Name: Stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’Acinetobacter (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Découvrez des méthodes de quantification et de visualisation des biofilms d'Acinetobacter par coloration au cristal violet, dénombrement viable et microscopie confocale. Ces techniques révèlent la variabilité de formation des biofilms entre souches.

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Cette recherche a été financée par le Programme principal de recherche (E0210702-03) de l’Institut coréen de recherche sur l’alimentation (KFRI), financé par le ministère des Sciences et des TIC.

1. Préparation de l’inoculum bactérien
<ol><li>Retirez le flacon de glycérol stocké à -80 °C.</li>
	<li>Retirez la souche bactérienne (2-10 μL) du flacon à l’aide d’un embout de pipette stérile. NOTA : Les souches d’Acinetobacter A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) et A. ursingii (24-1) sont utilisées dans ce protocole.</li>
	<li>Inoculez la bactérie à une plaque de gélose au sang disponible dans le commerce (gélose tryptique au soja additionnée de 5 % de sang de mouton, voir le tableau des matériaux). REMARQUE : D’autres milieux, tels que la gélose nutritive ou la gélose MacConkey, peuvent également être utilisés.</li>
	<li>Striez la surface de la gélose à l’aide d’une boucle stérile avec un flambage intermittent pour l’amincir.</li>
	<li>Placez la plaque de gélose à l’envers dans un incubateur et incubez à 30 °C pendant une nuit de 20 à 24 h.</li>
	<li>Prélever une seule colonie de la culture bactérienne à l’aide d’une aiguille stérile et inoculer 5 ml de bouillon stérile pour perfusion de cerveau et de cœur (BHI, voir le tableau des matériaux) avec la culture.</li>
	<li>Incuber le bouillon inoculé dans un incubateur à agitation à 30 °C pendant une nuit de 20 à 24 h à environ 150 tr/min.</li>
	<li>Transférez 1 mL de la culture de nuit dans un tube de microcentrifugation stérile et centrifugez la culture de nuit à 6 000 × g pendant 10 minutes à température ambiante (RT).</li>
	<li>Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>À l’aide d’un vortex, remettre le granulé en suspension dans 1 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Centrifuger à 6 000 × g pendant 10 min à RT et retirer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille dans un BHI stérile dix fois dilué à l’aide d’un vortex jusqu’à une densité optique d’environ 0,1 à 600 nm. REMARQUE : La densité optique d’environ 0,1 est équivalente à environ 107 UFC/mL.</li>
</ol>2. Quantification du biofilm à l’aide du violet cristallin
<ol><li>Ajouter 200 μL d’inoculum à chaque puits d’une plaque de polystyrène stérile à 96 puits (voir le tableau des matériaux) et ajouter 200 μL d’eau déminéralisée à chacun des puits les plus à l’extérieur pour éviter que les puits intérieurs ne se dessèchent15.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de BHI dilué dix fois dans chaque puits de la même plaque comme témoin négatif.</li>
	<li>Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. REMARQUE : La pipette multicanal est souvent plus pratique pour plusieurs échantillons.</li>
	<li>Ajouter délicatement 300 μL de PBS dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. REMARQUE : La pipette multicanal est souvent plus pratique pour plusieurs échantillons.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.5 deux fois de plus.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de solution cristalline violette (1 %) (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et incuber à RT pendant 30 minutes.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.4 à 2.6.</li>
	<li>Ajouter 200 μL d’éthanol absolu dans chaque puits et incuber pendant 15 min à RT. Bien mélanger en pipetant de haut en bas plusieurs fois.</li>
	<li>Transférez 100 μL d’élution de chaque puits vers une nouvelle plaque de 96 puits.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Lorsque l’absorbance est supérieure à 2,0, diluer correctement l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit inférieur à 2,0 dans l’éthanol absolu et le mesurer comme à l’étape 2.11. Ensuite, calculez l’absorbance de l’échantillon (valeur finale) en multipliant la valeur observée par le facteur de dilution.</li>
	<li>Calculer l’absorbance réelle des échantillons en soustrayant la valeur moyenne du témoin négatif de la valeur de chaque puits des échantillons d’essai sur la même plaque de puits.</li>
</ol>3. Dénombrement de la viabilité du biofilm
<ol><li>Ajouter 1 mL d’inoculum (étape 1) dans chaque puits d’une plaque de polystyrène stérile à 12 puits15. Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Ajouter délicatement 1,5 mL de PBS stérile dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de PBS stérile dans chaque puits.</li>
	<li>Grattez le fond et les parois du puits à l’aide de grattoirs à cellules ajustés.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire récoltée dans un tube en plastique stérile (10-1) contenant 9 mL de solution saline (0,85 % de NaCl) et 10 à 20 billes de verre (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Pour recueillir les débris résiduels du biofilm laissés sur la surface inférieure du puits, ils peuvent être remis en suspension et transférés à l’aide d’une pipette à l’aide d’une solution saline du tube 10-1 .</li>
	<li>Vortex le tube 10-1 pendant 60 s à une vitesse maximale.</li>
	<li>Effectuer une dilution en série 10 fois en transférant 1 mL dans le tube stérile suivant (10-2) contenant 9 mL de solution saline (0,85 % de NaCl) jusqu’à 10-7.</li>
	<li>Étaler 100 μL de chaque dilution sur une gélose Acinetobacter (voir tableau des matériaux) et incuber les plaques de gélose à 30 °C pendant 24 à 42 h.</li>
	<li>Comptez manuellement le nombre de colonies rouges typiques sur chaque plaque entre 10 et 250.</li>
	<li>Calculez le nombre de cellules viables dans le biofilm de chaque puits à l’aide de l’équation ci-dessous : Cellules viables = Nombre de colonies × Facteurs de dilution × 10</li>
</ol>4. Visualisation du biofilm à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM)
<ol><li>Ajouter 200 μL d’inoculum dans chaque puits d’une plaque stérile à 96 puits destinée à l’analyse microscopique.</li>
	<li>Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Ajouter délicatement 300 μL d’eau déminéralisée stérilisée par filtre dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.4.</li>
	<li>Préparer le mélange de SYTO 9 et d’iodure de propidium (voir le tableau des matériaux) dilué dans de l’eau déminéralisée stérilisée par filtre jusqu’à une concentration finale de 10 μM et 60 μM, respectivement.</li>
	<li>Ajouter le mélange dans chaque puits à 200 μL et incuber la plaque pendant 20-30 min à RT dans l’obscurité.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.3 et 4.4</li>
	<li>Visualisez les biofilms attachés à la surface inférieure à l’aide de CLSM avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et 561 nm et une gamme de longueurs d’onde d’émission de 499 à 535 nm et de 568 à 712 nm, respectivement.</li>
</ol>

