Intégration génique ciblée médiée par TALEN : utilisation de nucléases spécifiques à une séquence modifiée pour l’insertion précise d’un gène de protéine fluorescente dans des hiPSC

Commencer par une suspension de cellules souches pluripotentes induites humaines ou hiPSC dans des milieux. Ajoutez une paire de nucléases effectrices de type activateur de transcription ou de plasmides codant pour TALEN. Compléter avec un plasmide donneur portant un gène de protéine fluorescente, couplé à un gène de résistance aux antibiotiques, avec des bras d’homologie adjacents pour un alignement spécifique sur les loci cibles.

Électroporez le mélange pour générer des pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant l’internalisation du plasmide. Une fois à l’intérieur des cellules, les plasmides codant pour TALEN sont traités, produisant des TALEN - des protéines chimériques composées d’un domaine de liaison à l’ADN TALE spécifique au site fusionné à un domaine de clivage d’endonucléase de restriction FokI non spécifique.

Chaque monomère TALEN, via son domaine de liaison à l’ADN - comprenant des modules de répétition d’acides aminés en tandem - reconnaît et se lie à des loci cibles, un module par nucléotide, sur chaque brin d’ADN dans des orientations opposées, séparés par une séquence d’espacement. Les domaines FokI se dimérisent et clivent ensuite l’ADN dans la séquence d’espacement, créant des cassures double brin avec des surplombs.

En présence d’un plasmide donneur contenant des bras d’homologie complémentaires aux régions flanquant le site clivé, la réparation dirigée par l’homologie se produit en utilisant la séquence homologue comme matrice pour la synthèse de réparation de l’ADN afin de combler les cassures double brin. Après la ligature des entailles, la protéine fluorescente intermédiaire et les gènes de résistance aux antibiotiques sont intégrés dans le génome de l’hôte.

Traitez les hiPSC, ensemences sur une couche de cellules nourricières pour favoriser la croissance, avec un milieu contenant des antibiotiques. Le gène de résistance aux antibiotiques sans promoteur - piloté par un promoteur endogène en amont - facilite la sélection des cellules modifiées par TALEN.

Commencez par laver les cultures iPSC une fois chacune avec du PBS, puis ajoutez 1 millilitre de réactif de dissociation cellulaire douce à 37 degrés Celsius dans chaque puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ 5 minutes. Lorsque plus de 50 % des cellules se sont dissociées du récipient de culture, utilisez une pipette P1000 pour perturber mécaniquement les amas de cellules restants ou les cellules attachées. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de milieu E8 dans chaque puits et utilisez une pipette de 10 millilitres pour désagréger davantage les cultures en suspensions unicellulaires.

Maintenant, versez les cellules récoltées dans un tube conique de 15 millilitres et faites-les tourner. Remettez le granulé en suspension dans une quantité minimale de milieu E8 pour le comptage. Ensuite, après avoir confirmé la viabilité des cultures par exclusion du bleu de trypan ainsi que leur dissociation suffisante, transférez 3 millions de cellules dans chacun des deux tubes coniques de 15 millilitres.

Pendant que les cellules sont en centrifugation, réglez le système d’électroporation sur le programme spécifique au type de cellule pour la lignée de cellules souches embryonnaires humaines, H9. Ensuite, ajoutez 10 microgrammes du donneur de recombinaison homologue seul à 1 pastille pour l’échantillon de contrôle, et 10 microgrammes du plasmide du donneur de recombinaison homologue avec 5 microgrammes de chaque plasmide TALEN pour l’échantillon expérimental.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution complète de transfection de cellules primaires P3 à température ambiante à chacune des pastilles de contrôle et expérimentales, et remettez les cellules en suspension. Transférez les échantillons dans des cuvettes individuelles, puis électroporatez les échantillons. Immédiatement après la transfection, ajoutez 500 microlitres de milieu E8 à température ambiante dans chaque cuvette, puis transférez les échantillons iPSC transectés goutte à goutte dans des boîtes individuelles de 10 centimètres contenant des fibroblastes embryonnaires de souris DR4.