Name: Test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez le profilage polysomique pour étudier la régulation traductionnelle chez Arabidopsis thaliana sous stress thermique. Cette méthode standardisée permet d'analyser l'efficacité de traduction et d'améliorer la résilience des cultures.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Analyse de la régulation translationnelle chez Arabidopsis soumis à un stress thermique

<ol><li>Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+translation+regulation+in+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">The significance of translation regulation in the stress response.</a> BMC genomics. 14, 1-11 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+machinery%3A+the+basis+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genom%22%5BJournal%5D)">Translation machinery: the basis of translational control.</a> J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).</li>
<li>Dever, T. E., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation%2C+termination%2C+and+recycling+phases+of+translation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Dennis, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+Arabidopsis+thaliana+CK2+holoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).</li>
<li>Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+CK2+enhances+the+in+vitro+interaction+of+multifactor+complex+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).</li>
<li>Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOR+and+RPS6+transmit+light+signals+to+enhance+protein+translation+in+deetiolating+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).</li>
<li>Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphorylation+of+carboxyl-terminal+eIF2%CE%B1+by+SPA+kinases+contributes+to+enhanced+translation+efficiency+during+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis.</a> Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).</li>
<li>Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+translational+control+contributes+to+the+regulation+of+Arabidopsis+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis.</a> Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).</li>
<li>Des Marais, D. L., Juenger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropy%2C+plasticity%2C+and+the+evolution+of+plant+abiotic+stress+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance.</a> Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+for+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Physio+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Metabolomics for plant stress response.</a> Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+heat+stress+and+drought+stress+in+pearl+millet+based+on+Pacbio+full-length+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing.</a> BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).</li>
<li>Wasternack, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+jasmonates+in+plant+stress+responses+and+development-applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects.</a> Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+induction+during+NLR-mediated+immunity+in+plants+is+dynamically+regulated+by+CDC123%2C+an+ATP-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein.</a> Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).</li>
<li>Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stress+granules%3A+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Plant stress granules: trends and beyond.</a> Front Plant Sci. 12, 722643(2021).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+is+induced+by+a+threshold+temperature+rather+than+a+temperature+difference+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis.</a> J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).</li>
<li>Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+stress+granules+and+processing+bodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants.</a> Plants. 9 (9), 1122(2020).</li>
<li>Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+crop+yields+and+their+variability+at+different+levels+of+global+warming%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Sys+Dyn%22%5BJournal%5D)">Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming.</a> Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (87), e51164(2014).</li>
<li>Hsieh, E. J., Cheng, M. C., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+an+abiotic+stress-inducible+transcription+factor+AtERF53+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of an abiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Mol Biol. 82, 223-237 (2013).</li>
<li>Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ETHYLENE+RESPONSE+FACTOR1+regulates+abiotic+stress-responsive+gene+expression+by+binding+to+different+cis-acting+elements+in+response+to+different+stress+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals.</a> Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).</li>
<li>Van den Broeck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+network+to+phenotype%3A+the+dynamic+wiring+of+an+Arabidopsis+transcriptional+network+induced+by+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress.</a> Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+and+identification+of+newly+synthesized+proteomes+with+bioorthogonal+non-canonical+amino-acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging.</a> Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+de+novo+protein+synthesis+in+starvation-induced+autophagy+using+bioorthogonal+noncanonical+amino+acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Acad+Press%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging.</a> Acad Press. 588, 41-59 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tube Eppendorf 1,5 mL</td><td>Labcon</td><td>3012-870-000-9</td><td>Extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>ultracentrifugation</td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Honeywell</td><td>32712</td><td>Profil polysome</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Honeywell</td><td>32211</td><td>Extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-C7698</td><td>Profil des polysomes</td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>GeneChip Kit de contrôle d’ARN polycaryote Eucaryote</td><td>Invitrogen</td><td>900433</td><td>Normalisation</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Honeywell</td><td>15523</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H3149</td><td>Profil polysome</td></tr><tr><td>HiScript III RT SuperMix pour qPCR kit</td><td>Vazyme</td><td>R323-01</td><td>Normalisation</td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp ; 3040-01</td><td>Profil polysome</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-M8266</td><td>Profil polysome</td></tr><tr><td>MS milieu basal</td><td>Phyto</td><td>M524</td><td>Culture végétale</td></tr><tr><td>Peak Chart Seringue Pompe</td><td>à seringue Brandel</td><td>SYN4007LS</td><td>Profil polysome</td></tr><tr><td>Polyoxyéthylène-10-Tridécyl-Ether (PTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td>Profil</td></tr> <tr><td>polysomeRNasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td>Profil polysomique</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium (DOC)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-D6750</td><td>Profil polysome</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td>Profil polysome</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>BP170-8882</td><td>Normalisation</td></tr><tr><td>Réactif TRI</td><td></td><td>MRC TR118</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp ; 4109-06</td><td>Profil polysome</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100K</td><td>ultracentrifugation</td></tr><tr><td>UV/VISDETECTOR</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>Profil polysome</td></tr></tbody></table>