Évaluation de la formation et caractérisation des biofilms d’Acinetobacter

<ol><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections%3A+a+century+of+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li>
<li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675(2021).</li>
<li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter%3A+an+old+friend%2C+but+a+new+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li>
<li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens%3A+Norovirus%2C+Clostridium+difficile%2C+and+Acinetobacter+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%3A+multitasking+in+a+shared+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+microbial+%26%2334%3Bprotective+clothing%26%2334%3B+in+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the microbial &#34;protective clothing&#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423(2019).</li>
<li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+drug+resistance%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li>
<li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li>
<li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714(2022).</li>
<li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%3A+genotype-phenotype+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849(2019).</li>
<li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630(2020).</li>
<li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125(2023).</li>
<li>Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li>
<li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville%2C+Tennessee%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21(2021).</li>
<li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-attached+cells%2C+biofilms+and+biocide+susceptibility%3A+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li>
<li>Ravishankar, S., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Stress+Adaptation+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).</li>
<li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li>
<li>McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+human+infections%2C+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li>
<li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilms%3A+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

À l’aide du protocole décrit, la formation de biofilms d’isolats d’Acinetobacter à des degrés divers a été mesurée, visualisée et les cellules viables dans les biofilms ont été estimées (Figure 1, Figure 2 et Figure 3).
Dans ce protocole, deux températures différentes ont été utilisées, 30 °C pour la croissance et 25 °C pour la formation du biofilm d’Acinetobacter. 30 °C a été utilisé pa...

