires avec l’option atomes. Les deux petites molécules testées dans cette expérience représentative, n’ont produit qu’un impact marginal contre l’infectiosité du coxsackievirus A16, que ce soit dans le prétraitement des cellules hôtes avant l’infection virale ou dans le traitement post-infection.

En revanche, les molécules ont efficacement abrogé l’infection de plus de 80% dans le traitement de co-addition, suggérant que les deux composés sont les plus efficaces quand ils sont simultanément présents avec les particules de virus sur la surface de cellules hôtes pendant l’infection. L’analyse de liaison basée sur la cytométrie de flux confirme que les deux tanins ont empêché l’entrée d’infectiosité de coxsackievirus A16 en empêchant la liaison virale de particule aux cellules hôtes. L’amarrage moléculaire des tanins indique qu’ils sont tous deux prévus pour se lier dans la région du canyon du pamptamer coxsackievirus, juste au-dessus de l’entrée de poche qui détient le facteur de poche et joue un rôle important pour la médiation coxsackievirus liaison et l’entrée dans la cellule hôte.

Dans ces projections de surface, on peut observer les résidus uniques prévus à partir des contacts polaires des petites molécules autour de l’entrée de poche, avec l’asparagine-85, la lysine-257 et l’asparagine-417 en commun entre les deux tanins. Pour l’amarrage moléculaire, la topologie de la protéine virale doit être prise en compte lors du classement des cadres de liaison. D’autres expériences pourraient inclure l’essai de l’activité antivirale du composé sur les virus recombinants, avec des mutations sur les acides aminés découverts pour valider leur importance pour l’efficacité du médicament.