Utilisation des essais d'entrée virale et de l'analyse moléculaire de l'amarrage pour l'identification des candidats antiviraux contre le Coxsackievirus A16
15 juillet 2019
L'objectif du protocole est d'illustrer les différents essais relatifs à l'entrée virale qui peuvent être utilisés pour identifier les inhibiteurs de l'entrée virale candidat.
Ce protocole peut aider à la découverte de petites molécules antivirales potentielles grâce à une approche axée sur le mécanisme. Le moment de l’analyse d’addition détermine à quelle étape de l’infection la petite molécule présente son activité antivirale. L’amarrage moléculaire prédit l’interaction entre la petite molécule et les protéines virales.
Pour évaluer l’influence des médicaments sur les cellules hôtes avant l’infection virale, les cellules rd de semence dans les plaques de 12 puits à deux fois 10 à la cinquième cellules par densité de placage de puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% pendant la nuit. Le lendemain matin, traitez chaque puits de la monomeuse RD avec un composé d’essai d’intérêt, en triplicate, à des concentrations non toxiques dans un millilitre de milieu basal pendant une ou quatre heures.
À la fin de l’incubation du traitement, laver les cellules avec un millilitre de PBS avant d’ajouter 50 unités de formation de plaques de virus dans 300 microlitres de milieu basal par puits pendant une heure, avec basculement toutes les 15 minutes. À la fin de l’incubation de l’infection, laver les cellules avec PBS et superposer les cellules avec un millilitre de milieu basal frais contenant 0,8% de méthylcellulose. Après 72 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez chaque puits avec deux millilitres de PBS et fixez les cellules avec 0,5 millilitres de formaldéhyde de 37% par puits pendant 15 minutes.
À la fin de la fixation, laver les puits avec du PBS et tacher les cellules avec 0,5 millilitres de solution violette cristalline de 0,5 % par puits. Après deux minutes, laver les puits avec un doux jet d’eau et laisser sécher l’assiette. Ensuite, placez la plaque sur une boîte de lumière blanche pour compter et calculer le pourcentage de cellules infectées par le coxsackievirus selon la formule.
Pour l’analyse moléculaire de l’amarrage, téléchargez des molécules 3D des composés d’essai de PubChem. Si une molécule n’a pas de structure 3D téléchargée, téléchargez la structure 2D ou utilisez la séquence de cordes SMILE pour transformer la structure en molécule 3D via un programme moléculaire approprié. Ensuite, téléchargez une unité d’assemblage biologique viral à partir de la Banque de données protéiques RCSB.
À l’aide d’un programme de bio-informatique approprié, supprimez les solvants du fichier Protein Data Bank, remplacez les chaînes latérales incomplètes à l’aide des données de la bibliothèque rotamer Dunbrack 2010 et ajoutez des hydrogènes et des charges à la structure tel qu’indiqué précédemment. Pour amarrer les composés d’essai sur l’unité de virus préparée, téléchargez le fichier composé d’essai dans la chimère de l’Université de Californie à San Francisco en tant que ligand et sélectionnez l’ensemble de la protéine virale préparée comme récepteur pour effectuer l’amarrage aveugle. Pour l’amarrage supplémentaire, confinez le site d’amarrage sur la protéine virale aux régions d’intérêt dérivées des résultats d’amarrage aveugle en réduisant davantage le volume de recherche.
Téléchargez ensuite le fichier d’amarrage dans un système graphique moléculaire approprié pour analyser les positions du mode de liaison. Sélectionnez le ligand pour trouver des contacts polaires du composé à la protéine virale, en identifiant les contacts polaires avec l’option atomes. Les deux petites molécules testées dans cette expérience représentative, n’ont produit qu’un impact marginal contre l’infectiosité du coxsackievirus A16, que ce soit dans le prétraitement des cellules hôtes avant l’infection virale ou dans le traitement post-infection.
En revanche, les molécules ont efficacement abrogé l’infection de plus de 80% dans le traitement de co-addition, suggérant que les deux composés sont les plus efficaces quand ils sont simultanément présents avec les particules de virus sur la surface de cellules hôtes pendant l’infection. L’analyse de liaison basée sur la cytométrie de flux confirme que les deux tanins ont empêché l’entrée d’infectiosité de coxsackievirus A16 en empêchant la liaison virale de particule aux cellules hôtes. L’amarrage moléculaire des tanins indique qu’ils sont tous deux prévus pour se lier dans la région du canyon du pamptamer coxsackievirus, juste au-dessus de l’entrée de poche qui détient le facteur de poche et joue un rôle important pour la médiation coxsackievirus liaison et l’entrée dans la cellule hôte.
Dans ces projections de surface, on peut observer les résidus uniques prévus à partir des contacts polaires des petites molécules autour de l’entrée de poche, avec l’asparagine-85, la lysine-257 et l’asparagine-417 en commun entre les deux tanins. Pour l’amarrage moléculaire, la topologie de la protéine virale doit être prise en compte lors du classement des cadres de liaison. D’autres expériences pourraient inclure l’essai de l’activité antivirale du composé sur les virus recombinants, avec des mutations sur les acides aminés découverts pour valider leur importance pour l’efficacité du médicament.
