Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe
6 octobre 2020
Présenté ici est un protocole pour l’électroporation unicellulaire qui peut livrer des gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme d’âges in vitro de culture de tranche hippocampique. Notre approche fournit une expression précise et efficace des gènes dans des cellules individuelles, qui peuvent être utilisées pour examiner les fonctions cellulaires autonomes et intercellulaires.
La transfection de gènes est une approche vitale pour les études de neurobiologie. Notre technique d’électroporation nous permet de transfecter des interneurones d’intérêt dans une culture de coupe d’hippocampe organotypique sans effets secondaires détectables. Ce protocole a une efficacité de transfection beaucoup plus élevée par rapport aux autres protocoles à cellule unique, mais il reste relativement peu coûteux et simple à réaliser.
Cette technique sera utile aux chercheurs intéressés à comprendre les fonctions moléculaires et physiologiques spécifiques des neurones, y compris les mécanismes d’autonomie cellulaire et les interactions transsynaptiques entre les protéines. Pour préparer les cultures en tranches pour l’électroporation, transférez les inserts de culture d’intérêt dans des boîtes de Pétri individuelles de trois centimètres chargées de 900 microlitres de milieu de culture, et placez les cultures dans un incubateur de dioxyde de carbone de table. Ensuite, pré-incubez des inserts de culture fraîche avec un millilitre de milieu de culture en tranches par insert dans une boîte de Pétri de 3,5 centimètres pendant au moins 30 minutes, et stérilisez les lignes du rig d’électroporation avec 10 % d’eau de Javel pendant cinq minutes.
À la fin de la perfusion, rincer les conduites avec de l’eau ionisée autoclavée pendant au moins 30 minutes avant de perfuser avec un filtre stérilisé ACSF contenant 0,001 millimolaire de tétrodotoxine. Réglez l’impulsion de l’électroporateur sur une amplitude de moins cinq volts, une impulsion carrée, un train de 500 millisecondes, une fréquence de 50 hertz et une largeur d’impulsion de 500 microsecondes. Remplissez une pipette en verre avec cinq microlitres de solution interne contenant un plasmide, puis effleurez doucement et tapotez l’embout plusieurs fois pour éliminer les bulles piégées.
Utilisez un microscope de dissection pour confirmer que la pointe n’est pas endommagée et fixez solidement la pointe de la pipette à l’électrode. Lorsque la pointe entre en contact avec l’ACSF, enregistrez la lecture de la résistance de la pipette de l’électroporateur. Pour isoler une culture en tranches, coupez la membrane de l’insert de culture à l’aide d’une lame tranchante et utilisez une pince à angle vif pour transférer soigneusement la culture en tranches dans la chambre d’électroporation.
Fixez ensuite la position de culture à l’aide d’une ancre de tranche. Pour l’électroporation des cellules d’intérêt, appliquez une pression positive sur la pipette à la bouche et utilisez les commandes tridimensionnelles du bouton pour manœuvrer la pointe de la pipette près de la surface de la culture de tranches. En observant la culture au microscope, approchez-vous de la cellule cible avec la pointe, en maintenant la pression positive appliquée jusqu’à ce qu’une fossette se forme à la surface de la cellule.
Une fois la fossette visualisée, appliquez rapidement une légère pression négative par la bouche afin qu’un joint lâche se forme entre la pointe de la pipette et la membrane plasmique. La membrane entrera légèrement dans la pipette. Une augmentation d’environ 2,5 fois de la résistance initiale de la pipette doit être observée, comme l’indique une augmentation de la tonalité des haut-parleurs.
Réappliquez rapidement une pression positive pour que la fossette se reforme. Ensuite, effectuez immédiatement au moins deux autres cycles de pression, comme nous venons de le démontrer, sans faire de pause. Après la dernière impulsion de pression, maintenez la pression négative pendant une seconde.