Acinetobacter est connu pour provoquer des infections nosocomiales, et son infection humaine, en particulier dans les établissements de santé, est de plus en plus signalée1. Il est répandu dans les hôpitaux, les établissements de santé et les environnements associés à l’alimentation 2,3,4. Il peut survivre pendant une longue période dans des environnements tels que les surfaces hospitalières telles que les barrières de lit, les tables de chevet, la surface des ventilateurs et les éviers4. Une telle persistance sur les surfaces environnementales peut être l’un des facteurs importants contribuant aux infections nosocomiales d’Acinetobacter4.
Le biofilm est une forme de vie microbienne et est une matrice microbienne composée de cellules microbiennes vivantes et de substances polymères extracellulaires (EPS) provenant des cellules5. Les cellules microbiennes sont intégrées dans la matrice et sont souvent très résistantes aux stress environnementaux tels que la chaleur, les sels, la sécheresse, les antibiotiques, les désinfectants et les forces de cisaillement 6,7.
Acinetobacter peut former des biofilms sur les surfaces, ce qui suggère qu’il peut contribuer à une survie prolongée sur les surfaces environnementales, y compris les surfaces hospitalières, et à une résistance accrue aux traitements antibiotiques 8,9. De plus, la formation d’un biofilm d’Acinetobacter pourrait être fortement associée aux résultats cliniques chez l’homme8. Par conséquent, la formabilité du biofilm des souches d’Acinetobacter pourrait être l’un des indicateurs de prédiction de la survie environnementale et des infections humaines 8,10.
Les biofilms attachés à la surface peuvent être quantifiés et visualisés pour évaluer la formabilité du biofilm. Pour quantifier les biofilms attachés à la surface, les biofilms sont normalement colorés par des colorants de coloration du biofilm tels que le violet cristallin, et les colorants sont élués en solution et mesurés pour la densité optique11. La visualisation des biofilms est une autre bonne approche pour évaluer la formabilité des biofilms11. La méthode de visualisation de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) utilisant la spécificité à l’aide de colorants fluorescents pourrait être plus utile pour caractériser la morphologie du biofilm par rapport à d’autres techniques telles que MEB12,13.
Les cellules viables dans les biofilms peuvent être comptées pour estimer le nombre de cellules viables dans les biofilms11. Les cellules viables intégrées dans les biofilms sont détachées, diluées, étalées sur des plaques de gélose, incubées et dénombrées. Étant donné que le nombre plus élevé de cellules est susceptible de répondre à la dose infectieuse, il peut fournir des informations plus détaillées sur les biofilms, tels que les potentiels d’infection associés au nombre de cellules13,14.
Cet article présente des protocoles étape par étape pour (1) quantifier les biofilms attachés à la surface, (2) compter les cellules viables dans les biofilms et (3) visualiser les biofilms à l’aide du CLSM d’Acinetobacter. Les protocoles présentés décrivent les méthodes permettant d’évaluer la formabilité du biofilm des isolats d’Acinetobacter et de caractériser leurs biofilms.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 96 puits</td><td>SPL</td><td>30096</td><td>Plaque de polystyrène à 96 puits</td></tr><tr><td>Bouillon BHI (Brain Heart Infusion)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10493.0500</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de base de gélose au sang</td><td>KisanBio</td><td>MB-B1005-P50</td><td>Milieu de croissance pour Acinetobacter</td></tr><tr><td>CHROMagar Acinetobacter</td><td>CHROMagar</td><td>AC092</td><td>Plaque sélective pour Acinetobacter</td></tr><tr><td>Crystal violet solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V5265</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm kit de viabilité</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>SYTO9 et iodure de propidium Lecteur de</td></tr><tr><td>microplaques</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td><td>Mesure du biofilm</td></tr><tr><td>RBC Perles de placage de verre</td><td>RBC</td><td>RG001</td><td>Perles de verre</td></tr><tr><td>&mu ;-Plate 96 Well Black</td><td>ibidi</td><td>89621</td><td>Microplaque destinée à CLSM</td></tr></tbody></table>

stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’acinetobacter

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter provoque des infections nosocomiales et la formation de son biofilm peut contribuer à la survie sur des surfaces sèches telles que les environnements hospitaliers. Ainsi, la quantification et la visualisation du biofilm sont des méthodes importantes pour évaluer le potentiel des souches d’Acinetobacter à provoquer des infections nosocomiales. Les biofilms qui se forment à la surface de la microplaque peuvent être quantifiés en termes de volume et de nombre de cellules. Les volumes de biofilm peuvent être quantifiés par coloration à l’aide de violet cristallin, lavage, décoloration à l’éthanol, puis mesure du colorant solubilisé à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour quantifier le nombre de cellules incorporées dans les biofilms, les biofilms sont éliminés à l’aide de racleurs cellulaires, récoltés dans la solution saline, vigoureusement agités en présence de billes de verre et étalés sur gélose Acinetobacter. Ensuite, les plaques sont incubées à 30 °C pendant 24 à 42 h. Après incubation, les colonies rouges sont dénombrées pour estimer le nombre de cellules dans les biofilms. Cette méthode de comptage viable peut également être utile pour compter les cellules Acinetobacter dans les biofilms d’espèces mixtes. Les biofilms d’Acinetobacter peuvent être visualisés à l’aide de colorants fluorescents. Une microplaque disponible dans le commerce et conçue pour l’analyse microscopique est utilisée pour former des biofilms. Ensuite, les biofilms attachés à la surface inférieure sont colorés avec des colorants SYTO9 et à l’iodure de propidium, lavés, puis visualisés par microscopie confocale à balayage laser.

Suivant le protocole, les biofilms d’isolats d’Acinetobacter, isolés à l’origine des surfaces de cuisine, ont été formés sur une plaque de polystyrène à 96 puits, colorée au violet cristallin, et les colorants ont été solubilisés dans de l’éthanol et mesurés pour la masse du biofilm (Figure 1). Le nombre de biofilms variait considérablement en fonction des souches, allant de 0,04 à 1,69 OD (Figure 1). Sur la base des critères établis par Stepanović et <...

Ce protocole décrit la préparation de l’inoculum, la quantification du biofilm sur des plaques de microtitration à l’aide d’un colorant violet cristallin, le nombre viable dans les biofilms et la visualisation des biofilms d’Acinetobacter.

Stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Les biofilms sont composés de cellules microbiennes vivantes et sont difficiles à éliminer des surfaces. Les souches d’Acinetobacter que l’on trouve couramment dans notre environnement, causant des infections nosocomiales, sont également connues pour former des biofilms sur les surfaces. Nous visons donc à développer des méthodes permettant à la fois de quantifier et de visualiser les biofilms d’Acinetobacter.Notre protocole fournit une méthode simple et facile pour quantifier et visualiser les biofilms d’Acinetobacter. Le nombre viable de cellules à l’intérieur des biofilms est quantifié à l’aide de la méthode de comptage viable. Les résultats de nos recherches révèlent que les souches de vecteurs Acinetobacter naturellement existantes ont des potentiels très variables pour la formation de biofilms.De plus, il existera des différences morphologiques distinctes au sein des différents biofilms. Cela a ouvert la voie à des recherches axées sur les causes d’une telle variation entre les souches d’Acinetobacter.

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Source : Tay, S. B., et al. Perturbation antivirulente des biofilms pathogènes utilisant des lactonases modifiées pour l’extinction du quorum.  J. Vis. Exp. (2016)La vidéo démontre une méthode pour quantifier la biomasse de biofilm dans une bactérie pathogène, en comparant des témoins non traités à des échantillons traités avec une enzyme quorum-quenching. L’enzyme perturbe la signalisation bactérienne lors de l’incubation précoce, réduisant l’adhésion cellulaire. Après lavage et incubation...