test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

Le type sauvage d’Arabidopsis, Col-0, a été cultivé sur un milieu MS sous une photopériode de lumière de 16 h : 8 h. Pour le contrôle, des semis âgés de 5 jours ont été utilisés sans traitement de stress thermique. Le groupe de stress thermique a subi 1 h de traitement thermique à 40 °C dans un bain-marie préchauffé, tandis que le groupe de récupération a été placé à 22 °C pendant 2 h immédiatement après le traitement thermique. En utilisant différentes conditions de traitement thermique et de récupération, nous pouvons utiliser les étapes ultérieures pour mesurer leur efficacité translationnelle.
Avant l’extraction de l’ARN, le gradient de saccharose doit d’abord être préparé. Pour séparer l’ARN non polysomal et l’ARN polysomal en fonction de leur différence de densité, nous avons préparé une solution de gradient avec des concentrations de saccharose de 12,5 %, 24,4 %, 36,3 %, 48,1 % et 60 %. Nous avons ensuite chargé les solutions de gradient de haute à faible concentration, en commençant par le bas (Figure 1A). Par la suite, nous pouvons utiliser ce gradient pour séparer l’ARN non polysomal de faible densité dans la couche supérieure, tandis que l’ARN polysomal de plus haute densité sera distribué dans la couche inférieure avec des concentrations de saccharose plus élevées. L’ARN non polysomique et polysomique a été extrait du Col-0 traité ou non traité. Pour éviter que les particules dans la solution n’affectent les résultats de l’analyse du profilage des polysomes, la solution contenant de l’ARN doit être filtrée à travers une crépine cellulaire pour obtenir une solution d’extraction sans particules. Le surnageant filtré a été chargé sur un gradient de saccharose pré-préparé et équilibré. Après l’ultracentrifugation d’échantillons chargés en gradient de saccharose, les ARN non polysomiques et polysomaux ont été distribués en fonction de la densité au sein du gradient de saccharose. Par la suite, le profilage des polysomes a été effectué à l’aide d’un fractionneur à gradient de densité (Figure 1B). Le fractionneur de gradient de densité est contrôlé à l’aide d’un logiciel initialement calibré avec de l’eau déminéralisée. Après l’étalonnage, les échantillons sont chargés sur le fractionneur après l’ultracentrifugation. Fonctionnant en mode de contrôle logiciel, la pousse-seringue à microvolume injecte une solution de saccharose dont les concentrations sont supérieures au gradient de saccharose dans le gradient, poussant l’échantillon. Cela permet de commencer par le haut du gradient de saccharose, où la densité est plus faible, et de se poursuivre vers le bas, où la densité est plus élevée. Par la suite, les paramètres du logiciel sont activés pour commencer l’acquisition des données, générant le graphique de profil des polysomes par mesure de la DO254 (Figure 1B). Lorsque nous observons une intensité de signal plus élevée dans la fraction polysomale, cela indique que l’échantillon présente une efficacité de traduction plus élevée.
La figure 2 montre le profil des polysomes pour les plants de Col-0 âgés de 5 jours sous différents traitements. Les résultats du groupe témoin démontrent une séparation claire entre la fraction non polysomique et la fraction polysomale (Figure 2A). Cependant, après 1 h de stress thermique à 40 °C, l’intensité du signal de la fraction polysomale a significativement diminué (Figure 2B). Lorsque les plantules traitées thermiquement ont été laissées récupérer à 22 °C pendant 2 h, l’intensité du signal de la fraction polysomale s’est rétablie à un niveau similaire à celui du groupe témoin (figure 2C). Nos résultats ont démontré qu’un traitement de stress thermique de 1 h réduisait significativement l’efficacité de traduction des plantules d’Arabidopsis. Cependant, les plantes ont eu besoin de 2 h de récupération pour rétablir l’efficacité de traduction à des niveaux comparables à ceux des plantules ne souffrant pas de stress thermique.
