Name: Test très sensible pour la mesure de lattachement arénavirus-cell (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez une méthode qRT-PCR ultrasensible pour quantifier l'attachement des particules d'arenavirus aux cellules hôtes Vero E6. Cette technique permet d'étudier l'endocytose virale et la libération du génome.

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Nous remercions Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, et Benjamin roi pour des discussions utiles et les National Institutes of Health pour le soutien de ces études par le biais de subventions T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), et P20RR021905 (JB) .

Remarque: Il est essentiel que le protocole décrit être effectuée en utilisant la technique de pré-PCR stricte (voir 28 pour une excellente vue d&#39; ensemble sur la façon de mettre en place un laboratoire pré-PCR et la façon de mener des expériences en utilisant une technique bonne pré-PCR). Il est impératif que tous les réactifs et le matériel sont exempts d&#39;ADN amplifié contenant la séquence cible qPCR et que les contrôles appropriés sont en place pour détecter une telle contamination. Un aperçu du protocole est représentée sur la figure 1. 1. Préparer les médias et les cellules de semences dans 48 puits Plaques <ol><li> Préparer 500 ml d&#39;complet du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de HEPES (N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane acide sulfonique), solution tampon par addition de 50 ml de inactivé sérum de veau fœtal à la chaleur et 5 ml chacune d&#39;une solution tampon pénicilline- streptomycine et 100x 100x HEPES à une bouteille de 500 ml de DMEM. Ce réactif peut être conservé à 476; C pendant des mois. </li><li> Seed 2,5 x 10 4 cellules Vero E6 par puits dans un tissu de 48 puits plaque de culture dans un volume final de 500 pi de DMEM complet. Incuber la plaque à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2 pendant 10 à 18 heures. <ol><li> Graine de la plaque à la fin de la journée de travail. Testez chaque échantillon de virus soit en double ou en triple puits. Remarque: Même si une plate-forme de 48 bien pour ce dosage est décrit, il devrait être possible à l&#39;échelle du dosage vers le bas pour une utilisation dans 96- ou plaques 384 puits. </li></ol></li></ol> 2. Carry Out Attachment Virus-cell Remarque: Le virus utilisé dans ce protocole, la souche JUNV Candid # 1 (C # 1), a été utilisé avec succès comme un vaccin vivant atténué pour la prévention de la maladie JUNV 29. JUNV C # 1 a été dérivée de la souche virulente de JUNV XJ par un passage en série à la fois in vivo et in vitro et diffère de la souche parentale XJ par 12 acides aminés 30. because JUNV C # 1 est un niveau de biosécurité (BSL) -2-pathogène classé, les travaux décrits pour cette section doit être effectuée à l&#39; aide BSL-2 pratiques appropriées 31. Cela inclut l&#39;utilisation d&#39;équipements de protection individuelle (par exemple , une protection oculaire, blouse de laboratoire, des gants doubles), une biosécurité armoire de classe II, et veiller à ce que tout le personnel a reçu la formation institutionnelle et les approbations nécessaires pour gérer en toute sécurité cet organisme. <ol><li> Diluer le JUNV C # 1 échantillon (s) à tester à la PFU souhaitée ou se concentrer unités formant dans la glace froide DMEM complet et stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que prêt à ajouter à chaque puits. Remarque: Comme une alternative à la réalisation des études de liaison avec le virus dilué dans DMEM complet, utiliser un milieu minimal contenant du PBS avec une concentration réduite de sérum (2%) et un tampon approprié pour déterminer si le sérum peut provoquer des interférences avec l&#39;attachement du virus. protocoles de fixation similaires pour les virus alternatifs ont rapporté l&#39;utilisation de RPMI 1640 sans bicarbonate contenant 0,2% d&#39; albumine de sérum bovin, 10 mM de (2- (morpholino) éthanesulfonique) et 10 mM