Name: Un flux de travail modulaire pour l’analyse quantitative, structurelle et fonctionnelle des biofilms de Leptospira (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez une méthode modulaire pour analyser quantitativement et structurellement les biofilms de Leptospira. Ce protocole standardisé combine cristal violet, microscopie et modèles in vivo pour étudier la dynamique et l'architecture des biofilms.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm%3A+A+review+on+formation%2C+infection%2C+antibiotic+resistance%2C+control+measures%2C+and+innovative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment.</a> Microorganisms. 11 (6), (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilms+on+chronic+infections+and+medical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges.</a> Cureus. 15 (11), e48204(2023).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Beenken, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).</li>
<li>Wilson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+assessment+methods+for+biofilm+growth%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Rev+J+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review.</a> Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).</li>
<li>Yildiz, F. H., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+biofilms%3A+So+much+the+same+yet+so+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio biofilms: So much the same yet so different.</a> Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+saprophytic+and+pathogenic+Leptospires%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires.</a> Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).</li>
<li>Chiani, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Leptospira+spp.+in+a+mosaic+of+wetlands+used+for+livestock+raising+under+differing+hydroclimatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+interactions+of+Leptospira+interrogans+with+proximal+renal+tubule+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells.</a> BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).</li>
<li>Santos, A. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+formation+in+Rattus+norvegicus+%28Norway+rats%29+natural+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biofilm+formation+of+pathogenic+Leptospira+spp.+in+the+vitreous+humor+of+horses+with+recurrent+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis.</a> Microorganisms. 9 (9), (2021).</li>
<li>Dos Santos Ribeiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+biofilms+from+an+urban+community+in+Salvador%2C+Brazil%2C+shelter+previously+uncharacterized+saprophytic%C2%A0Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira.</a> Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogenic+leptospiral+protein+encoding+gene+%28lipL32%29+in+environmental+aquatic+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms.</a> Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+Toward+a+better+understanding+of+the+environmental+lifestyle+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Water%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira.</a> Front Water. 5, 1195094(2023).</li>
<li>Dias, C. S., Pinna, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+biofilms%3A+Implications+for+survival%2C+transmission%2C+and+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management.</a> Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).</li>
<li>Gomes, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+production+of+Leptospira+spp.+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Sci+Vet%22%5BJournal%5D)">Biofilm production of Leptospira spp. strains.</a> Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).</li>
<li>Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+quantification+using+the+96-microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate.</a> Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+and+survival+of+pathogenic+Leptospires+by+formation+of+biofilm+with+Azospirillum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum.</a> FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Commun. 5, 4462(2014).</li>
<li>Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-detached+cells%2C+a+transition+from+a+sessile+to+a+planktonic+phenotype%3A+A+comparative+study+of+adhesion+and+physiological+characteristics+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).</li>
<li>Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+golden+Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+leptospirosis-associated+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses.</a> Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).</li>
<li>Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+leptospirosis%3A+Of+mice+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters.</a> Front Immunol. 8, 58(2017).</li>
