Collecte et traitement de données de cristallographie neutronique pour la modélisation des atomes d’hydrogène dans les structures protéiques

La cristallographie neutronique est une technique structurelle permettant de déterminer la position des atomes d’hydrogène dans les macromolécules biologiques. Les structures neutroniques révèlent les états de protonation et les orientations des molécules d’eau pour élucider les mécanismes de réaction et les interactions de liaison. Contrairement à la diffraction des rayons X, la diffraction des neutrons présente l’avantage d’être une technique non destructive.

Les protéines avec des groupes photosensibles ou des métallocapteurs peuvent être étudiées sans souffrir de dommages causés par les radiations. Pour effectuer la cristallographie des protéines neutroniques, de gros cristaux de protéines fragiles sont montés dans des capillaires en quartz pour la collecte de données à température ambiante. Le montage capillaire en cristal n’est pas systématiquement effectué, ce qui rend la démonstration de cette technique instructive.

Pour la récolte des cristaux, ouvrez la boîte à sandwich scellée contenant les cristaux de protéines dans une plaque de verre siliconé de grand volume à neuf puits et utilisez une micropipette pour transférer 10 à 20 microlitres de la solution du réservoir de cristallisation sur une lame de verre. Évaluez les cristaux au microscope. Utilisez une microboucle de taille appropriée pour récolter un cristal et placez-le dans la goutte de solution du réservoir.

Pour le montage de cristal, prenez un capillaire en quartz de deux millimètres de diamètre et de 50 millimètres de longueur, aspirez le tampon du réservoir avec une pipette et remplissez une extrémité du capillaire avec un tampon de réservoir. À l’aide d’une boucle de montage, placez délicatement le cristal dans le tampon du réservoir à l’intérieur du capillaire de quartz. Tapotez le tube pour déplacer le réservoir, le tampon et le cristal dans le capillaire, et utilisez une pipette longue et fine pour aspirer la solution autour du cristal.

À l’aide d’une mèche en papier mince, séchez soigneusement le cristal et les parois capillaires, puis ajoutez 20 à 50 microlitres de solution tampon deutérée à l’extrémité du capillaire. À l’aide d’une baguette chauffante, faites fondre une portion de cire d’abeille et insérez délicatement le capillaire dans la cire d’abeille fondue jusqu’à ce qu’un joint hermétique se forme. Remplacez le tampon deutéré par 20 à 50 microlitres de tampon deutéré frais aux jours deux, six et 10 après le montage du cristal et refermez le capillaire avec de la cire d’abeille fraîchement fondue après chaque échange de vapeur, comme démontré.

Après au moins deux semaines d’échange de vapeur, utilisez du mastic pour fixer le capillaire en quartz sur le bâtonnet d’échantillonnage du goniomètre à diffractomètre à neutrons IMAGINE qui a été fixé à l’étage d’échantillonnage de l’instrument et abaissez l’échantillon et le bâton dans la zone du faisceau de neutrons et du détecteur. Ouvrez le programme d’acquisition de données sur l’ordinateur de contrôle Beamline et cliquez sur l’onglet de configuration pour configurer la stratégie de collecte de données et entrez les paramètres de l’expérience, y compris le nom de l’instrument et le nom des images à collecter. Cliquez sur l’onglet Collecter et entrez les paramètres de collecte des données, y compris le temps d’exposition et le nombre d’images à collecter.

Dans l’interface utilisateur graphique optique, cliquez sur 2,78 pour le lambda minimum et 4,5 pour le lambda maximum pour définir la quasi-plage pour la collecte de données. Cliquez sur Démarrer l’analyse pour lancer la collecte de données. Après la collecte des données neutroniques, collectez un ensemble de données de rayons X correspondant sur le même cristal à la même température.

Avant la collecte des données cryogéniques, retirez la solution réservoir de la boîte sandwich et remplissez la boîte sandwich avec une solution tampon de réservoir deutérée, laissez équilibrer pendant une semaine et répétez trois fois. Après trois autres cycles d’échange de solution de réservoir, récoltez le cristal avec une microboucle et plongez le cristal dans une solution cryoprotectrice pendant deux heures avant de monter le cristal dans une microboucle attachée à une monture de cristal cryogénique. Plongez le cristal monté et la monture cryo dans l’azote liquide.

Lorsque le cristal est congelé, montez le cristal sur l’étage d’échantillonnage du diffractomètre à neutrons macromoléculaires équipé d’un flux cryogénique. Vérifiez que le cristal est monté et centré pour la collecte de données, complétez les informations de la proposition, cliquez sur l’icône de dossier pour charger le tableau de stratégie de collecte de données, puis cliquez sur Soumettre pour démarrer la collecte de données. Les neutrons diffractés deviendront visibles en temps réel car ils seront détectés par les détecteurs de temps de vol MaNDi.

Pour affiner les données conjointes de rayons X et de neutrons, ouvrez d’abord CCP4 et sélectionnez convertir pour modifier le programme d’extension MTZ afin de faire correspondre les indicateurs de données R libres des données neutroniques à ceux des données de rayons X. Importez le fichier de réflexion des données neutroniques au format MTZ. Sélectionnez Importer des données R gratuites à partir d’un autre fichier MTZ et importez le fichier MTZ à rayons X.