Pour recueillir des preuves supplémentaires comparant l’efficacité de traduction des semis Col-0 dans différentes conditions de traitement, nous avons isolé et extrait les fractions d’ARN non polysomiques et polysomiques. La collecte des fractions d’ARN non polysomiques et polysomiques a été guidée par les résultats des mesures du profil des polysomes. Pour l’extraction d’ARN non polysomiques et polysomaux, nous utilisons le réactif de thiocyanate de phénol/guanidinium pour extraire les échantillons isolés d’ARN non polysomiques et polysomaux. Avec la méthode d’extraction de l’ARN que nous avons utilisée, nous pouvons obtenir un ARN stable et de haute qualité pour notre analyse suivante (Tableau 1). Par la suite, normalisez l’ARN extrait avec le kit de contrôle de l’ARN poly-A eucaryote GeneChip pour atténuer les erreurs causées par des pertes d’extraction variables. Ensuite, la PCR en temps réel a été utilisée pour quantifier l’expression des gènes DAP , qui sont inclus dans les gènes de B. subtilis ajoutés au kit. Une analyse comparative des niveaux d’expression du gène DAP entre les groupes d’ARN non polysomiques et polysomaux a été effectuée pour estimer la teneur en ARN dans des conditions de perte proportionnelle (figure 3A). Nous avons calculé le rapport entre l’ARN polysomal normalisé et l’ARN total afin de clarifier l’efficacité de traduction entre eux (Figure 3B). Enfin, le rapport d’ARN dans les polysomes a été calculé à l’aide de la teneur en ARN normalisée (Figure 3C). Les résultats du rapport d’ARN dans les polysomes sous différents traitements de Col-0 ont montré un modèle cohérent avec les résultats du profil des polysomes présentés à la figure 2A. Les deux résultats indiquent que le stress thermique réduit significativement le rapport d’ARN dans la fraction polysomale, et cet effet peut être inversé après une récupération de 2 heures à 22 °C (Tableau 1).
À partir de cette méthode, nous pouvons obtenir la fraction entière d’ARN non polysomale ou polysomale de haute qualité plutôt que de séparer l’ARN en fractions supplémentaires23. Nos résultats démontrent également que les profils de polysomes et le pourcentage d’ARN dans les polysomes peuvent refléter efficacement l’efficacité de traduction chez Arabidopsis avec différentes conditions traitées.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de travail du profilage des polysomes. (A) Illustration schématique de la préparation du gradient de saccharose dans un tube à centrifuger de 13 ml. (B) L’organigramme illustre le processus expérimental de profilage des polysomes. Tout d’abord, le translatome est extrait. Par la suite, les ARN non polysomiques et polysomaux sont séparés en fonction de leurs différences de densité par ultracentrifugation dans des gradients de saccharose de densités variables. La DO254 est mesurée à l’aide d’un fractionneur de gradient de densité pour obtenir le graphique de résultat de profilage des polysomes ci-dessous. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig02.jpg"> Figure 2 : Profilage des polysomes de Col-0 dans différentes conditions. (A, B, C) Le profilage des polysomes donne les résultats du Col-0 dans des conditions de (A) aucun traitement thermique (contrôle), (B) traitement thermique à 40 °C pendant 1 h et (C) récupération à 22 °C pendant 1 h après traitement thermique. Les ARN non polysomiques et polysomaux ont été fractionnés à l’aide d’un gradient de 12,5 % à 60 % de saccharose. Les positions de l’ARN non polysomique (NP) et polysomique (PL) sont indiquées sur les profils. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig03.jpg"> Figure 3 : Schéma du flux de travail d’extraction d’ARN non polysomique et polysomale. (A) Une illustration de la normalisation de l’ARN par spike in. (B) Une illustration de la séparation de l’ARN non polysomal et polysomal et du calcul du pourcentage d’ARN polysomal. (C) Le pourcentage d’ARN polysomique dans Col-0 traité avec différentes affections. Les barres d’erreur indiquent la moyenne ± ET (n = 3 répétitions biologiques). *la valeur p &lt; 0,01, test t de Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Contenu (ng)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Contrôle</td>
			<td>ARN NP</td>
			<td>758.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>ARNPL</td>
			<td>302.3</td>
			<td>2.21</td>
			<td>2.13</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Stress thermique</td>
			<td>ARN NP</td>
			<td>821.5</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.15</td>
		</tr><tr><td>ARNPL</td>
			<td>174.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Récupération</td>
			<td>ARN NP</td>
			<td>797.2</td>
			<td>2.17</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>ARNPL</td>
			<td>300.9</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.18</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Contenus et qualités des ARN non polysomiques et polysomiques. Ce tableau a montré que le contenu et les qualités de l’ARN ont été analysés. La teneur en ARN a été normalisée après l’extraction à l’aide de méthodes modifiées.

