Ablation au laser et microscopie intravitale pour étudier le remodelage intestinal

Les modèles de lésions sont indispensables pour étudier la régénération in vivo, mais l’étude de la régénération dans l’intestin s’avère être un défi technique. L’absence de protocoles d’imagerie longitudinale a empêché de mieux comprendre la dynamique à l’échelle des cellules et des tissus qui orchestre la régénération intestinale. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de microscopie intravitale qui induit localement des lésions tissulaires à l’échelle de la crypte unique et suit la réponse régénérative de l’épithélium intestinal chez la souris vivante aux dommages d’ablation au laser à base de photons d’une crypte unique ou de champs intestinaux plus importants d’une manière contrôlée dans le temps et l’espace.

L’imagerie intravitale ultérieure, répétitive et à long terme permet de suivre la zone endommagée au fil du temps et de surveiller la dynamique des cryptes pendant la récupération des tissus sur une période de plusieurs semaines. Induire des souris en injectant du tamoxifène dissous dans de l’huile de tournesol quatre à six semaines avant la chirurgie. Appliquer l’analgésie, injecter 200 microlitres de buprénorphine par voie sous-cutanée 30 minutes avant la chirurgie.

Administrer du carprofène dans de l’eau potable 24 heures avant la chirurgie. Introduisez des outils chirurgicaux stériles autoclavés dans l’armoire des risques biologiques. Allumez le coussin chauffant et réglez la température à 37 degrés Celsius.

Allumez la chambre de contrôle de la température du microscope au moins quatre heures avant l’imagerie. Maintenez la température à l’intérieur de la chambre climatique stable à 37 degrés Celsius. Allumez le microscope à deux photons, le scanner et le laser.

Lancez le logiciel d’imagerie. Réglez la longueur d’onde du laser à 960 nanomètres et ouvrez l’obturateur. Anesthésiez la souris à l’aide de deux à 3% d’isoflurane et placez-la sur un coussin chauffant recouvert d’un chiffon stérile.

Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en évaluant la fréquence et la qualité de la respiration une respiration par seconde, et en vérifiant le réflexe de la souris. Couvrez les yeux de la souris avec une pommade pour les yeux. Injectez 200 microlitres de solution saline stérile préchauffée par voie sous-cutanée.

Rasez l’abdomen et enlevez les poils. Changez le tissu stérile dans la zone chirurgicale. Insérez une sonde rectale pour surveiller la température de la souris.

La température devrait être d’environ 37 degrés Celsius. Portez une nouvelle paire de gants stériles. Nettoyez la zone chirurgicale de manière circulaire avec des gommages alternés de solution antiseptique suivis de 80% d’éthanol trois fois.

Couvrez la souris avec un champ chirurgical stérile. Vérifiez le réflexe de la souris. Faites une incision médiane verticale de 10 millimètres à travers la peau à l’aide d’un scalpel stérile.

Inciser la linea alba à l’aide des ciseaux pour séparer les muscles abdominaux droits et ouvrir l’abdomen. Trouvez le caecum de la souris à l’aide d’un coton-tige stérile trempé dans une solution saline préchauffée pour l’utiliser comme point de référence. Faites une petite coupure dans un morceau de gaze, mouillez-la dans une solution saline stérile préchauffée et placez-la au-dessus de l’incision.

Sortez l’intestin avec des cotons-tiges stériles trempés dans une solution saline stérile préchauffée. Gardez l’intestin hydraté en ajoutant une solution saline préchauffée stérilisée. Transférer la souris dans une boîte d’imagerie stérile préchauffée.

Placez l’intestin sur le verre stérile. Placez la tête de la souris à l’intérieur du tube d’inhalation de la boîte d’imagerie. Si nécessaire, fixez la souris avec un film flexible stérile et du ruban adhésif.

Placez la boîte d’imagerie contenant la souris dans la chambre du microscope. Surveillez la souris pendant l’imagerie en vérifiant la fréquence et la profondeur de la respiration, ainsi que la température à l’aide d’une sonde rectale toutes les 15 minutes. L’isoflurane doit être maintenu entre un et 2%Trouver une région dans l’intestin en utilisant les IP du microscope.

Obtenez une vue grand champ de la région d’intérêt à l’aide de la caméra interne du microscope. Imagez la région d’intérêt à l’aide du laser 960 nanomètres du microscope multiphotonique. Ajustez la puissance et la longueur d’onde du laser en fonction des fluoroformes utilisées dans l’expérience.

