Un flux de travail modulaire pour l’analyse quantitative, structurelle et fonctionnelle des biofilms de Leptospira

Nous étudions les biofilms comme des structures protectrices permettant la persistance environnementale et de l’hôte, en étudiant la dynamique de formation, la composition moléculaire, les caractéristiques adaptatives et la contribution à l’infection. La combinaison du biotest cristallin, de l’imagerie par texte temporel, de la microscopie confocale, de la microscopie électronique à balayage et de la transcriptomique dans nos laboratoires, fait progresser la recherche sur biofilms grâce à l’analyse multidimensionnelle intégrée. Pour commencer, cultivez des cellules de Leptospira dans un milieu EMJH dans des tubes en verre à fond plat à bouchon vissé.

Incubez les cultures en conditions aérobies à 30 degrés Celsius sans secouer jusqu’à ce qu’elles atteignent une phase logarithmique moyenne. Assurez-vous que les cultures atteignent une densité optique comprise entre 0,2 et 0,4 à 405 nanomètres, ce qui correspond à deux à cinq fois 10, soit la puissance de huit cellules par millilitre. À l’aide d’un microscope en champ sombre à un grossissement de 20 x, vérifiez que les cellules sont modales et non agrégées.

Diluez la culture de phase arythmique en dialogaritmie moyenne vérifiée à un ratio de un pour 100 dans un milieu EMJH frais pour obtenir environ un fois 10 à la puissance de six cellules par millilitre et mélangez doucement par inversion sans vortex. Utilisez maintenant des pinces stériles pour placer une membrane polycarbonate hydrophile stérile de 0,1 micromètre à plat au fond de chaque puits, dans une plaque stérile à 24 puits avec couvercle. Ajoutez un millilitre de médium EMJH stérile à chaque puits et faites tremper la membrane pendant deux heures à 30 degrés Celsius.

Ensuite, retirez la solution de trempage de chaque puits sans déplacer la membrane et ajoutez 1,5 millilitre de suspension bactérienne diluée, en veillant à ce que la membrane reste bien en place au fond. Ensuite, placez un plateau rempli d’eau à l’intérieur de l’incubateur pour maintenir l’humidité. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius dans des conditions statiques pour permettre la formation de biofilms.

Laisser la plaque jusqu’à trois semaines pour les souches à croissance lente. Au moment souhaité, aspirez soigneusement autant de milieu culturel que possible sans perturber le biofilm. Rincez chaque puits doucement avec un millilitre de PBS stérile tout en gardant la membrane à plat contre le fond.

Ajoutez un millilitre d’aldéhyde de paraforme à 4 % dans le PBS à chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour fixer les échantillons de biofilm. Après l’incubation, retirez le fixateur et rincez doucement deux fois avec un millilitre de PBS. Ajoutez un millilitre de solution de violet cristal à 0,1 % de poids en volume dans chaque puits et faites couver à température ambiante pendant 15 minutes, en veillant à ce que la gaine de couverture soit complètement immergée.

Ensuite, jetez le colorant violet cristallin de chaque puits et rincez deux fois avec un millilitre de PBS. Inclinez l’assiette et évacuez tout le liquide restant. Laissez la plaque à température ambiante pour qu’elle sèche à l’air jusqu’à ce que le substrat soit complètement sec, de préférence toute la nuit.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon élucien composé de 50 % d’éthanol et 50 % d’acide acétique glaciaire en volume dans chaque puits. Faites une pipette de haut en bas pour dissoudre complètement la tache liée au biofilm. Transférez maintenant 200 microlitres de chaque échantillon sur une microplaque optiquement claire de 96 puits.

Mesurez l’absorbance à 570 nanomètres et soustrayez les valeurs de fond des contrôles non inoculés traités à chaque étape. Notez la moyenne et l’écart-type pour au moins trois réplications techniques. Obtenez les biofilms dans des plaques de puits comme démontré précédemment.

Ajoutez une solution d’aldéhyde de paraforme à 4 % et de glutaraldéhyde à 1 % dans un tampon de sodium 0,2 molaire à pH 7,4 dans les puits. Incubez les échantillons fixes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez le fixateur et rincez l’échantillon deux fois avec du PBS pour préserver le biofilm fixé à la surface tout en minimisant le décollement.

Immergez maintenant la gaine de couverture dans du tétroxyde d’osmium dilué dans du PBS et faites couver pendant une heure pour améliorer le contraste de la microscopie électronique à balayage. Ensuite, rince le substrat deux fois avec du PBS. Déshydratez les échantillons en les immergeant séquentiellement pendant 10 minutes chacun dans une série d’éthanol graduée.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’hexaméthyldisilazane et faites couver pendant cinq minutes. Ensuite, remplacez-le par de l’hexaméthyldisilazane frais et faites éclore pendant cinq minutes supplémentaires. Ensuite, retirez l’excès de solution et laissez l’échantillon sécher complètement à l’air libre sous une hotte à fumée.

Montez maintenant les échantillons séchés sur des muches de microscopie électronique à balayage à l’aide d’un ruban carbone conducteur double face. Un sputter enduit les échantillons d’une fine couche, d’environ 10 nanomètres d’or ou de platine, pour améliorer le contraste électronique lors de l’imagerie. Enfin, chargez les stubs préparés dans le microscope électronique à balayage à l’aide du porte-échantillon approprié.

Évacuez la chambre toute la nuit si possible pour améliorer la qualité de l’imagerie. Ensuite, acquérir des images électroniques secondaires à cinq à quinze kilovolts en utilisant des grossissements appropriés pour visualiser l’ultra structure du biofilm. Après 21 jours d’incubation, la coloration au violet cristallin a révélé des motifs biofilms visibles sur les filtres en polycarbonate et les caches en verre pour Leptospira interrogans et Leptospira biflexa.

Chaque espèce présente des empreintes architecturales distinctes telles que des formes en points, ramifiées ou réticulées. Les mesures d’absorption à 570 nanomètres ont confirmé une plus grande rétention du violet cristallin dans les biofilms de Leptospira byflexa par rapport aux interrogans de Leptospira à tous les points temporels, indiquant une accumulation de biomasse plus élevée dans la souche. La microscopie électronique à balayage des biofilms de Leptospira interrogans a capturé les premiers dépôts de matrices extracellulaires dans des biofilms vieux de trois jours, une face basale mature et canalisée avec une structure tridimensionnelle à 14 jours et une consolidation matricielle pleinement développée avec une architecture dense à 21 jours.

Notre protocole optimisé synchronise les lectures complémentaires provenant de cultures identiques, augmentant la robustesse, réduisant la variabilité et révélant des informations dynamiques et structurelles, disponibles avec des approches monométhodes. En intégrant une analyse complémentaire, nos résultats ont standardisé l’évaluation des biofilms, clarifié la dynamique et l’architecture des leptospires. Ils associent la structure à la virulence et renforcent la recherche comparative reproductible.

Les mutants futurs lieront la régulation à la morphologie et à la dynamique du biofilm, clarifiant la persistance environnementale et évaluant des stratégies perturbant l’information sur les biofilms ou favorisant la dispersion.