d&#39; HEPES, pH 6,8 32. Ce média de liaison peuvent être supérieurs pour empêcher des changements de pH qui pourraient survenir lorsque les médias est retiré du CO 2 -Environnement de l&#39;incubateur. <ol><li> Inoculer des puits avec PFU allant de 200 à 2000 afin de limiter les événements de fixation non productifs. Comme on le voit sur ​​la figure 2, cet essai est capable de détecter la fixation en utilisant aussi peu que 20 PFU (ou autant que 2 x 10 6 UFP). </li><li> Créer un mélange maître du virus pour l&#39;inoculation sur des cellules. Chaque échantillon de virus est inoculé dans des puits en double dans un volume de 50 ul par puits. Par conséquent, si l&#39;addition de 2.000 PFU de virus par puits est souhaitée, diluer 4.800 PFU dans un volume total de 120 pi de glace froid DMEM complet. <ol><li> Pour contrôler la spécificité du test, utiliser une paire assortie de lignées de cellules ovariennes de hamster chinois qui soit n&#39;expriment pas TfR1 (TRVB) ou express hTfR1 (TRVB-1) JUNV attachement à ces cellules devrait être soit réduite ou non, respectivement 13,33. Alternativement, traiter les cellules avec une protease telle que la protéinase K pour empêcher l&#39; attachement arénavirus 34 ou l&#39; entrée 35. Soluble hTfR1 ou ch128.1 d&#39;anticorps monocolonal, qui est spécifique pour hTfR1, pourraient également être considérés comme ils sont connus pour bloquer l&#39; entrée de JUNV dans les cellules 13,36. En outre, le prétraitement des cellules avec mannose libre 14 ou l&#39; incubation des particules avec des anticorps neutralisants 37 spécifiques JUNV peut inhiber l&#39; entrée du virus. </li><li> S&#39;il vous plaît noter, cependant, que ces derniers réactifs et approches, en dépit de blocage JUNV entrée, n&#39;a pas été confirmée pour bloquer la fixation, bien que ce soit une explication probable. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour déterminer formellement si ces différentes approches incidence virion attachement. </li></ol></li></ol></li><li> Retirer les plaques de la 37 ° C incubateur etplacer soit dans un réfrigérateur C à 4 ° C ou sur de la glace pendant 15 minutes pour inhiber la capacité des cellules étalées à effectuer endocytose. </li><li> Ensuite, aspirez le DMEM complet de chaque puits et laver rapidement chaque puits deux fois en utilisant 100 pi de glace froide PBS (tampon phosphate salin) pH 7,4. Ensuite, ajouter 50 ul des échantillons de virus pré-dilué (préparé à l&#39;étape 2.1) dans les puits appropriés. </li><li> Enveloppez la plaque dans une pellicule plastique et placez immédiatement soit de retour sur la glace ou dans un réfrigérateur C 4 ° C pendant 1 à 1,5 h pour permettre la fixation du virus à se produire. Gardez la plaque, le tampon de lavage, et des échantillons de virus à froid à 4 ° C tout au long de cette étape. </li><li> Après l&#39;achèvement de l&#39;incubation à 4 ° C, aspirer le inoculum de virus dans chaque puits et laver 3 fois avec 200 pi de PBS glacé. </li></ol> 3. Viral RNA Extraction <ol><li> Purifier l&#39; ARN viral à partir de JUNV C # 1 particules attachées aux monocouches en utilisant le kit commercial (par exemple, RNeasy Mini kit) according le protocole du fabricant. Plus précisément, suivre la &quot;purification de l&#39; ARN total à partir de cellules animales utilisant le protocole de la technologie de spin» sur les pages 23-28 dans le Mini Handbook RNeasy (4 e édition, avril 2006) avec les modifications ci - dessous. <ol><li> Lyser les cellules comme indiqué dans l&#39;étape 1b, par l&#39;addition de 350 ul de tampon RLT de lyse directement à chaque puits. Mélanger le tampon à plusieurs reprises pour assurer la lyse des cellules. A noter que les cellules lysent facilement dans ce tampon et une lyse complète peut être vérifié en observant les puits sous un microscope inversé. </li><li> Transférer le lysat cellulaire résultant à la colonne de kit (étape 3a) et suivre le reste du protocole tel que décrit. À ce stade, le virus a été neutralisé par le tampon de lyse de