Lorsque la tonalité des haut-parleurs atteint un sommet stable en hauteur, utilisez la pédale pour pulser rapidement l’électroporateur. Après l’électroporation, rétractez doucement la pipette à environ 100 microns de la cellule sans appliquer de pression, et réappliquez une pression positive, en vérifiant que la résistance est similaire à la lecture de base avant d’approcher la cellule suivante. Lorsque toutes les cellules d’intérêt ont été électroporées, transférez la culture en tranches dans l’un des inserts de culture fraîche préparés et placez l’insert à 35 degrés Celsius pendant trois jours maximum.
Dans cette expérience représentative, l’EGFP a été transfecté dans cinq à 20 neurones pyramidaux dans la zone CA1 de l’hippocampe pendant sept, 14 et 21 jours de cultures de coupes in vitro. Les interneurones de la parvalbumine et du glutamate vésiculaire de type 3 peuvent également être électroporés avec succès dans la zone CA1 de l’hippocampe. Il est intéressant de noter que la transfection n’est pas significativement affectée par l’âge de la culture de la tranche in vitro et ne diffère pas de l’efficacité de transfection observée dans les neurones pyramidaux CA1.
Les neurones sont très fragiles. Vous devez être extrêmement prudent et doux lorsque vous vous approchez des cellules et que vous exercez une pression sur les cellules et rétractez la pointe de la pipette pour causer de graves dommages. Après électroporation, les cellules peuvent être soumises à diverses analyses expérimentales, notamment l’électrophysiologie et l’imagerie.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente un protocole d'électroporation au niveau de la cellule unique permettant la livraison de gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs des cultures organotypiques de tranches d'hippocampe. Cette technique permet un contrôle précis de l'expression génique, facilitant l'étude des mécanismes autonomes cellulaires ainsi que des interactions intercellulaires à différents stades du développement.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Transfection génique
- Électrophysiologie
Contexte
- La transfection génique est cruciale pour la recherche en neurobiologie.
- L'électroporation offre une efficacité de transfection élevée avec des effets secondaires minimes.
- La méthode est relativement simple et peu coûteuse par rapport à d'autres techniques.
- La compréhension des fonctions moléculaires et physiologiques dans les neurones est essentielle en neurobiologie.
Objectif de l'étude
- Établir une méthode efficace pour transfecter des gènes dans des populations neuronales.
- Étudier des fonctions et mécanismes moléculaires spécifiques dans les neurones excitateurs et inhibiteurs.
- Évaluer l'efficacité de la transfection à différents âges des cultures de tranches.
Méthodes utilisées
- Une électroporation a été réalisée sur des cultures organotypiques de tranches d'hippocampe.
- Les neurones pyramidaux et les interneurones ont constitué les modèles biologiques principaux utilisés.
- La transfection a été évaluée sur des tranches d'âges variés (7, 14 et 21 jours in vitro).
- Les étapes détaillées comprennent la préparation, les techniques de pipetage et la surveillance des variations de résistance.
- Les lésions cellulaires durant le processus ont été minimisées grâce à une manipulation soigneuse.
Résultats principaux
- Une efficacité élevée de transfection génique a été obtenue dans les neurones ciblés, sans différences significatives selon l'âge des cultures de tranches.
- L'électroporation n'a pas affecté négativement la viabilité, préservant l'intégrité cellulaire après la transfection.
- La méthode a permis des études détaillées sur les réponses physiologiques et les mécanismes d'interaction potentiels entre les neurones.
- Une transfection réussie des interneurones du noyau pars et du type vésiculaire du glutamate 3 a également été démontrée.
Conclusions
- Cette étude présente un protocole solide de transfection génique dans des cultures neuronales, renforçant ainsi les capacités de recherche en neurobiologie.
- La méthode jette les bases pour des investigations ultérieures sur les mécanismes neuronaux et les fonctions intercellulaires.