Quantification de la suppression du biofilm induite par les enzymes chez les bactéries pathogènes

Un protocole pour la quantification et la comparaison simultanées de trois composants cellulaires et extracellulaires dans des biofilms est présenté. La méthodologie implique l’utilisation d’une microscopie confocale à balayage laser, d’un logiciel d’analyse structurelle et de visualisation de biofilm et d’un logiciel d’analyse statistique.

Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms

Le but de ce document sur les méthodes est de décrire l'utilisation d'un système microfluidique pour le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent généralement des espèces identifiées dans la plaque dentaire supra-gingival humain. Méthodes pour décrire l'architecture du biofilm, biofilm viabilité, et une approche de la récolte biofilm pour les analyses de culture-dépendante ou indépendante de la culture sont mis en évidence.

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

Cette étude présente le développement de méthodologies reproductibles pour étudier les inhibiteurs de biofilm et leurs effets sur la multicellularité de Bacillus subtilis.

Méthodologies pour l&#39;étude<em&gt; B. subtilis</em&gt; biofilms comme un modèle pour Caractériser Inhibiteurs biofilm petites molécules

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer et analyser qualitativement les biofilms bactériens sur les hyphes fongiques par microscopie confocale et électronique.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Ce protocole décrit la visualisation du développement du biofilm suite à une exposition à des facteurs de l’hôte à l’aide d’un modèle de chambre à lames. Ce modèle permet de visualiser directement le développement du biofilm ainsi que d’analyser les paramètres du biofilm à l’aide de logiciels informatiques.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Les modifications induites par les antimicrobiens de l’architecture du biofilm de Pseudomonas aeruginosa diffèrent entre les isolats cliniques cultivés chez des patients atteints de mucoviscidose et d’infection pulmonaire chronique. Après la microscopie confocale, le logiciel COMSTAT peut être utilisé pour quantifier les variations de l’architecture du biofilm (p. ex., surface, épaisseur, biomasse) pour des isolats individuels afin d’évaluer l’efficacité des agents anti-infectieux.

Quantification des effets des antimicrobiens sur l’architecture des biofilms in vitro à l’aide du logiciel COMSTAT

Les expectorations synthétiques de la fibrose kystique (SCFM2) peuvent être utilisées en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et le tri cellulaire activé par fluorescence pour observer les agrégats bactériens à haute résolution. Cet article détaille les méthodes permettant d’évaluer les populations agrégées pendant le traitement antimicrobien en tant que plate-forme pour de futures études.

Outils pour l’évaluation en temps réel d’un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa

Ce protocole décrit une approche combinant des méthodes statiques et dynamiques pour évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms dans l’industrie laitière. Cette approche peut également être utilisée pour tester l’efficacité de nouvelles formulations biologiques ou chimiques pour contrôler les biofilms.

Evaluation de l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms laitiers à l’aide d’une approche combinant des méthodes statiques et dynamiques

Ce protocole propose un flux de travail modulaire BSL-2 combinant des tests de biomasse cristalline-violet, des cinétiques à contraste de phase en accéléré, une cartographie confocale 3D/matricielle, une ultrastructure SEM, et un module d’infection à hamster in vivo pour cultiver, quantifier, caractériser et étudier le rôle fonctionnel du biofilm Leptospira , permettant une évaluation standardisée des mutants et des interventions anti-biofilm à travers les laboratoires.

Un flux de travail modulaire pour l’analyse quantitative, structurelle et fonctionnelle des biofilms de Leptospira

Découvrez des méthodes de quantification et de visualisation des biofilms d'Acinetobacter par coloration au cristal violet, dénombrement viable et microscopie confocale. Ces techniques révèlent la variabilité de formation des biofilms entre souches.

Stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’Acinetobacter

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