sorte que les étapes restantes du protocole peut être fait en dehors de la prévention des risques biotechnologiques armoire de classe II à condition que les tubes du kit ne sont pas contaminés par des virus infectieux. </li><li> Inclure l&#39;étape facultative 9 du protocole du fabricant, qui est un suppional centrifugation de la colonne de centrifugation pour éliminer toute report possible du tampon RPE. </li><li> Dans la dernière étape du protocole du fabricant (étape 10), éluer l&#39;ARN purifié à partir de la colonne de centrifugation en utilisant 30 pi de ddH 2 O. sans nuclease ARN de magasin à -80 ° C à ce point ou utiliser directement dans le dosage qRT-PCR. Pour éviter la dégradation des échantillons purifiés d&#39;ARN viral par des nucléases, utiliser des réactifs et du matériel sans nucléase et conserver des échantillons d&#39;ARN décongelés sur de la glace. Note: Tampons RLT et RW1 contiennent du sel de guanidine et ne doivent pas être mélangés avec l&#39;eau de Javel. Tampon RW1 contient de l&#39;éthanol. </li></ol></li></ol> 4. qRT-PCR Mesure du génome viral <ol><li> # 1 pour convertir l&#39;ARN du segment S JUNV C en ADNc pour la qPCR postérieure, sous l&#39;ARN viral (généré à l&#39;étape 3.1.4) à la température ambiante dans un volume total de 50 ul. <ol><li> Pour configurer la réaction de RT, créez d&#39;abord un mélange maître contenant chacun des réactifs suivants par réaction: 6,75 pi de nucléase-free ddH 2 O, 5 pi d&#39;une 2 uM actions de la RT amorce S 2098- à 2075- (5&#39;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 &#39;), qui est complémentaire de la région NP de l&#39;ARN génomique du segment S, 5 pi de tampon 10X PCR II, 11 pi d&#39;une solution mM MgCl 25 2, 1,25 pi (62,5 unités) de RT enzyme, 1 pi (0,4 unités) d&#39;inhibiteur de RNase, et 10 pi d&#39;un stock de dNTP 500 uM. Remarque: Au cours de la réplication arénavirus, 4 espèces virales d&#39;ARN du segment S sont générés: un ARN de pleine longueur génomique (ARNv), une pleine longueur ARN antigénomique (vcRNA) (qui est le complément inverse de l&#39;ARNv), et deux ARNm subgénomiques codant pour les gènes NP et GP, respectivement. L&#39;amorce de RT énumérées ici est spécifique pour que le segment d&#39;ARNv S, mais pas la vcRNA, NP ARNm ou ARNm GP. </li><li> Mélanger délicatement le mélange maître RT puis aliquoter 40 pl dans 0,2 ml tubes de PCR individuels. Ajouter 10 ul de l&#39;ARN viral dans chaque tube. Inclure i) un tube pas de contrôle de modèle (par exemple ,. Ajouter 10 pl de libre nucléase de ddH 2 O à 40 pi du mélange maître) et ii) un pas de contrôle de l&#39; enzyme RT (par exemple , ajouter 10 ul d&#39;un échantillon d&#39;ARN viral connu positif à 40 pi de mélange maître qui n&#39;a pas reçu toute enzyme RT) pour dépister la contamination des réactifs de RT avec l&#39;ADN amplifié contenant la séquence cible virale. Inclure l&#39;ARN extrait à partir de cellules non infectées avec le master mix complet RT pour contrôler la spécificité pour le dosage en présence d&#39;ARN cellulaire. </li><li> En outre, inclure un échantillon d&#39;ARN viral connu positif au mélange maître complet pour vérifier la qualité des réactifs RT. A noter que le volume de la réaction de RT peut être réduit à 25 ul, si nécessaire. </li></ol></li><li> Soumettre les tubes RT dans les conditions de cyclage suivantes: 25 ° C pendant 10 min, 48 ° C pendant 30 min et 95 ° C pendant 5 min. A noter que les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C à ce point ou laissé une nuit dans le thermocycleur en ajoutant une étape C à 4 ° C. </li><li> PqPCR dans une performance des services de volume total de 25 ul. <ol><li> Faire un mélange maître qPCR en combinant les éléments suivants: 2,5 pi (d&#39;un 9 uM stock) de chaque l&#39;amorce directe de PCR S1937 + à 1958+ (5&#39;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 &#39;) et inverse PCR amorce S 2001- à 1982- (5 &#39;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&#39;), 2,5 pi (d&#39;un 2 uM stock) de la qPCR