Ingénierie de cellules tueuses naturelles à récepteur antigénique chimérique ciblant les infections fongiques à l’aide du système de transposon non viral de la Belle au bois dormant

Nous décrivons un protocole de transfection pour produire des cellules tueuses naturelles à récepteur antigénique chimérique (CAR-NK) ciblant les agents pathogènes fongiques à l’aide du système de transposon non viral de la Belle au bois dormant. Pour évaluer l’activation spécifique de l’antigène, nous avons co-cultivé les cellules modifiées avec des tubes germinaux d’Aspergillus fumigatus et mesuré la sécrétion d’IFN-γ.

Notre recherche se concentre sur le développement d’une thérapie cellulaire CAR prête à l’emploi pour les infections fongiques invasives. Notre objectif est d’identifier les meilleures cibles, les conceptions de CAR et la combinaison de cellules immunitaires afin d’obtenir des résultats thérapeutiques optimaux. Les développements récents, y compris nos propres travaux, se sont concentrés sur le développement de thérapies à base de cellules CAR-T ciblant Aspergillus fumigatus.

Ces cellules modifiées ont montré des résultats prometteurs dans des modèles précliniques en réduisant considérablement la charge fongique, en contrôlant l’immunité antifongique et en améliorant la survie globale. À l’heure actuelle, la plupart des recherches dans ce domaine se concentrent sur la production de cellules CAR-T spécifiques à un ensemble très limité de cibles à l’aide de vecteurs viraux ou du système de transposon de la belle au bois dormant. Les principaux défis consistent à identifier les cibles fongiques optimales et à produire un produit cellulaire prêt à l’emploi, à la fois efficace et évolutif pour les applications cliniques.

Avec ce protocole, nous répondons au besoin de méthodes rentables et évolutives pour générer des cellules CAR-NK non virales. Il fournit une approche accessible pour le dépistage de nouvelles cibles antifongiques, constituant une étape fondamentale vers la thérapie cellulaire CAR-NK prête à l’emploi pour les infections fongiques. Pour commencer, vérifiez les cellules NK-92 au microscope pour les grappes dans un fond clair, ajoutez 2 millilitres de milieu de culture cellulaire par puits pour chaque condition dans une plaque à six puits et placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Transférez 8 fois 10 à la puissance de 6 cellules NK-92 dans un tube à fond conique de 15 millilitres et centrifugez le tube à 200 G pendant cinq minutes avec une accélération et une décélération de 3. Après avoir jeté le surnageant, remplissez le tube contenant la pastille cellulaire avec jusqu’à 15 millilitres de PBS préchauffé et centrifugez à nouveau. Pendant la centrifugation, pipetez 8 microgrammes d’ADN plasmidique Af-CAR et 4 microgrammes de minicercle SB100X dans un tube de réaction et gardez l’ADN du deuxième tube libre pour servir de contrôle fictif.

Pour le système de transfection, ajoutez 3 millilitres de tampon électrolytique dans le premier tube et placez-le dans la station de pipette. Après la centrifugation, jetez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon de remise en suspension. Ajoutez ensuite 100 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des deux tubes de réaction et mélangez doucement.

Pipetez le mélange de cellules d’ADN à partir du premier tube de réaction à l’aide de la pipette du système de transfection, insérez la pipette de transfection verticalement dans le tube de la station de pipette. Réglez la première impulsion à 1 650 volts et la durée de l’impulsion pendant 20 millisecondes avant d’appuyer sur start pour initier l’impulsion. Après la première impulsion, réglez la deuxième impulsion sur 500 volts et le temps d’impulsion sur 100 millisecondes et lancez la deuxième impulsion.

Une fois la deuxième impulsion terminée, retirez lentement la pipette de la station de pipette. Transférez immédiatement les cellules dans un puits de la plaque de culture préparée contenant 2 millilitres de milieu de culture cellulaire préchauffé et déplacez doucement la plaque dans un mouvement circulaire pour répartir uniformément les cellules. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après 30 minutes d’incubation, ajoutez de l’interleukine-2 dans les puits à une concentration finale de 150 unités internationales par millilitre. Pour commencer, transfectez les cellules NK-92 avec le plasmide souhaité. Transférez les cellules dans un tube à fond conique de 15 millilitres.

Ensuite, centrifugez les cellules et diluez-les à une concentration de 1 à 2 fois 10 à la puissance 6 cellules par 100 microlitres à l’aide du tampon. Ajoutez un microlitre de biotine anti-EGFR-T par 1 fois 10 à la puissance de 6 cellules et mélangez doucement pour vous assurer que la solution est uniformément répartie. Incuber le tube pendant 25 minutes à 4 degrés Celsius.

Après l’incubation, remplissez le tube avec jusqu’à 10 millilitres de tampon. Ensuite, centrifugez le tube à 200 G pendant cinq minutes avec une accélération et une décélération de 3, et jetez le surnageant après centrifugation. Ajoutez ensuite 8 microlitres de tampon froid suivis de deux microlitres de billes magnétiques anti-biotine par 1 fois 10 à la puissance 6 cellules.

Incuber le tube pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Pour laver les cellules, remplissez le tube avec jusqu’à 10 millilitres de tampon et centrifugez. Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon.

Placez une colonne LS dans l’aimant max et lavez-la avec 3 millilitres de tampon. Ajoutez la suspension de cellule une fois que la mémoire tampon a complètement migré dans la colonne. Après avoir lavé la colonne, retirez-la de l’aimant et placez-la dans un tube à fond conique propre de 15 millilitres.

Ajoutez 5 millilitres de tampon à la colonne et utilisez le piston pour rincer les cellules positives EGF-R le plus rapidement possible. L’efficacité de la transfection après récupération a atteint 10 à 20 % et l’enrichissement maximal a augmenté la pureté des cellules Af-CAR-NK-92 à plus de 95 %. Pour commencer, obtenez des cellules NK-92 enrichies exprimant le transgène en utilisant la technique de tri cellulaire activée magnétiquement. Préparez ensuite une suspension de conidies d’Aspergillus fumigatus à une concentration de 2,5 fois 10 à la puissance 5 conidies par millilitre dans le milieu.

Versez 100 microlitres de suspension de conidies dans chaque puits d’une plaque de culture de 96 puits et incubez la plaque à 25 degrés Celsius pendant 16 heures. Le deuxième jour, lavez deux fois les cellules NK-92 simulées et transfectées par plasmide avec le milieu et ajoutez 5 fois 10 à la puissance de 4 cellules NK-92 dans 100 microlitres de milieu par puits de la plaque contenant le champignon à co-cultiver. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone humidifié pendant au moins 6 heures.

Après avoir centrifugé la plaque à 300 G pendant cinq minutes, récoltez 100 microlitres de surnageant de chaque puits sans toucher le fond. Enfin, transférez les surnageants dans des tubes de réaction pour effectuer l’ELISA. Les cellules Af-CAR-NK-92 ont montré une sécrétion d’interféron gamma significativement plus élevée que les cellules NK-92 fictives lors de la co-culture avec des tubes germinaux d’aspergillus fumigatus.