- Comprendre ces processus est essentiel pour obtenir des informations sur la plasticité neuronale et des applications thérapeutiques potentielles.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'électroporation unique à la cellule dans les cultures de tranches hippocampiques organotypiques permet une livraison génique précise dans les neurones excitateurs et inhibiteurs, soutenant la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en découverte neuroscientifique. La méthode offre une efficacité de transfection élevée (~80 %) à travers les stades de développement, permettant un criblage phénotypique et un développement d'essais reproductibles pour l'interrogation des voies biologiques. Cette approche réduit l'incertitude biologique lors des premiers tests d'hypothèses sur les cibles en permettant des études reproductibles et quantitatives d'expression génique dans des systèmes neuronaux pertinents pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans les neurones excitateurs de l'hippocampe et les neurones inhibiteurs selon des classes spécifiques.
- Valeur scientifique : Facilite la validation fonctionnelle des cibles en associant l'expression génique à des mesures physiologiques dans des microcircuits intacts.
- Valeur opérationnelle : Atteint une efficacité de transfection élevée sans effets secondaires détectables, réduisant ainsi la variabilité expérimentale.
- Valeur opérationnelle : Fonctionne à différents âges des cultures de tranches (7 à 21 jours in vitro), permettant des études cinétiques de l'interaction avec la cible.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes neuronaux validés pour des tests fonctionnels ultérieurs d'électrophysiologie et d'imagerie.
- Valeur scientifique : Fournit des données quantitatives à résolution unicellulaire sur la fonction des gènes et les interactions protéiques.
- Valeur opérationnelle : Utilise du matériel d'électrophysiologie standard, permettant une intégration évolutive dans les flux de travail existants.
- Valeur opérationnelle : Conserve une efficacité de transfection élevée pendant de longues périodes de culture, facilitant des campagnes de criblage longitudinales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit une connectique hippocampique pertinente pour l'étude des mécanismes cibles dans des contextes physiopathologiques.
- Valeur scientifique : Permet l'évaluation des interactions protéiques transsynaptiques et des mécanismes cellulaires autonomes.
- Valeur opérationnelle : Facilite la continuité entre la découverte et la validation préclinique en maintenant la santé neuronale après transfection.
- Valeur opérationnelle : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque grâce à une livraison génique fiable et reproductible dans des cultures neuronales primaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, permettant une détection mécanistique des risques avant le criblage de composés.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies dans les populations neuronales de l'hippocampe.
- Criblage : Fournit des systèmes prêts à l'essai avec une transfection reproductible et des résultats quantitatifs pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet une surveillance basée sur la résistance et des réponses électrophysiologiques afin de corréler l'expression génique avec des phénotypes fonctionnels.
- Recherche translationnelle : Relie les études sur la fonction des gènes à la continuité préclinique par le biais de transfections stables dans des tranches organotypiques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Tire parti de l'infrastructure existante en électrophysiologie, positionnant ainsi la méthode comme une plateforme réutilisable pour la validation de cibles neuronales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à une livraison génique à haute efficacité et faible toxicité dans les neurones primaires.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité par l'utilisation de paramètres d'impulsion et d'un protocole de cycle de pression constants.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'avancement ou d'abandon en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans l'engagement des cibles neuronales.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque par une évaluation fiable de la fonction génique à travers différentes classes neuronales et stades de développement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en électrophysiologie et en manipulation de micropipettes pour le ciblage de cellules uniques.
- Dépend d'électrodes en verre, d'un électroporateur et d'une solution ACSF stérile contenant de la tétradotoxine pour assurer la viabilité neuronale.
- Exige une standardisation des séquences d'impulsions de pression et une surveillance de la résistance uniforme entre les utilisateurs.
- Les ajustements à prévoir incluent la concentration en plasmide et la durée des impulsions, adaptées aux différents types de neurones ou à la taille des gènes.
- Limite pratique : la fragilité des neurones exige une technique minutieuse afin d'éviter la rupture membranaire pendant les cycles de pression.