sonde S 1960+ à 1975+ (5&#39;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 &#39;), et 12,5 pi du maître 2X universel qPCR mélanger. Notez que l&#39;amorce directe rapportée ici, qui est spécifique pour JUNV C # 1, diffère de 1 nt de la séquence d&#39; amorce initialement rapporté 38, qui vise la souche virulente JUNV Romero. </li><li> Mélanger doucement la solution, puis ajouter 20 ul à chaque qPCR ainsi. Ajouter 5 ul de chaque réaction de RT dans les puits appropriés de la qPCR. Mener qPCR en triple pour chaque échantillon testé. A noter que le volume de la réaction PCR peut être réduite à aussi peu que 12,5 pi, si nécessaire. Remarque: Le logiciel associéla machine qPCR génère des nombres de copies absolues de n ° 1 segment S ARN génomique JUNV C en comparant la valeur de chaque échantillon inconnu à une série de dilutions standard de plasmide codant pour le gène NP JUNV C # 1, qui est la cible de l&#39;amorce qPCR et l&#39;ensemble de sondes. L&#39;essai qPCR ne peut fournir la quantification des valeurs qui se situent dans la plage de la courbe standard. Pour cette raison, y compris les quantités suivantes de plasmides dans des puits ( en triple exemplaire): 5, 50, 5 x 10 3 à 5 x 10 5 et 5 x 10 7 copies par puits. </li></ol></li><li> Chargez la plaque qPCR dans le thermocycleur et exécuter les conditions de réaction suivantes: 95 ° C pendant 10 min et 40 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes et 60 ° C pendant 1 min. <ol><li> Recueillir et analyser les données pour déterminer la quantité d&#39;ARN viral présent dans chaque échantillon selon le protocole du fabricant. </li></ol></li><li> Pour établir une courbe standard en utilisant un échantillon nouvellement purifié du plasmide contenant le goudron qPCRobtenir la séquence, déterminer le nombre de copies du plasmide dans cette solution. <ol><li> Calculer le poids moléculaire du plasmide. Si la séquence du plasmide entier est connu, le calcul de cette aide de la formule suivante: M = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Rappelez-vous d&#39;inclure le nombre total d&#39;un nucléotide particulier trouvé sur chaque brin de la double plasmide brin. </li><li> Si la taille du plasmide est connu, mais sa séquence exacte est pas, calcule le PM dans l&#39;hypothèse que chaque paire de bases ADNdb a un poids moléculaire de 600. Note: Le pCAGGS-JUNV C # 1 NP plasmide utilisé ici a un poids moléculaire de 4,2 x 10 6. </li><li> Une fois que le MW du plasmide a été déterminé, calculer le nombre de copies par ml sont présents dans la solution mère de plasmide. </li><li> Tout d&#39; abord calculer le pg total de plasmide dans la solution, puis convertir ce nombre de moles de plasmide (par exemple , si 69 ug de plasmide sont contenues dans 300 ul d&#39;eau, puis 6,9 x 10 -5 g de plasmide * 1 mole / 4,2 x 10 6 g de plasmide = 1,6 x 10 -11 moles de plasmide), qui peut être converti en nombre de copies (par exemple 1,6 x 10 -11 moles de plasmide * 6,022 x 10 23 molécules / mole = 9,8 x 10 12 molécules (ou copies)). </li><li> Diviser les copies totales du plasmide dans la solution plasmidique par le volume de cette solution pour obtenir des copies par ml (par exemple , 9,8 x 10 12 copies / 300 pi = 3,28 x 10 10 copies). </li><li> Diluer cette solution appropriée de telle sorte que 5 volumes ul peuvent être chargés sur la plaque PCR pour fournir la gamme de nombres de copies nécessaires pour établir la courbe standard. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Le protocole que nous décrivons est simple et robuste à condition que les considérations critiques suivantes sont respectées. Tout d&#39; abord, la technique stricte pré-PCR doit être utilisé (voir 28 pour une excellente revue). Il est impératif que tous les réactifs et le matériel sont exempts d&#39;ADN amplifié contenant la séquence cible qPCR et que les contrôles appropriés sont en place pour détecter une telle contamination. Deuxièmement, pour la partie de fixation virus-cellule du protocole, le virus, le...