<li>Guedes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+enrichment+used+in+the+EMJH+medium+%28Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris%29+for+the+cultivation+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Argent+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp.</a> Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).</li>
<li>Iraola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+reveals+wide+expression+reprogramming+of+basal+and+unknown+genes+in+Leptospira+biflexa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms.</a> mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+transcriptome+highlights+adaption+to+starvation+and+general+stress+while+maintaining+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).</li>
<li>Thibeaux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zoonotic+pathogen+Leptospira+interrogans+mitigates+environmental+stress+through+cyclic-di-GMP-controlled+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).</li>
<li>Lawrence, J. R., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms.</a> Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+techniques+for+in+situ+analysis+of+the+biofilm+matrix+%28structure%2C+composition%2C+dynamics%29+by+means+of+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Relucenti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+biofilm+imaging%3A+Focus+on+SEM+and+VP-SEM+pros+and+cons%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons.</a> Biology (Basel). 10 (1), (2021).</li>
<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+A+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells.</a> J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 & micro ; m membrane hydrophile stérile en polycarbonate</td><td>it4ip</td><td>1000M25/861N101/13</td><td></td></tr><tr><td>Habilet de revêtement en verre stérile de 12 mm</td><td>SPL</td><td>330164</td><td></td></tr><tr><td>16 % de paraformel (PFA) & nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 21G</td><td>BD Médecine</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque à 24 puits</td><td>NUNC</td><td>143982</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond en verre de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td></td></tr><tr><td>Antenne Hi-Q4 à fond en verre de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Microplaques à 96 puits</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Moyen de montage antifade &nbsp ;</td><td>Biorad</td><td>29410</td><td></td></tr><tr><td>Revêtement au carbone</td><td>Leica Microsystem</td><td>Em ACE600</td><td></td></tr><tr><td>Traceur CFDA/SE</td><td>Biolégende</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif carbone conducteur</td><td>Science de la microscopie électronique</td><td>77816</td><td></td></tr><tr><td>Violet cristal (CV)</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Microscope en champ sombre</td><td>Leica Microsystem</td><td>11888846</td><td>Leica DM4000 B équipée d’un condenseur fiel sombre (catétamètre n° et 11505142)</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>83813.36</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glaciaire</td><td>Supelco</td><td>1.00063</td><td></td></tr><tr><td>Solution de glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Hexaméthyldisilazane</td><td>Acros Organics</td><td>120581000</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Memmert</td><td>IN30</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal inversé</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica DMI6000 TCS SP8 X</td><td>Confocal microscope SP8</td></tr><tr><td>Microscope inversé équipé d’optiques à contraste de phase</td><td>Nikon</td><td>CELL-S2</td><td>BioStation IM-Q</td></tr><tr><td>Leptospira Base Moyenne EMJH&nbsp ;</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD&nbsp ; 279410</td><td>Médium EMJH pour Leptospira</td></tr><tr><td>Tétraoxyde d’osmium (OsO4)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>BCCG9181</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodure &nbsp ;</td><td>Biotium</td><td>40017</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT300</td><td></td></tr><tr><td>Tampon cacodylate de sodium &nbsp ;</td><td>Thermo-Sciences Chimiques</td><td>15453149</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Varioskan Lux</td><td>Thermo Scientific</td><td>VLBL00GD0</td><td></td></tr><tr><td>Solution physiologique stérile tamponnée phosphate</td><td>Biosolve</td><td>0016232301BS</td><td></td></tr><tr><td>Seringue (1 mL)</td><td>Chirana</td><td>CH03002L</td><td></td></tr><tr><td>Coloration SYTO9 fluorescente verte sur acide nucléique &nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr></tbody></table>