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Aperçu
Ce protocole aide à découvrir des petites molécules antivirales potentielles selon une approche fondée sur les mécanismes. Il illustre divers dosages liés à l'entrée virale afin d'identifier des inhibiteurs candidats de l'entrée virale.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Virologie
- Pharmacologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- La compréhension de l'entrée virale est essentielle pour développer des thérapies antivirales.
- Des petites molécules peuvent inhiber l'entrée virale à divers stades.
- Des tests permettent d'identifier des candidats antiviraux efficaces.
- Des approches fondées sur les mécanismes améliorent le processus de découverte.
Objectif de l'étude
- Illustrer des tests permettant d'identifier des inhibiteurs de la pénétration virale.
- Évaluer l'activité antivirale de petites molécules.
- Fournir un cadre pour la découverte future de médicaments antiviraux.
Méthodes utilisées
- Essai de temps d'ajout pour déterminer l'étape de l'infection affectée par la petite molécule.
- Accolement moléculaire pour prédire les interactions entre les petites molécules et les protéines virales.
- Protocoles de semis et de traitement des cellules RD.
- Évaluation de l'influence du médicament sur les cellules hôtes avant l'infection virale.
Résultats principaux
- Identification de petites molécules candidates possédant des propriétés antivirales.
- Connaissances sur le moment de l'activité antivirale pendant l'infection.
- Interactions prédites entre les petites molécules et les protéines virales.
- Évaluation des réponses des cellules hôtes aux traitements antiviraux.
Conclusions
- Le protocole fournit une approche systématique de la découverte d'antiviraux.
- Les tests peuvent identifier efficacement des inhibiteurs potentiels de l'entrée virale.
- De futures études pourront s'appuyer sur ce cadre pour le développement de médicaments.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La découverte mécanistique d'antiviraux exige une identification précise des composés capables de bloquer l'entrée virale, un point critique en début d'infection. Ce protocole permet la validation des cibles en précisant l'étape de l'activité antivirale et en prédisant les interactions moléculaires avec les protéines virales. Cette réduction des risques soutient l'identification de composés candidats et le tri des portefeuilles dans le développement de pipelines antiviraux.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge une hypothèse thérapeutique en déterminant, par une analyse du moment d'ajout du composé, à quelle étape de l'infection les petites molécules exercent leur activité antivirale.
- Valeur opérationnelle : Fournit des mesures quantitatives de l'inhibition de l'infection afin d'appuyer la validation de la cible et la réduction des risques mécanistiques.
- Valeur prédictive : Utilise le dockage moléculaire pour prédire les sites de fixation sur les protéines de la capside virale, permettant ainsi une confirmation de la cible au niveau des résidus.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Utilise des dosages d'interaction basés sur la cytométrie en flux pour mesurer quantitativement l'attachement des particules virales aux cellules hôtes.
- Valeur opérationnelle : Standardise les dosages d'inactivation virale et d'ajout temporel pour une évaluation reproductible de l'efficacité des composés dans différentes conditions.
- Extensibilité : Prépare des systèmes biologiques validés (cellules RD) pour des protocoles de criblage ultérieurs et une réutilisation des dosages.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Corrèle les données d'inhibition précoce avec la confiance prédictive dans l'efficacité antivirale grâce à une confirmation par des tests orthogonaux.
- Réduction des risques mécanistiques : Valide l'interaction avec la cible en reliant les résidus prédits par docking (par exemple, l'asparagine-85, la lysine-257, l'asparagine-417) aux données fonctionnelles de liaison.
- Pertinence des modèles précliniques : Utilise des modèles d'infection par le virus Coxsackievirus A16, pertinents pour la maladie, afin d'évaluer l'activité de l'inhibiteur dans un système physiologiquement approprié.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans la continuité de la découverte d'antiviraux, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés initiateurs, en appuyant les décisions d'aller/non-aller sur la base de données mécanistiques et quantitatives.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses en déterminant si les composés agissent par inhibition de la fixation virale ou par des mécanismes post-entrée.
- Écrans : Permet la préparation des tests grâce à des protocoles normalisés pour la fixation virale, l'inactivation et les mesures de temps d'ajout.
- Analytique : Génère des variables dépendantes quantitatives (pourcentage d'inhibition de l'infection, prédictions d'affinité de liaison) permettant des comparaisons entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les données d'inhibition de l'entrée à l'avancement préclinique en validant l'interaction avec les sites cibles dans les régions du capsides viraux.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour l'écran de candidats antiviraux contre d'autres picornavirus ou virus non enveloppés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en distinguant les effets antiviraux pré-attachement, de liaison et post-liaison.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité des tests dans les formats d'ajout en fonction du temps, de liaison et d'inactivation.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en confirmant l'interaction avec la cible avant l'optimisation coûteuse des candidats.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des composés bénéficiant d'une double validation par des tests fonctionnels et un ancrage structural.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en virologie, en culture cellulaire et en logiciels de docking moléculaire (par exemple, UCSF Chimera).
- Suppose un accès à une infrastructure adaptée au niveau de biosécurité requis pour la manipulation des virus et la réalisation de tests de plaque.
- Exige une standardisation croisée entre les équipes de virologie et de biologie computationnelle afin d’assurer une interprétation cohérente des données.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l’extension des tests à d'autres systèmes viraux ou lignées cellulaires autres que les cellules RD.
- Limite pratique : la précision du docking dépend de la qualité de la structure protéique et de la préparation du ligand, nécessitant une validation par mutagenèse ou par des tests de liaison.