Arénavirus sont une famille de virus enveloppés, d&#39;ARN simple brin qui sont maintenus principalement chez les rongeurs dans la nature 1-3. Bien que ces virus établissent généralement, une infection persistante asymptomatique dans les réservoirs de rongeurs 1,2, ils peuvent causer des maladies graves chez l&#39; homme 3. Espèces pathogènes importants comprennent le virus du Nouveau Monde Junin (JUNV) 4 et le virus Lassa Vieux Monde 5, qui sont les agents étiologiques de la fièvre hémorragique argentine en Amérique du Sud et de la fièvre de Lassa en Afrique, respectivement. Virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), le virus prototypique de la famille 6, a une distribution mondiale et est responsable d&#39;une variété d&#39;états pathologiques , y compris la méningite aseptique chez les personnes immunocompétentes 6, des malformations congénitales graves chez le fœtus en développement 7, ou létalité élevée en immunodéprimés personnes suivantes solide transplantation d&#39; organes 8,9. Le manque de États-UnisFood and Drug Administration (FDA) CSEh vaccins ou des antiviraux efficaces pour lutter contre ces virus met en évidence le besoin critique de développer de nouvelles stratégies pour cibler thérapeutiquement ces agents pathogènes émergents / ré-émergentes. Le génome de arénavirus se compose de deux segments simple brin d&#39; ARN, la grande (L) (~ 7,2 kb) et petite (S) (~ 3,6 kb) 10 segments. Le segment S code pour la nucléoprotéine virale (NP) et de glycoprotéine d&#39;enveloppe (GP), tandis que le segment L code pour la polymerase virale (L) et de la protéine de matrice (Z). Le L et S segments d&#39;ARN génomique (ARNv) sont emballés dans des virions 10-12. L&#39;étape initiale de l&#39; infection est arénavirus fixation des particules virales aux cellules hôtes par le biais d&#39; une interaction entre le GP virale et ses récepteurs de cellules hôtes correspondantes qui, pour JUNV, comprend le récepteur de la transferrine humaine 1 (hTfR1) 13,14. Après la fixation, les particules JUNV sont prises dans la cellule par l&#39; intermédiaire de la clathrine endocytose 15.Les particules puis la circulation à la fin du endosome où le faible pH de ce compartiment déclenche l&#39;activation du GP 16,17. Une fois activés, les inserts peptide de fusion GP-codées dans la membrane endosomale, initiant la fusion entre les membranes virale et endosomique. Résultats de la fusion réussie dans la libération des ARNv de virions-emballés dans le cytoplasme, où ils servent de modèles pour la réplication génomique et de la transcription. Lorsque des quantités suffisantes de protéines et ARNv structurales virales sont générées, de nouvelles particules se rassemblent et le bourgeon de la cellule infectée pour terminer le cycle de vie de 18 ans. Pour faciliter la découverte de nouvelles stratégies pour cibler thérapeutiquement les arénavirus pathogènes, notre groupe a mis l&#39;accent sur l&#39;identification des facteurs de l&#39;hôte qui sont essentiels pour la propagation du virus, mais dispensable pour l&#39;hôte. Dans ce contexte, définissant le moment précis (s) du cycle de vie viral contrôlé par ces facteurs de l&#39;hôte est nécessaire pour guider ledéveloppement de stratégies antivirales. Nous décrivons ici une analyse quantitative (q) de test à base de RT-PCR qui peut être utilisée pour mesurer la fixation arénavirus des cellules dans le but d&#39;identifier si les protéines hôtes choisies et / ou des molécules antivirales influencent cette phase initiale de la pénétration du virus 19. D&#39; autres approches pour mesurer l&#39; attachement arénavirus cellules ont présenté des virions marqués avec de la biotine 20, des colorants fluorescents 21, ou des isotopes radioactifs 22. Les inconvénients de ces méthodes peuvent inclure l&#39;exigence de grandes quantités de virus d&#39;entrée (par exemple , des multiplicités élevés d&#39;infection (MOI)), l&#39;utilisation de la radioactivité et / ou d&#39; étapes de manipulation supplémentaires pour préparer le virus de l&#39; entrée (par exemple , la concentration et / ou l&#39; étiquetage des virus) . En particulier, l&#39;utilisation de MOI élevé, il est difficile de faire la distinction productive par rapport à des événements de fixation improductives 15,23. Le test à base de qRT-PCR décrit ici peut détecter des événements de fixation en utilisant aussi peu que 20 pour la plaqueunités ming (UFP) du virus, ce qui se traduit par une MOI de 0,0004 pour une plaque de 48 puits. Par conséquent, la forte sensibilité de l&#39;essai surmonte l&#39;exigence de MOI élevé, ainsi que des mesures d&#39;étiquetage de virus ou de concentration. En outre, le dosage peut être i) adapté pour mesurer virion endocytose ainsi que la libération du génome du virus dans le cytoplasme suivant la fusion et ii) adapté pour une utilisation avec d&#39;autres virus à travers le développement de réactifs qRT-PCR spécifiques du virus (pour des exemples, voir 24-27).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>100x</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>100x</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>1x</td></tr><tr><td>Vero E6 cellules American</td><td>Type Culture Collection</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well plate</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>ne pas mélanger les tampons RLT ou&nbsp ; RW1 avec eau de Javel</td></tr><tr><td>QIAshredder homogénéisateur</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/&micro ; l)</td><td>Life Technologies</td><td>4311235</td><td></td></tr><tr><td>mélange dNTP (10 mM ; 2,5 mM chacun dNTP)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0260</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 10X PCR Buffer II et 25 mM MgCl2 solution</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase (5000U/100 &micro ; l)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0119</td><td></td></tr><tr><td>RT amorce 5'-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>250 nmol</td> ADN <td>oligo standard dessalage Amorce</td></tr><tr><td>qPCR directe&nbsp ; 5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>dessalage standard</td></tr><tr><td>Amorce qPCR inverse 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>sonde de dessalage standard</td></tr><tr><td>TaqMan 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4316033</td><td>HPLC purifié</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical Plaque réactionnelle à 96 puits (0,1 mL)</td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Système de PCR en temps réel</td><td>Life Technologies</td><td>4376598</td><td>ou autre instrument qPCR</td></tr></tbody></table>

