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DOI: 10.3791/53682-v
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This protocol outlines a quantitative method for measuring arenavirus particle attachment to host cells using a highly sensitive qRT-PCR-based assay. The technique can also be adapted to study virion endocytosis and genome release into the cytoplasm.
La première étape du cycle de vie du rénavirus est la fixation des particules virales aux cellules hôtes. Nous rapportons un test quantitatif basé sur la (q)RT-PCR pour la détection ultrasensible et la quantification des événements de fixation de l’arénavirus.
L’objectif global de ce protocole est de mesurer quantitativement l’attachement des particules d’arénavirus aux cellules hôtes. Le principal avantage de cette technique est sa grande sensibilité. Il peut également être adapté pour mesurer l’endocytose du virion, ainsi que la libération du génome dans le cytoplasme après la fusion.
Pour commencer, pour faire du DMEM complet, dans une bouteille de 500 millilitres de DMEM, ajoutez 50 millilitres de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, et cinq millilitres chacun de 100 fois de pénicilline-streptomycine et 100 fois plus de tampon HEPES. À la fin de la journée, ensemencez 2,5 fois 10 à la 4e cellule Vero E6 par puits, en trois exemplaires pour chaque virus, dans une plaque de culture tissulaire de 48 puits dans un volume final de 500 microlitres de DMEM complet. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 18 heures.
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