Dans cet exemple, la membrane exprimée par cryptes est une protéine fluorescente rouge et est marquée stochastiquement avec une protéine fluorescente verte lors de l’induction avec une faible dose de tamoxifène. Acquérir une pile Z de 10 à 20 pas de trois microns de la région d’intérêt. Choisissez une ou plusieurs positions dans l’image de vignette précédemment.

Utilisez la fonction d’étalonnage des points de rupture du logiciel d’imagerie à une résolution de zoom de 32 et 124 x 124 pixels avec une vitesse de numérisation de 400 hertz en utilisant la propriété de balayage bidirectionnel pendant trois à 10 secondes, selon la taille des dommages visés. L’initiation des dommages dans la zone de la crypte peut être reconnue par une augmentation de l’autofluorescence dans les canaux vert et rouge. Après l’ablation, acquérir des piles Z des régions endommagées pour confirmer l’emplacement et l’étendue des dommages.

Répétez les deux étapes précédentes pour plusieurs régions dans la même souris. Placez la souris encore sous anesthésie sur une zone de suture stérile et recouvrez-la d’un champ stérile. Réinsérez l’intestin exposé dans l’abdomen à l’aide de coton-tiges stériles trempés dans une solution saline stérile préchauffée.

Suturer la linea alba en effectuant une suture continue simple à l’aide d’une suture résorbable. Fermez les extrémités de la suture avec des nœuds chirurgicaux. Répétez la même étape avec la couche de peau.

Éteignez la station d’isoflurane, nettoyez et stérilisez la boîte d’imagerie et l’incrustation. Laissez la souris récupérer de la chirurgie pendant que la cage est placée sur le coussin chauffant pendant une heure. Injectez 200 microlitres de buprénorphine par voie sous-cutanée six à 12 heures après la chirurgie.

Administrer du carprofène dans l’eau potable pendant 72 heures après la chirurgie. Pesez la souris et surveillez le bien-être tous les jours pendant une semaine après la chirurgie. Au deuxième moment, au moins une semaine après la première séance d’imagerie, répétez la chirurgie et l’imagerie intravitale.

Utilisez le motif des vaisseaux sanguins pour retrouver les mêmes régions d’intérêt sur le premier point temporel. Si la souris n’est pas destinée à être imagée à un autre point temporel, sacrifiez la souris en effectuant une luxation cervicale sous anesthésie. Sinon, continuez avec la fermeture du site chirurgical et les soins post-opératoires.

Des souris K19-Cre ERT mTmG ont reçu une injection de tamoxifène pour induire le marquage stochastique des cellules avec GFP quatre à six semaines avant la chirurgie et la première séance d’imagerie. Après avoir exposé chirurgicalement l’intestin de la souris et acquis des images de caméra et fluorescentes de la région d’intérêt, les paramètres de point de rupture du laser multiphotonique sont utilisés pour ablater les cryptes. L’initiation des dommages peut être reconnue par une augmentation de l’autofluorescence dans le canal vert et le canal rouge.

La même procédure est répétée un mois plus tard, et le système vasculaire est utilisé comme point de repère pour retrouver la même région. En utilisant le modèle de confettis Lgr5-eGFP, les cryptes étiquetées avec différentes couleurs peuvent être suivies au fil du temps pour cartographier la dynamique de récupération. Dans cet exemple, les cryptes en vert expriment le Cre Lgr5, et une crypte en magenta est étiquetée avec la couleur des confettis.

Différents modes de régénération sont observés deux semaines après l’ablation au laser. Certaines régions restent inchangées, tandis que d’autres régions présentent un remodelage dans les formes de fission cryptique, de sorte que la division d’une crypte en deux, ou la fusion, la fusion de deux cryptes en une seule, ou la disparition de crypte. L’ablation au laser combinée à la méthode de microscopie intravitale limite les dommages à une région d’intérêt définie.

Cela nous permet de contrôler l’emplacement des dommages ainsi que l’étendue des dommages. La gravité des dommages peut être modulée pour ablater des cryptes ou des champs intestinaux entiers pour nous informer de la réponse régénérative à l’échelle de la crypte. En plus du contrôle spatial, l’ablation au laser permet également de chronométrer avec précision l’apparition des dommages en plus d’imager le même organe dans des conditions homéostatiques et régénérantes chez la même souris, surpassant ainsi la précision des modèles de blessures précédents.

L’application de l’ablation au laser et de l’imagerie intravitale répétitive peut être utilisée comme plate-forme pour une multitude de questions de recherche et divers domaines scientifiques qui couvrent la régénération, l’immunologie et la recherche sur le cancer.