Complémentation de l’activité d’épissage par un complexe Galectin-3 - U1 snRNP sur perles

Ce rapport fournit les preuves expérimentales de la documentation selon laquelle un complexe snRNP de galectine-3 U1 se lie au substrat de pré-ARNm, forme un complexe fonctionnel et conduit à des produits de la réaction d’épissage. Ce protocole utilise la galectine-3 U1 snRNP immunosélectionnée sur des billes couplées de manière covalente à des anticorps anti-gal3 pour initier la réaction d’épissage, qui peut progresser jusqu’à son achèvement. Une étape critique du protocole est l’élimination soigneuse du liquide après la granulation des billes contenant le complexe galectine-3 U1 snRNP et son utilisation immédiate pour initier la réaction d’épissage.

Pour épuiser les SNRNP U1 de l’extrait nucléaire, incubez 200 microlitres d’extrait nucléaire avec 100 microlitres de billes anti-U1. Ajoutez cinq microlitres d’ARN dans le mélange et faites pivoter le microtube de la tête sur la queue à quatre degrés Celsius pendant une heure. Granulez le mélange par centrifugation et collectez le matériau non lié à l’aide d’une seringue Hamilton.

Dialyser tout le volume d’extrait nucléaire appauvri en U1 avec une aliquote séparée de 50 microlitres de l’extrait nucléaire non appauvri d’origine dans des compartiments séparés d’un microdialyseur en agitant pendant 75 minutes contre 60 % de tampon D à quatre degrés Celsius. Utilisez une membrane de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 8K. Immédiatement après la dialyse, divisez les préparations en aliquotes de 20 microlitres, puis congelez-les dans un bain d’éthanol à la glace carbonique et conservez-les à moins 80 degrés Celsius.

Juste avant l’utilisation, lavez deux fois les billes anti-gal3 avec 0,5 millilitre de tampon de lavage TX. Pour chaque lavage, ajoutez le tampon de lavage et centrifugez. Retirez le surnageant d’abord à l’aide d’une micropipette, puis à l’aide d’une seringue Hamilton pour extraire le liquide des billes.

Fractionnez l’extrait nucléaire sur un gradient de glycérol de 12 % à 32 %. Combinez et mélangez les fractions de gradient de glycérol trois, quatre et cinq qui sont proches de la région 10S. Préparez deux aliquotes de 150 microlitres de fractions de gradient combinées de trois à cinq et placez-les dans 50 microlitres de billes anti-gal3.

En parallèle, préparez deux échantillons de 150 microlitres de fraction un chacun et placez-les dans 50 microlitres de billes d’anti-gal3. Comme contrôle, placez 150 microlitres de 60 % de tampon D dans 50 microlitres de billes anti-gal3. Mélangez doucement en tapotant les tubes, puis faites-les pivoter de la tête sur la queue à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Granulez les échantillons avec une centrifugation douce. Retirez la majeure partie du surnageant à l’aide d’une micropipette. Retirez le surnageant à l’aide d’une seringue Hamilton en insérant soigneusement la pointe de l’aiguille au bas des billes.

Utilisez les billes immédiatement pour les réactions d’épissage. Assemblez la réaction d’épissage comme décrit dans le manuscrit de texte et ajoutez-la à un ensemble d’échantillons de billes. Assemblez un ensemble identique de réactions d’épissage dans un volume total de 24 microlitres mais sans extrait nucléaire appauvri en U1 et ajoutez-le à l’autre ensemble de billes.

Préparez une réaction d’épissage de contrôle à effectuer en l’absence de tout cordon dans un volume total de 12 microlitres. Cette réaction de contrôle contient de l’extrait nucléaire, 60 % de tampon D et un substrat d’épissage radioactif. Mélangez doucement les tubes en tapotant et faites-les pivoter de la tête sur la queue à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes, puis granulez le mélange par centrifugation douce.

Arrêtez la réaction et éluez les protéines des billes en ajoutant 24 microlitres de tampon d’échantillon 2X SDS dans les tubes contenant des billes et 12 microlitres de tampon d’échantillon 2X SDS dans le tube de contrôle contenant l’extrait nucléaire mais pas de billes. Vortex chaque tube. Chauffez les tubes à 100 degrés Celsius pendant sept minutes.

Centrifugez les tubes à 1 000 fois G dans un rotor à godets oscillants à température ambiante pendant 10 à 15 secondes. Transférez les surnageants dans des microtubes frais. Ajouter 20 milligrammes par millilitre de protéinase K pour digérer et solubiliser les protéines.

Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Après l’incubation, centrifugez doucement les tubes. Diluez les élusions des billes avec 39,5 microlitres d’ET 10 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires.

Diluer le contrôle de l’extraction nucléaire avec 63,5 microlitres d’ET et 10 microlitres d’acétate de sodium. Extraire et analyser l’ARN comme décrit dans le manuscrit du texte. Des extraits nucléaires appauvris en complexes U1 snRNP et gal3 U1 snRNP de la région 10S du gradient de glycérol immunoprécipité par l’anti-gal3 ont été mélangés dans une réaction d’épissage.

Ce mélange réactionnel contenait de l’ARNsn U1, ainsi que la protéine spécifique U1-70K de U1. Comme prévu, l’anti-gal3 a précipité gal3. L’ARNsn U1, la protéine U1-70K et gal3 n’ont pas été trouvés dans les précipitations de contrôle pré-immunitaire.

Par rapport à un extrait nucléaire non appauvri réalisé en tant que témoin positif, l’extrait nucléaire appauvri en U1 snRNP n’a pas montré d’activité d’épissage. L’activité d’épissage dans l’extrait nucléaire appauvri en U1 a pu être reconstituée par le complexe snRNP gal3 U1 lié aux billes. Les deux produits de la réaction d’épissage, les exons ligaturés et l’intron lariat excisé, ainsi que dans les intermédiaires, ont été trouvés.

Les composants des fractions trois à cinq ont été essentiels pour restaurer l’épissage de l’extrait nucléaire appauvri en U1. Lorsque ces fractions ont été remplacées par le tampon seul, aucune activité d’épissage n’a pu être observée, ce qui indique que les billes anti-gal3 n’étaient pas responsables de la restauration de l’activité d’épissage dans l’extrait nucléaire appauvri en U1. Plus convaincant, lorsque les fractions trois à cinq ont été remplacées par la fraction un dans la procédure d’immunoprécipitation, puis ajoutées à l’extrait nucléaire appauvri en U1, aucun intermédiaire ou produit de la réaction d’épissage n’a été trouvé. Lors de la tentative de ce protocole, une personne doit terminer l’immunoprécipitation pendant que l’autre personne prépare la réaction d’épissage le moins de temps possible.

L’analyse protéomique de la composition polypeptidique de la galectine-3 U1 SNRP qui restaure l’activité d’épissage d’un extrait nucléaire appauvri en U1 serait d’un grand intérêt.