Isolement de l’ARN fécal (micro)

Nous présentons un protocole pour isoler l’ARN à partir d’échantillons fécaux afin d’étudier les microARN. Ce protocole peut être utilisé pour isoler l’ARN des matières fécales de haute qualité et en grande quantité. Il minimise les ARN des microbes vivants.

Il est important de souligner que le tampon de liaison n’est pas utilisé dans ce protocole. Ce protocole est simple et direct. Commencez par remettre en suspension 25 à 100 milligrammes d’échantillons fécaux dans 600 microlitres de 1X DPBS stériles dans un tube à microcentrifuger de deux millilitres.

Incuber le tube contenant l’échantillon à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, écrasez le mélange avec une pointe de pipette d’un millilitre et vortex bien. Remettre le mélange en suspension dans un homogénéisateur réglé pour un cycle à 4 000 rotations par minute pendant 45 secondes afin d’optimiser et d’augmenter la quantité et la qualité de l’ARN.

Ajoutez 600 microlitres de solution de phénol chloroforme acide à l’échantillon et agitez le mélange pendant 60 secondes. Alternativement, pour optimiser une quantité accrue d’ARN dans le rendement, mélangez-le avec un homogénéisateur. Centrifuger l’échantillon pendant 15 minutes à 10 000 x g à température ambiante pour séparer la phase aqueuse et la phase organique.

Répétez la centrifugation jusqu’à ce que l’interface soit compacte. Transférez la phase aqueuse supérieure avec précaution sans perturber la phase inférieure dans un nouveau tube de microcentrifugation de deux millilitres avec un capuchon à charnière. Ajoutez de l’éthanol à 100 % de qualité ACS à 1,25 x le volume de la phase aqueuse acquise et agitez pendant trois secondes.

Placez la cartouche filtrante dans les tubes de collecte. Chargez 600 microlitres de chacun des échantillons dans la cartouche filtrante fournie dans le kit d’isolement de microARN. Centrifuger à 10 000 x g pendant 90 secondes pour filtrer le mélange à travers la cartouche.

Jetez ensuite le filtrat. Répétez cette opération jusqu’à ce que tout le volume du mélange soit filtré à travers la même membrane filtrante dans des applications successives. Une fois que tout l’échantillon est filtré.

ajoutez 700 microlitres de solution de lavage de microARN 1 dans la même cartouche filtrante. Centrifugez pendant 60 secondes pour filtrer la solution de lavage à travers la cartouche filtrante. Jetez le filtrat et placez la cartouche filtrante sur le même tube de collecte.

Laver la cartouche filtrante avec 700 microlitres de solution de lavage 2/3 préparée dans de l’éthanol 100 % de qualité ACS et centrifuger à 10 000 x g pendant une minute. Jetez le filtrat obtenu et placez la cartouche filtrante dans le même tube. Lavez la cartouche filtrante avec 500 microlitres de solution de lavage 2/3 et centrifugez à 10 000 x g pendant une minute.

Jetez le filtrat obtenu et placez la cartouche filtrante dans le même tube de collecte. Lavez la cartouche filtrante avec 250 microlitres de solution de lavage 2/3 préparée dans de l’éthanol 100 % de qualité ACS et centrifugez-la à 10 000 x g pendant une minute. Jetez le filtrat obtenu et placez la cartouche filtrante dans le même tube de collecte.

Enfin, transférez la cartouche filtrante dans un nouveau tube de collecte et faites tourner l’ensemble pendant cinq minutes pour éliminer le liquide résiduel. Transférez la cartouche filtrante dans un nouveau tube de collecte, puis ajoutez 50 microlitres d’eau sans nucléase au centre du filtre et bouchez le tube. Incuber le tube à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, faites tourner le tube pendant cinq minutes à 8 000 x g pour récupérer l’ARN dans un nouveau tube de collecte. Un test d’électrophorèse de l’ARN sur puce suggère que les isolats d’ARN représentatifs des excréments de souris et d’humains sont faibles ou inexistants dans les compositions d’ARNr 18S et 28S et que la taille des isolats d’ARN se situe dans la région des petits ARN. Une autre électrophorèse de petits ARN avec l’électrophorèse sur puce a révélé qu’une grande partie des ARN sont de la taille d’un microARN.

La pureté de l’ARN extrait était élevée, comme l’indiquent le rapport d’absorbance de 2,0 pour les longueurs d’onde de 260 et 280 nanomètres et la valeur du rapport de 1,8 pour l’absorbance à 260 et 230 nanomètres. Pour assurer le succès de l’extraction organique, assurez-vous que les faces sont évidentes et ne transférez que la phase aqueuse supérieure sans perturber la phase inférieure, même au prix d’un volume réduit de notre phase aqueuse.