test très sensible pour la mesure de l&#39;attachement arénavirus-cell

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Les arénavirus sont une famille de virus à ARN enveloppé qui provoquent de graves maladies humaines. La première étape du cycle de vie de l’arénavirus est la fixation des particules virales aux cellules hôtes. Bien que l’attachement des cellules virales puisse être mesuré à l’aide de virions marqués à la biotine, aux isotopes radioactifs ou aux colorants fluorescents, ces approches nécessitent généralement une multiplicité élevée d’infection (MOI) pour permettre la détection du virus lié. Nous décrivons un test quantitatif basé sur la (q)RT-PCR qui mesure l’attachement de la souche Candid 1 du virus Junin via la quantification de l’ARN génomique viral emballé dans un virion. Ce test présente plusieurs avantages, notamment son extrême sensibilité et sa capacité à mesurer l’attachement sur une large plage dynamique de MOIs sans qu’il soit nécessaire de purifier ou d’étiqueter le virus d’entrée. Il est important de noter que cette approche peut être facilement adaptée pour être utilisée avec d’autres virus grâce à l’utilisation de réactifs qRT-PCR spécifiques au virus. De plus, ce test peut être modifié pour permettre la mesure de l’endocytose des particules et le désenrobage du génome. En conclusion, nous décrivons un test simple, mais robuste, pour une mesure très sensible de l’attachement des cellules d’arénavirus.

Pour démontrer la sensibilité et la dynamique de l&#39;essai qPCR, des quantités connues d&#39;un plasmide codant pour le gène NP de JUNV C # 1 (gamme 5-5 x 10 7 copies) ont été soumis à qPCR comme décrit dans la section 4 du protocole. L&#39;essai est sensible et peut détecter de manière fiable aussi peu que 5 copies de l&#39;acide nucléique cible (figure 2). En outre, la plage dynamique de l&#39;essai est grande et, comme le montre la figure 2,</stro...

La première étape du cycle de vie du rénavirus est la fixation des particules virales aux cellules hôtes. Nous rapportons un test quantitatif basé sur la (q)RT-PCR pour la détection ultrasensible et la quantification des événements de fixation de l’arénavirus.