un flux de travail modulaire pour l’analyse quantitative, structurelle et fonctionnelle des biofilms de leptospira

A Modular Workflow for Quantitative, Structural and Functional Analysis of Leptospira Biofilms

Lorsque l’inoculum est correctement préparé, les cultures entrent en phase mi-logarithmique en 3 à 5 jours et présentent des valeurs de l’OD405 de ~ 0,2-0,4 avec des champs lumineux et très mobiles sous microscopie en champ sombre (≥ 90 % des cellules mobiles) et aucun amas visible. Les préparations sous-optimales se manifestent par des bactéries lentes et une motilité hétérogène à travers le champ ; De telles cultures produisent fréquemment des biofilms faibles et doivent être jetées. En pratique, confirmer la motilité et l’OD côte à côte juste avant le seeding minimise les échecs de la sortie. L’établissement de ces portes de contrôle qualité au stade de l’inocule est le meilleur prédicteur de succès dans les applications en aval. Bien que la méthodologie ait été optimisée pour L. interrogans serovar Manilae L495, les mêmes procédures ont également été appliquées à la souche de Leptospira biflexa Patoc afin de démontrer l’applicabilité inter-espèces. L. biflexa forme généralement des biofilms moins cohésifs et plus fins que L . interrogans, mais la séquence de développement caractéristique et les caractéristiques structurelles restent détectables avec des ajustements appropriés des paramètres. L’inclusion des deux espèces souligne donc l’adaptabilité du flux de travail aux Leptospira pathogènes et saprophytes.
Après 21 jours d’incubation statique à 30 °C dans une chambre humidifiée (ou la durée appropriée pour les espèces de Leptospira utilisées), les biofilms deviennent visibles à l’œil nu à la fois sur les gaines de verre et sur les membranes en polycarbonate hydrophiles. Une croissance réussie produit des motifs CV caractéristiques après 2-3 semaines, tels que des empreintes en forme de points, ramifiées ou réticulées fixées à la surface (Figure 2A).
Dans une course typique, L. interrogans de type sauvage Manilae L495 atteint ~ 50 % de couverture de surface à la semaine 3, tandis que les mutants à faible biofilm plafonnent autour de ~ 20 % et que les phénotypes à haut biofilm approchent ~ 70-80 %, établissant une plage dynamique pratique pour le dépistage. L’étendue de la formation du biofilm peut également varier selon l’espèce et la souche de Leptospira ; par exemple, la souche de L. biflexa Patoc développe des biofilms visibles plus rapidement, des études antérieures considérant les structures dès 120 heures après l’inoculation comme étant des biofilmsmatures 35.
La coloration violette cristalline offre une méthode fiable et reproductible pour quantifier la biomasse du biofilm. Dans les biofilms bien développés, la coloration entraîne une coloration violette foncée localisée à la zone du recouvrement ou de la membrane, indiquant des niveaux élevés de biomasse attachée (Figure 2A). Les indices visuels lors des étapes de coloration et de solubilisation fournissent également des indicateurs utiles du succès du protocole. Par exemple, une répartition inégale du CV ou une tache pâle peut être due à un sous-ensemencement, à une évaporation ou à un lavage agressif qui détache les premiers biofilms.
Les lectures d’absorbance à 570 nm reflètent la quantité de coloration retenue, et donc la densité relative du biofilm (Figure 2B). Dans des expériences représentatives, les cultures de L. interrogans cultivées dans des conditions optimales montrent des lectures OD₅₇₀ cohérentes et reproductibles à travers les réplications, reflétant une formation stable de biofilms. En revanche, de grandes variations entre les réplications sont souvent observées lorsque les échantillons subissent une pipetage excessive lors des changements de milieu, indiquant une mauvaise adhérence ou un décollement partiel du biofilm. Une telle variabilité doit être considérée comme un signe de problèmes techniques, et les échantillons concernés doivent être exclus ou le protocole soigneusement examiné. Notamment, L. biflexa Patoc forme des biofilms plus étendus sur les couvertures de verre et les membranes en polycarbonate dans des conditions similaires, ce qui se reflète dans des valeurs d’absorption CV plus élevées, démontrant que le protocole est adaptable et efficace pour les espèces de Leptospira .