Test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

translation-efficiency-test-using-polysome-profiles-under-heat-stress

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

L’objectif global de la technique de profilage polysome est analyse de l’activité traductionnelle de différents mRNAs ou transcriptome ARNm au cours de la synthèse des protéines. La méthode est importante pour les études de règlement de la synthèse de protéine, l’activation de la traduction et répression en santé et les maladies humaines multiples.

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Nous présentons ici un protocole pour effectuer le polysome profilage sur le cœur isolé perfusé souris. Nous décrivons des méthodes pour la perfusion cardiaque polysome profilage et analyse des fractions polysome en ce qui concerne les ARNm, miARN et le protéome polysome.

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

Nous présentons une technique pour stabiliser rapidement les complexes translationnels (biosynthèse des protéines) avec réticulation du formaldéhyde dans les cellules de levures et de mammifères vivantes. L’approche permet de disséquer les intermédiaires transitoires et les interactions dynamiques ARN:protéine. Les complexes réticulés peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que les méthodes de profilage basées sur le séquençage en profondeur, la microscopie et la...

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Transformation d&#39;ADN plasmidique dans E. coli en utilisant la méthode du choc thermique

Dans cette vidéo, nous allons décrire une méthode d'évaluation de la réaction psychophysiologiques personne au stress en utilisant le biofeedback. Nous présenterons également des directives générales pour la planification du traitement.

Évaluation du stress psychophysiologiques utilisant le biofeedback

Découvrez le profilage polysomique pour étudier la régulation traductionnelle chez Arabidopsis thaliana sous stress thermique. Cette méthode standardisée permet d'analyser l'efficacité de traduction et d'améliorer la résilience des cultures.

Test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique

Explorer plus de vidéos