Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

Présenté ici est un protocole pour l’électroporation unicellulaire qui peut livrer des gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme d’âges in vitro de culture de tranche hippocampique. Notre approche fournit une expression précise et efficace des gènes dans des cellules individuelles, qui peuvent être utilisées pour examiner les fonctions cellulaires autonomes et intercellulaires.

La transfection de gènes est une approche vitale pour les études de neurobiologie. Notre technique d’électroporation nous permet de transfecter des interneurones d’intérêt dans une culture de coupe d’hippocampe organotypique sans effets secondaires détectables. Ce protocole a une efficacité de transfection beaucoup plus élevée par rapport aux autres protocoles à cellule unique, mais il reste relativement peu coûteux et simple à réaliser.

Cette technique sera utile aux chercheurs intéressés à comprendre les fonctions moléculaires et physiologiques spécifiques des neurones, y compris les mécanismes d’autonomie cellulaire et les interactions transsynaptiques entre les protéines. Pour préparer les cultures en tranches pour l’électroporation, transférez les inserts de culture d’intérêt dans des boîtes de Pétri individuelles de trois centimètres chargées de 900 microlitres de milieu de culture, et placez les cultures dans un incubateur de dioxyde de carbone de table. Ensuite, pré-incubez des inserts de culture fraîche avec un millilitre de milieu de culture en tranches par insert dans une boîte de Pétri de 3,5 centimètres pendant au moins 30 minutes, et stérilisez les lignes du rig d’électroporation avec 10 % d’eau de Javel pendant cinq minutes.

À la fin de la perfusion, rincer les conduites avec de l’eau ionisée autoclavée pendant au moins 30 minutes avant de perfuser avec un filtre stérilisé ACSF contenant 0,001 millimolaire de tétrodotoxine. Réglez l’impulsion de l’électroporateur sur une amplitude de moins cinq volts, une impulsion carrée, un train de 500 millisecondes, une fréquence de 50 hertz et une largeur d’impulsion de 500 microsecondes. Remplissez une pipette en verre avec cinq microlitres de solution interne contenant un plasmide, puis effleurez doucement et tapotez l’embout plusieurs fois pour éliminer les bulles piégées.

Utilisez un microscope de dissection pour confirmer que la pointe n’est pas endommagée et fixez solidement la pointe de la pipette à l’électrode. Lorsque la pointe entre en contact avec l’ACSF, enregistrez la lecture de la résistance de la pipette de l’électroporateur. Pour isoler une culture en tranches, coupez la membrane de l’insert de culture à l’aide d’une lame tranchante et utilisez une pince à angle vif pour transférer soigneusement la culture en tranches dans la chambre d’électroporation.

Fixez ensuite la position de culture à l’aide d’une ancre de tranche. Pour l’électroporation des cellules d’intérêt, appliquez une pression positive sur la pipette à la bouche et utilisez les commandes tridimensionnelles du bouton pour manœuvrer la pointe de la pipette près de la surface de la culture de tranches. En observant la culture au microscope, approchez-vous de la cellule cible avec la pointe, en maintenant la pression positive appliquée jusqu’à ce qu’une fossette se forme à la surface de la cellule.

Une fois la fossette visualisée, appliquez rapidement une légère pression négative par la bouche afin qu’un joint lâche se forme entre la pointe de la pipette et la membrane plasmique. La membrane entrera légèrement dans la pipette. Une augmentation d’environ 2,5 fois de la résistance initiale de la pipette doit être observée, comme l’indique une augmentation de la tonalité des haut-parleurs.

Réappliquez rapidement une pression positive pour que la fossette se reforme. Ensuite, effectuez immédiatement au moins deux autres cycles de pression, comme nous venons de le démontrer, sans faire de pause. Après la dernière impulsion de pression, maintenez la pression négative pendant une seconde.

Lorsque la tonalité des haut-parleurs atteint un sommet stable en hauteur, utilisez la pédale pour pulser rapidement l’électroporateur. Après l’électroporation, rétractez doucement la pipette à environ 100 microns de la cellule sans appliquer de pression, et réappliquez une pression positive, en vérifiant que la résistance est similaire à la lecture de base avant d’approcher la cellule suivante. Lorsque toutes les cellules d’intérêt ont été électroporées, transférez la culture en tranches dans l’un des inserts de culture fraîche préparés et placez l’insert à 35 degrés Celsius pendant trois jours maximum.

Dans cette expérience représentative, l’EGFP a été transfecté dans cinq à 20 neurones pyramidaux dans la zone CA1 de l’hippocampe pendant sept, 14 et 21 jours de cultures de coupes in vitro. Les interneurones de la parvalbumine et du glutamate vésiculaire de type 3 peuvent également être électroporés avec succès dans la zone CA1 de l’hippocampe. Il est intéressant de noter que la transfection n’est pas significativement affectée par l’âge de la culture de la tranche in vitro et ne diffère pas de l’efficacité de transfection observée dans les neurones pyramidaux CA1.

Les neurones sont très fragiles. Vous devez être extrêmement prudent et doux lorsque vous vous approchez des cellules et que vous exercez une pression sur les cellules et rétractez la pointe de la pipette pour causer de graves dommages. Après électroporation, les cellules peuvent être soumises à diverses analyses expérimentales, notamment l’électrophysiologie et l’imagerie.