Une préparation réussie du MEB permet de révéler des dépôts de matrices extracellulaires dès le troisième jour, suivis d’une architecture fortement polarisée dans les biofilms matures : une face basale rugueuse et canalisée (souvent avec &gt; canaux de 5 μm) qui ancre une structure interne poreuse, et une face apicale plus lisse où les spirochètes sont enchevêtrés dans une matrice dense (Figure 2C, D, E, F). Les champs à forte grossissement capturent fréquemment des filaments extracellulaires ramifiés et des protubérances occasionnelles semblables à des champignons ; caractéristiques correspondant à la dynamique de coalescence observée par le time-lapse (vidéo supplémentaire 1). Dans des préparations sous-optimales, des matrices effondrées, des charges et des contours de cellules indistincts peuvent être observés, reflétant généralement une post-fixation inadéquate, un revêtement conducteur insuffisant ou un séchage insuffisant. Lorsque la polarité basale-apicale et les canaux omniprésents sont visibles, les lectures du MEB correspondent étroitement aux estimations confocales d’épaisseur et de porosité, confirmant ainsi la réussite de la préparation et de l’imagerie.
Dans les séries en accéléré efficace, les points isolés apparaissent entre 24 et 72 heures et se regroupent progressivement en agrégats plus grands qui balayent la surface avant que les limitations d’espace ne ralentissent leur mouvement (Figure 3A, B, C). La segmentation quantitative entraîne une augmentation monotone de la surface totale couverte, tandis que les comptages agrégés augmentent, atteignent un pic, puis diminuent à mesure que les collisions et fusions dominent entre ~12 et 216 h. Ces cinétiques (surface haute, agrégats en nombre inférieur) indiquent une accrétion active plutôt qu’une simple sédimentation. Les essais ratés ou à la limite manquent de points précoces, présentent des courbes de surface plates sur le temps, ou subissent une dérive de mise au point liée à une température ou humidité instables. Maintenir un environnement stabilisé à 30 °C avec 95 % d’humidité et utiliser l’autofocus à chaque moment rétablit généralement des trajectoires claires adaptées à la comparaison de mutants ou de traitements.
Les piles Z représentatives de biofilms matures montrent une architecture multicouche en mousse, typiquement supérieure à 50 μm d’épaisseur, la plupart des cellules colorant vivantes (SYTO 9-positif) et des vides centraux occasionnels indiquant des réarrangements collectifs lors de la croissance (Figure 3D). Les sondes matricielles peuvent être utilisées pour étudier la composition matricielle : le WGA met en lumière les épitopes polysaccharides, le BOBO-3 marque l’ADN extracellulaire abondant, et les colorations sélectives protéiquement contribuent peu en dehors du signal cellulaire associé (Figure 3E). Les résultats sous-optimaux incluent des empilements minces ou discontinus dominés par l’iodure de propidium, un photoblanchiment fort ou des réglages de gain incohérents, qui sapent la comparabilité quantitative. Interpréter ensemble l’épaisseur, le biovolume et les rapports vivant/mort (tout en maintenant la puissance laser, le gain du détecteur et le trou d’épingle constants selon les conditions) confirme le statut de maturation et permet des comparaisons directes avec l’ultrastructure SEM et la biomasse CV.
Le processus de formation du biofilm de Leptospira suit généralement des phases distinctes, bien que les moments et les valeurs exacts puissent varier selon l’espèce ou la souche. En utilisant la souche de L. interrogans Manilae L495 comme référence, la progression attendue sur 21 jours comprend une phase initiale (jours 0-3) où les bactéries restent majoritairement planctoniques avec un biofilm minimal (Figure 4A). Cela est suivi d’une phase de croissance exponentielle (jours 3-7) durant laquelle les bactéries planctoniques et associées au biofilm augmentent, atteignant environ 9 x 10⁸ cellules/mL, accompagnées de formation et d’expansion d’agrégats de biofilms. Entre les jours 7 et 12, les bactéries planctoniques diminuent significativement, tandis que les cellules associées au biofilm atteignent leur pic, représentant environ 80 % de la population. Enfin, pendant la phase de maturation (jours 12-21), le nombre de bactéries biofilms diminue sans augmentation des cellules planctoniques, mais la taille et la complexité du biofilm continuent de croître. L’observation de cette séquence de changements indique que le protocole capture efficacement le développement dynamique et la maturation des biofilms de Leptospira .