Test très sensible pour la mesure de l&#39;attachement arénavirus-cell

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

L'objectif général de ce protocole est de mesurer quantitativement l'attachement des particules d'arénavirus aux cellules hôtes. Le principal avantage de cette technique réside dans sa grande sensibilité. Elle peut également être adaptée pour mesurer l'endocytose des virions, ainsi que la libération du génome dans le cytoplasme après fusion.Pour commencer, afin de préparer le DMEM complet, ajouter à une bouteille de 500 millilitres de DMEM, 50 millilitres de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et cinq millilitres chacun de pénicilline-streptomycine 100X et de tampon HEPES 100X. À la fin de la journée, ensemencer 2,5 fois 10 à la puissance 4 cellules Vero E6 par puits, en triple exemplaire pour chaque virus, dans une plaque de culture tissulaire de 48 puits, avec un volume final de 500 microlitres de DMEM complet. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 18 heures.Sous une hotte de sécurité biologique de classe 2, utilisez du DMEM complet glacé pour diluer les échantillons du virus Junin souche Candid 1 à tester à une concentration de 200 à 2 000 unités formant des foyers ou unités formant des plaques. Le

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Klaus, J. P. et al. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the extraction of viral RNA from surface-bound virions on epithelial cells using silica spin columns. The method includes chemical lysis, RNA stabilization, and membrane-based purification for downstream quantification of virus-cell attachment.

Extraction of Viral RNA from Surface-Bound Virions Using a Silica Spin Column

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test colorimétrique in vitro pour détecter la présence d’anticorps neutralisants contre les vecteurs du virus adéno-associé recombinant de sérotype 6 exprimant la phosphatase alcaline (rAAV6) dans des échantillons de sérum de mouton. Le test utilise la réaction entre l’AAV codant pour un gène de phosphatase alcaline placentaire humaine et son substrat pour générer un produit violet insoluble.

Dosage cellulaire des anticorps neutralisants AAV : une technique colorimétrique pour détecter les anticorps neutralisants contre des virus adéno-associés spécifiques dans le sérum

Cette vidéo présente un test d’attachement viral pour le criblage de composés antiviraux. À l’aide du virus de l’hépatite C génétiquement modifié et de la luciférase, il évalue les effets inhibiteurs sur l’attachement viral, comme l’indique l’intensité lumineuse plus faible dans les puits cotraités par rapport aux puits traités avec le virus seul.

Un test d’attachement viral pour le criblage de composés antiviraux

Cette vidéo présente un test permettant d’évaluer des agents antiviraux qui ciblent des étapes spécifiques de l’entrée virale dans les cellules hôtes et de la fusion avec l’endosome. Les cellules sont incubées à basse température, puis infectées par le VHC. La basse température permet la liaison virale aux cellules hôtes mais inhibe l’internalisation par endocytose. Le composé antiviral testé est ajouté et les cellules sont incubées à température physiologique. Ce passage à une température plus...

Un test pour évaluer l’effet des composés testés sur l’entrée virale et la fusion dans les cellules hôtes

Ici, nous présentons un protocole qui examine des étapes spécifiques de l’entrée virale afin d’identifier et d’évaluer de nouveaux agents antiviraux.

Early Viral entrée dosages pour l&#39;identification et l&#39;évaluation des composés antiviraux

Nous présentons un protocole décrivant une méthode semi-quantitative pour mesurer à la fois l’attachement du virus de la grippe A aux cellules A549 et l’internalisation des particules virales dans les cellules cibles par cytométrie en flux.

Mesurer l&#39;attachement et l&#39;internalisation du virus grippal A dans les cellules A549 par cytométrie en flux

À l’aide d’une stratégie de microréseau de glycanes imprimée, un test conventionnel sur plaque à 96 puits a été miniaturisé pour l’analyse de l’avidité de l’hémagglutinine du virus de la grippe A et de la spécificité des récepteurs contenant de l’acide sialique.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Ce manuscrit détaille un essai par transfert de point simple pour le dosage des titres adeno-associated virus (AAV) et son application pour étudier le rôle de l’Assemblée-activation protéines (AAPs), une nouvelle classe de protéines virales non structurales dans tous les AAV sérotypes, dans la promotion de l’Assemblée des capsides dérivé de sérotypes d’AAV apparentés et hétérologues.

Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines

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Découvrez une méthode qRT-PCR ultrasensible pour quantifier l'attachement des particules d'arenavirus aux cellules hôtes Vero E6. Cette technique permet d'étudier l'endocytose virale et la libération du génome.

Test très sensible pour la mesure de l'attachement arénavirus-cell

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