Tests de fluorescence pour l’étude de l’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec le récepteur immunitaire SLAMF1

Notre recherche fournit un guide utile pour étudier l’interaction biochimique entre Microbacterium tuberculosis et les capteurs microbiens exprimant des microphages humains et sera pertinente pour les molécules plus rigides qui jouent un rôle dans l’entrée de Microbacterium tuberculosis dans les fibrocytes. L’interaction des récepteurs a été étudiée au fil des ans à l’aide d’approches qui utilisent généralement l’utilisation de machines rapporteures, de molécules hermétiques, de protéines recombinantes nivelées, de knockout, de knockdown, de modèles d’expression plus faibles. Ces techniques peuvent être difficiles, longues et parfois coûteuses.

En utilisant le protocole publié, nous montrons, pour la première fois, que dans les macrophages, le récepteur SLMF1 interagit avec mycobacterium tuberculosis, favorisant l’absorption bactérienne et conduisant à la maturation endolysosomale. Nous avons surmonté les difficultés liées aux expériences d’expression génique et nous avons décrit une nouvelle cible pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre protocole offre deux alternatives pour détecter l’interaction biochimique entre Microbacterium tuberculosis et le capteur microbien SLMF1 à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie à fluorescence, deux techniques généralement disponibles et utilisées avec succès.

Cette méthodologie a de nombreuses utilisations potentielles et peut être facilement adaptée dans d’autres contextes de recherche. Nous fournissons un protocole simple qui évalue l’interaction des récepteurs de mycobacterium tuberculosis à l’aide de bactéries inactivées et sonicées à cellules entières, ce qui peut être réalisé dans des conditions BSL2, mais facilement adapté à d’autres récepteurs et souches vivantes. Si nécessaire, ces tests pourraient également être effectués dans des conditions de BSL3 avec différents agents pathogènes vivants.

Pour commencer, transférez soigneusement le sang prélevé sur des donneurs sains dans des tubes de 50 millilitres et diluez-le à la moitié de son volume avec une solution saline. Préparez un milieu à gradient de densité et centrifugez l’échantillon pour séparer les cellules mononucléées du sang périphérique, les PBMC. Collectez les PBMC du halo blanchâtre.

Après avoir compté les cellules dans une chambre de comptage cellulaire, effectuez une sélection magnétique avec des billes CD14 pour collecter les monocytes CD14 positifs. Remettez ensuite en suspension les cellules isolées dans le milieu RPMI 1640. Semez 500 microlitres de monocytes CD14 positifs à une concentration de un fois 10 à la puissance six cellules par millilitre dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits en l’absence de sérum pour favoriser l’observance.

Après deux heures, lavez les puits avec un milieu RPMI 1640 préchauffé pour éliminer les cellules non adhérentes. Différenciez les monocytes en macrophages à l’aide d’un millilitre de milieu RPMI 1640 complet pendant 16 à 18 heures. Le lendemain, lavez les puits avec un millilitre de PBS et ajoutez un millilitre de média RPMI 1640 complet dans chaque puits.

Stimulez les macrophages avec 10 microlitres d’antigènes soniqués de mycobacterium tuberculosis pendant 24 heures. Le lendemain, à l’aide d’une pipette P-1000, jeter le milieu RPMI complet des puits de la plaque. Ajoutez du PBS froid et pipetez de haut en bas pour récolter les macrophages.

Transférez les cellules dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un tampon d’essai de radio-immunoprécipitation supplémenté.

Incuber la suspension sur de la glace pendant une heure, en tourbillonnant toutes les 10 minutes. Centrifugez la suspension à 14 000 G pendant 15 minutes et récupérez le surnageant. Incuber une fois 10 à la puissance de six cellules entières de mycobacterium tuberculosis inactivées avec 50 microlitres d’extrait de protéine d’une fois 10 à la puissance de six macrophages pendant une nuit à quatre degrés Celsius dans un porte-microtube rotatif.

Le lendemain, pour colorer le complexe protéique-bactérien, ajoutez l’anticorps anti-humain SLAMF1 dans le microtube, vortex le mélange et incubez pendant une nuit pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Après avoir lavé les complexes protéiques bactériens avec FACS, mettez-les en suspension dans le tampon FACS et acquérez l’échantillon sur un cytomètre en flux. À l’aide d’une pince à épiler chirurgicale à bec rond, placez des lamelles rondes de 12 millimètres dans les puits d’une plaque de culture à 24 puits.

Incuber la lamelle avec les antigènes de la rhodamine de Mycobacterium tuberculosis pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajoutez 100 microlitres d’extrait de protéines dilué dans 300 microlitres de PBS et incubez pendant deux heures à température ambiante avec agitation. Enveloppez le couvercle de la plaque de culture avec un film de paraffine.

Ajoutez une goutte de 60 microlitres d’anticorps primaire anti-SLAMF1 préalablement titré sur le couvercle recouvert d’un film de paraffine. Retirez délicatement la lamelle de la plaque à l’aide d’une pince à épiler chirurgicale incurvée à pointe fine et d’aiguilles. Après l’incubation avec une solution d’anticorps primaire et secondaire, retirer l’excès de liquide et monter la lamelle sur une goutte de liquide de montage placée sur une lame de verre.

Placez la lame sous un microscope à fluorescence et observez les cellules à l’aide de filtres appropriés. Des monocytes ont été isolés avec succès à partir de PBMC d’une pureté de 95 % ou plus, et des macrophages dérivés de monocytes ont été générés après l’adhérence et la culture pendant la nuit. L’expression de surface de SLAMF1 a été induite dans les macrophages stimulés par les antigènes de Mycobacterium tuberculosis, et ses niveaux ont été confirmés par cytométrie en flux.

L’interaction entre SLAMF1 et les cellules entières de mycobacterium tuberculosis a été mise en évidence à l’aide d’un test de réticulation suivi d’une cytométrie en flux. L’interaction entre les antigènes SLAMF1 et Mycobacterium tuberculosis a été visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence, la co-localisation étant confirmée par des images fusionnées.