Lorsqu’il est correctement réalisé, le protocole d’infection utilise des inocules contenant ~2 x 10⁸ leptopspires en 200 μL d’EMJH, préparées à partir de cultures planctoniques bien définies (5 jours) ou biofilms (21 jours). Bien que ces deux types de cultures représentent des états physiologiques distincts, cette différence est intentionnelle, car l’expérience vise à déterminer si les biofilms de Leptospira — caractérisés par une activité métabolique réduite et une différenciation structurelle — conservent la capacité d’initier une infection. Ce contraste est confirmé par des études transcriptomiques montrant des changements majeurs dans l’expression génique entre la planctonie et le biofilm Leptospira35,36. Les granulats de biofilm sont soigneusement récoltés pour préserver leur structure et rester intacts après passage à travers une aiguille de 21 G, comme confirmé avant l’injection (Figure 4C, D). Après une injection intrapéritonéale, les hamsters syriens dorés présentent généralement des signes cliniques de leptospirose dans les 3 à 5 jours (par exemple, léthargie, pelage ébouriffé, prosternation). Les témoins négatifs injectés uniquement avec un médium EMJH ne montrent aucun signe de maladie. La progression et la gravité des signes cliniques, ainsi que le délai avant l’euthanasie, varient selon l’inoculum : les bactéries planctoniques induisent souvent des symptômes plus précoces et plus aigus, tandis que les agrégats dérivés du biofilm peuvent provoquer une infection retardée mais persistante (Figure 4B). Un suivi deux fois par jour pendant jusqu’à 21 jours permet de saisir l’évolution complète de la maladie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Coloration violette cristalline, quantification et imagerie ultrastructurelle des biofilms de Leptospira. (A) Coloration violet cristal (CV) des biofilms cultivés sur différents substrats. La coloration CV permet de visualiser l’architecture du biofilm et les schémas d’attache initiaux pour différentes espèces et substrats. i. L. interrogans sur le filtre en polycarbonate ; ii. L. biflexa sur filtre en polycarbonate ; iii. L. interrogans sur une toile de verre ; iv. L. biflexa sur bâton de verre de protection. (B) Exemple de formation quantitative de biofilm évaluée par absorption CV (OD570 nm) au fil du temps pour L. interrogans et L. biflexa. Cette lecture cinétique capture à la fois la dynamique précoce de l’adhésion et de l’accumulation de biomasse, mettant en lumière les différences de croissance du biofilm entre les espèces pathogènes et saprophytes. Ce chiffre a été modifié par rapportà 27. (C-E) Microscopie électronique à balayage (SEM) des biofilms de L. interrogans : (c) biofilm vieux de 3 jours montrant la formation précoce de microcolonies et le dépôt initial de la matrice extracellulaire ; (d) un biofilm vieux de 14 jours présentant une architecture mature avec une organisation matricielle et tridimensionnelle étendue ; (e-f) Biofilm vieux de 3 semaines illustrant la consolidation structurelle et la maturation de la matrice sur une culture prolongée. Cette combinaison de coloration CV, de mesures quantitatives de l’OD et d’imagerie SEM offre une vue d’ensemble complète du développement du biofilm, de l’attache précoce à l’organisation ultrastructurale mature, permettant une comparaison directe entre espèces et durées de culture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Visualisation de la formation de biofilms de Leptospira . Les images en contraste de phase acquises avec une BioStation montrent un développement du biofilm à (A) 48 h, (B) 96 h et (C) 144 h. (D) reconstruction CLSM d’un biofilm Leptospira affichant un biovolume total avec des tranches orthogonales pour une visualisation 3D. (E) Coloration confocale d’un biofilm mature avec DAPI (vert) et WGA (rouge), mettant en lumière les cellules bactériennes et les composants de la matrice extracellulaire. Ce chiffre a été modifié par rapportà 37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Quantification résolue dans le temps des fractions planctoniques et de biofilms et évaluation fonctionnelle des biofilms de Leptospira . (A) Cinétique de formation de biofilms mesurée par absorption à 405 nm. Pour chaque point temporel, des relevés ont été effectués sur le puits total, la fraction de biofilm et le surnageant contenant des leptospires planctoniques, permettant de distinguer les bactéries attachées et les bactéries nageant librement. (B) Exemples de courbes de survie de hamsters injectés avec des agrégats de biofilms, des leptospières planctoniques ou un contrôle EMJH. Les animaux injectés au biofilm présentent une virulence réduite, certains survivant 21 jours, tandis que les leptospires planctoniques provoquent une mortalité rapide. (C-D) Validation préliminaire de l’intégrité du biofilm : les granulats sont visibles dans la seringue avant l’injection (C) et restent intacts après le passage à travers une aiguille de 21 G (D, flèches blanches), confirmant que la structure du biofilm est préservée lors de la manipulation. Ce chiffre a été modifié par rapportà 36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>

