Détermination de quatre composants dans un système d’administration d’ARN de nanoparticules lipidiques par chromatographie liquide combinée à un détecteur de diffusion de la lumière par évaporation

Nos recherches portent sur l’application de la chromatographie de masse dans le domaine des acides nucléiques, des protéines peptidiques et des CDT. Le défi de cette expérience réside dans la séparation de plusieurs composants de LNP et la détermination de composants ayant des concentrations significatives différentes et des problèmes résiduels. L’avantage de ce protocole est qu’il permet une bonne séparation, une large plage linéaire et une détermination du courant des LNP à faible coût.

Pour commencer, mettez en place un système de chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, couplé à un détecteur de diffusion de lumière par évaporation. Installez la colonne chromatographique en suivant la direction de la flèche sur la colonne. Connectez une extrémité à la sortie de l’échantillonneur automatique et l’autre à l’entrée du détecteur de diffusion de lumière par évaporation.

Pour préparer la phase A, mesurez et transférez avec précision 1 387 microlitres de triéthylamine et dissolvez-la dans 1000 millilitres d’eau. Mélangez bien et ajustez le pH à sept à l’aide d’acide acétique. Pour préparer la phase B, dissolvez 1 387 microlitres de triéthylamine dans 1000 millilitres de méthanol.

Mélangez soigneusement et ajustez le pH à sept avec de l’acide acétique. Placez la phase A et la phase B dans le plateau. Lancez le logiciel LabSolutions et ouvrez la fenêtre d’analyse en temps réel.

Cliquez sur Fichier et sélectionnez Nouveau pour créer un nouveau fichier de méthode, modifiez le temps d’arrêt de la chromatographie liquide à 15 minutes, puis cliquez sur Appliquer à tout le temps d’acquisition. Cliquez ensuite sur Pompe et modifiez les paramètres de la pompe. Sélectionnez le mode d’analyse binaire à gradient de pression élevé, ou BGE, et réglez le débit sur un millilitre par minute.

Réglez la concentration initiale de la pompe B à 80 %Modifiez le gradient de phase mobile à trois minutes à 80 % à 85 % à 85 % de 5,5 à 12 minutes à 100 % et à 12,1 minutes, laissez la pompe revenir à 80 % Cliquez maintenant sur Four à colonne et réglez la température du four à 55 degrés Celsius. Cliquez ensuite sur ELSD pour modifier la température du tube de dérive à 40 degrés Celsius et enregistrer la méthode. Cliquez sur Télécharger et démarrer pour démarrer et équilibrer l’instrument.

Pesez avec précision 10 milligrammes de chacune des quatre substances standard composant les nanoparticules lipidiques séparément. Dissoudre chacun dans un millilitre de méthanol et vortex jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous pour obtenir des solutions mères avec une concentration de 10 milligrammes par millilitre pour chaque composant. À l’aide d’une pipette, transférez avec précision 100 microlitres de chaque solution mère dans un flacon d’échantillon.

Ajouter 600 microlitres de méthanol et bien mélanger pour préparer une solution intermédiaire mélangée, avec une concentration de 1000 microgrammes par millilitre. Maintenant, transférez avec précision 20 microlitres de chaque solution mère dans un flacon d’échantillon. Ajouter 920 microlitres de méthanol et bien mélanger pour préparer une solution intermédiaire mixte deux avec une concentration de 200 microgrammes par millilitre.

Préparer une série de solutions étalons à différentes concentrations par dilution en série. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez avec précision 100 microlitres de l’échantillon dans un flacon d’échantillon. Ajoutez ensuite 900 microlitres de méthanol et mélangez bien pour assurer une dilution décuplée des nanoparticules lipidiques et leur dissociation du médicament à base d’acide nucléique.

Placez les solutions étalons et les solutions d’échantillon dans l’échantillonneur automatique du chromatographe liquide. Cliquez sur lot en temps réel dans la barre d’outils de l’assistant de la fenêtre d’analyse en temps réel. Ensuite, cliquez sur Nouveau dans le menu Fichier pour créer une table de lots.

Dans le tableau des lots, entrez le numéro du flacon, le nom du plateau, le fichier de données et le volume d’injection des solutions étalon et de l’échantillon. Sélectionnez le fichier de méthode enregistré et cliquez sur Enregistrer le fichier de commandes dans le menu Fichier. Attendez que la pression du chromatographie liquide et la ligne de base du chromatogramme soient stables.

Cliquez ensuite sur démarrer le lot en temps réel dans la barre d’outils de l’assistant pour lancer l’acquisition des données. Pour l’analyse des données, ouvrez la fenêtre du navigateur du logiciel LabSolutions. Faites glisser les données de la solution standard dans la vue des résultats quantitatifs pour établir une courbe d’étalonnage.

Modifiez les paramètres de traitement des données en cliquant sur Modifier dans la vue méthode. Dans la fenêtre des paramètres d’intégration, remplacez l’algorithme d’intégration par I-PeakFinder et définissez le type de référence sur Base à Base. Ensuite, dans les paramètres d’identification, définissez la méthode d’identification sur bande et définissez la bande passante par défaut sur 0,1 minute.

Pour modifier les paramètres quantitatifs, remplacez la méthode quantitative par une norme externe. Réglez le nombre de niveaux d’étalonnage sur sept. Sélectionnez ensuite le type de courbe d’étalonnage de manière exponentielle et modifiez les paramètres du composé.

Entrez les noms et les concentrations de solution standard des quatre composants des nanoparticules lipidiques. Double-cliquez sur l’apex du pic pour mettre à jour les temps de rétention. Cliquez sur Afficher pour terminer la modification des paramètres de traitement des données.

Maintenant, modifiez le type d’échantillon dans la vue des résultats quantitatifs en point de calcul standard. Réglez les niveaux de la solution étalon de un à sept en fonction des concentrations. Une fois les courbes d’étalonnage établies, cliquez sur Fichier dans la barre de menu et Enregistrez le fichier de méthode.

Faites glisser les données de l’échantillon dans la vue des résultats quantitatifs de la fenêtre du navigateur. Observez les résultats de concentration affichés des quatre composants des nanoparticules lipidiques dans les échantillons. L’analyse de la solution étalon LNP a permis d’obtenir une séparation de base avec un degré de séparation supérieur à 1,5 pour les quatre composants, et aucun résidu n’a été observé dans les solutions étalons à forte concentration.

La courbe d’étalonnage des quatre composantes a montré des coefficients de corrélation supérieurs à 0,999 dans la plage de concentration de cinq à 250 microgrammes par millilitre, ce qui indique une excellente linéarité. La méthode a montré une reproductibilité élevée, avec un écart-type relatif pour un temps de rétention inférieur à 0,1 % et un écart-type relatif pour la surface du pic inférieur à 2 %, sur la base de six injections répétées de 10 microgrammes par millilitre de solution étalon. L’analyse d’échantillons réels de LNP dilués 10 fois avec du méthanol a montré des concentrations de composants allant de 150 microgrammes par millilitre à 1 500 microgrammes par millilitre, permettant d’obtenir une séparation et une sensibilité constamment élevées chez plusieurs fabricants.