Nommez le nouveau fichier MTZ correspondant et cliquez sur Exécuter. Ensuite, ouvrez le progiciel Phoenix et, sous Affiner, cliquez sur Prêt à l’arrêt. Téléchargez le fichier de coordonnées de la protéine, choisissez d’ajouter des hydrogènes au modèle s’ils sont absents, et sélectionnez HD sur les sites échangeables, H ailleurs dans le menu déroulant.

Sélectionnez Ajouter du deutérium aux molécules de solvant et cliquez sur Exécuter pour commencer. Pour affiner la structure, dans l’onglet Affinement (affinement ), ouvrez le phénix. Affinez le programme pour configurer le raffinement à l’aide des données de rayons X et de neutrons.

Dans l’onglet Configurer, entrez le fichier PDB à partir de la structure de rayons X résolue. Téléchargez le fichier MTZ à partir des données neutroniques. Attribuez les données du fichier MTZ en tant que données neutroniques dans le neutron R.

Téléchargez le fichier MTZ à partir des données radiographiques et attribuez-le en tant que données radiographiques et rayons X R libres. Sous Paramètres d’affinement (Refinement settings), vérifiez que la stratégie d’affinement standard est sélectionnée et augmentez le nombre de cycles à cinq. Sélectionnez tous les paramètres, avancé et hydrogènes.

Changez le modèle de raffinage de l’hydrogène en individuel et désactivez la force chevauchant l’ADP, puis recherchez nucléaire. Sélectionnez Utiliser les distances nucléaires de X-HD. Cliquez sur Exécuter pour lancer l’affinement

Pour la construction de modèles dans Phoenix, cliquez sur ouvrir dans Coot. Dans Coot, visualisez les cartes de densité électronique des rayons X et de densité de longueur de diffusion des neutrons. Sélectionnez le gestionnaire d’affichage et supprimez la carte de densité de longueur de diffusion des neutrons 2FOFC.

Sélectionnez Ouvrir MTZ, puis Ouvrir MTZ et ouvrir le fichier mtz de données neutroniques. Pour les options d’amplitudes et de phases, sélectionnez no_fill_neutron données dans les menus déroulants pour ouvrir les cartes de densité de longueur de diffusion des neutrons non remplies. Effectuez une inspection visuelle des résidus pour déterminer si le modèle s’ajuste aux données et analysez les pics de la carte de densité différentielle des sites échangeables hydrogène-deutérium pour déterminer l’orientation et l’occupation correctes.

Réorienter les molécules d’eau en fonction des cartes SLD neutroniques et des interactions des liaisons hydrogène. Ajustez l’état de protonation et l’orientation des sites échangeables hydrogène-deutérium du résidu protéique en fonction des cartes SLD de neutrons. Effectuez d’autres séries de construction et de raffinement de modèles interactifs pour obtenir une structure complète.

Les cristaux de protéines hydrogénées cultivés dans un tampon à base d’eau mesurent environ 1 000 par 900 microns. Les cristaux peuvent être montés dans des capillaires en quartz pour l’échange de vapeur avec un tampon à base d’oxyde de deutérium pendant trois semaines avant la collecte des données de diffraction des neutrons. Les données de diffraction des neutrons ont été collectées pendant plusieurs jours à une résolution de 2,30 angström et un ensemble de données de diffraction des rayons X a été collecté sur le même cristal.

Les pics de densité de longueur de diffusion des neutrons FO moins FC fournissent des informations précieuses sur l’orientation des résidus tels que la paragine et les pics positifs de la densité de la longueur de diffusion des neutrons FO moins FC, les cartes d’omission sont également très informatives pour déterminer les états de protonation des résidus avec des groupes titrables tels que l’histidine. Les cartes de densité de longueur de diffusion des électrons et des neutrons pour les molécules d’eau indiquent que si les interactions des liaisons hydrogène peuvent être déduites des données de rayons X, les neutrons fournissent des informations claires sur les positions de ces liaisons hydrogène. Les cartes d’omission de la densité de la diffusion des neutrons peuvent être utilisées pour déterminer l’orientation des groupes fonctionnels de la chaîne latérale hydrogène-deutérium.

Les cartes de densité de longueur de diffusion des neutrons, dans lesquelles les atomes d’hydrogène non échangeables sont liés au carbone, semblent incomplètes par rapport à leurs homologues de la carte de densité électronique en raison de l’annulation de la densité. Il est donc préférable d’effectuer un raffinement conjoint d’un échantillon avec des données de rayons X et de neutrons, dans lesquelles les données de rayons X peuvent être utilisées pour déterminer la position du squelette protéique. La cristallographie des protéines neutroniques nécessite de gros cristaux.

Des précautions doivent être prises lors de la manipulation et du montage des cristaux pour éviter d’endommager les cristaux qui peuvent facilement se fissurer, compromettant ainsi la qualité des données. La cristallographie des protéines neutroniques donne un aperçu du mécanisme de réaction des protéines, révélant potentiellement des résidus ou des molécules d’eau pertinents sur le plan catalytique dont le rôle peut être approfondi par cinétique, mutagénèse ou spectroscopie.