Un flux de travail modulaire pour l’analyse quantitative, structurelle et fonctionnelle des biofilms de Leptospira

Here, we present an integrated suite of protocols for the cultivation, quantitative monitoring, structural and functional characterization of Leptospira ...

a-modular-workflow-for-quantitative-structural-functional-analysis

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les biofilms formés sur les surfaces dentaires sont très complexes et constamment exposés à innée et exogènes aux défis environnementaux, qui modulent leur architecture, la physiologie et du transcriptome. Nous avons développé une boîte à outils pour examiner la composition, l'organisation structurelle et l'expression des gènes des biofilms buccaux, qui peut être adapté à d'autres domaines de la recherche biofilm.

Une analyse boîte à outils de l&#39;évaluation biochimique, structurel et transcriptomique globale des biofilms buccaux médiée par Streptococcus mutans

La conception d'un encodage opéron synthétique à la fois l'appareil sécrétoire et les monomères de fibres structurelles curli est décrite. Surproduction de ces amyloïdes et les polymères adhérentes permet un gain mesurable de l'adhésion de...

Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon

Un protocole pour la quantification et la comparaison simultanées de trois composants cellulaires et extracellulaires dans des biofilms est présenté. La méthodologie implique l’utilisation d’une microscopie confocale à balayage laser, d’un logiciel d’analyse structurelle et de visualisation de biofilm et d’un logiciel d’analyse statistique.

Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms

Le but de ce document sur les méthodes est de décrire l'utilisation d'un système microfluidique pour le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent généralement des espèces identifiées dans la plaque dentaire supra-gingival humain. Méthodes pour décrire l'architecture du biofilm, biofilm viabilité, et une approche de la récolte biofilm pour les analyses de culture-dépendante ou indépendante de la culture sont mis en évidence.

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

Cette étude présente le développement de méthodologies reproductibles pour étudier les inhibiteurs de biofilm et leurs effets sur la multicellularité de Bacillus subtilis.

Méthodologies pour l&#39;étude<em&gt; B. subtilis</em&gt; biofilms comme un modèle pour Caractériser Inhibiteurs biofilm petites molécules

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer et analyser qualitativement les biofilms bactériens sur les hyphes fongiques par microscopie confocale et électronique.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Nous décrivons la fixation, enrobage de paraffine et des techniques de sectionnement minces pour les biofilms de colonies microbiennes. Dans les échantillons préparés, patrons de biofilm sous-structure et reporter d’expression peuvent être visualisées par microscopie.

Enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes Biofilms pour analyse microscopique

L’imagerie des cellules bactériennes est une approche émergente de biologie des systèmes axée sur la définition de processus statiques et dynamiques qui dictent la fonction de grandes machines macromoléculaires. Ici, l’intégration de l’imagerie cellulaire vivante quantitative et de la tomographie cryo-électronique est utilisée pour étudier l’architecture et les fonctions du système de sécrétion de type IV de Legionella pneumophila.

Appliquer l’imagerie cellulaire en direct et la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion Legionella pneumophila Dot/Icm

Les modifications induites par les antimicrobiens de l’architecture du biofilm de Pseudomonas aeruginosa diffèrent entre les isolats cliniques cultivés chez des patients atteints de mucoviscidose et d’infection pulmonaire chronique. Après la microscopie confocale, le logiciel COMSTAT peut être utilisé pour quantifier les variations de l’architecture du biofilm (p. ex., surface, épaisseur, biomasse) pour des isolats individuels afin d’évaluer l’efficacité des agents anti-infectieux.

Quantification des effets des antimicrobiens sur l’architecture des biofilms in vitro à l’aide du logiciel COMSTAT

Ici est décrit la procédure de mise en œuvre dans le Groupe Membrane Biology Caffrey structurale et fonctionnelle de mettre en place manuellement des essais de cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

Découvrez une méthode modulaire pour analyser quantitativement et structurellement les biofilms de Leptospira. Ce protocole standardisé combine cristal violet, microscopie et modèles in vivo pour étudier la dynamique et l'architecture des biofilms.

Un flux de travail modulaire pour l’analyse quantitative, structurelle et fonctionnelle des biofilms de Leptospira

Explorer plus de vidéos