Désorption/ionisation laser assistée par matrice guidée par fluorescence avec spectrométrie de masse de postionisation induite par laser de cellules neurales de rat individuelles

Notre recherche se concentre sur le développement de flux de travail de spectrométrie de masse MALDI unicellulaire à haut débit, guidés par l’image, afin de révéler l’hétérogénéité cellulaire et de relier les profils moléculaires à l’identité, à la fonction et à la réponse cellulaires dans des systèmes complexes.

Des instruments avancés, tels que MALDI-2 et des spectromètres de masse à haute résolution spatiale, permettent une analyse ciblée et spatialement résolue de cellules uniques, améliorant ainsi la sensibilité et élargissant la portée du profilage moléculaire dans les tissus complexes. Les défis actuels comprennent une sensibilité limitée, une reproductibilité entre les échantillons et une analyse complexe des données. Les données MALDI sont souvent rares, et les grands ensembles de données contenant des milliers de cellules et des centaines de molécules nécessitent des outils de calcul robustes.

Ce protocole comble les lacunes des méthodes à haut débit pour l’analyse des cellules individuelles et même des organites, permettant des études très détaillées de l’hétérogénéité et des connaissances sur la biologie et la fonction moléculaires et cellulaires.

Ce protocole permet une analyse ciblée rapide des cellules dispersées sur la lame, éliminant ainsi le besoin de manipulation des cellules ou de balayage sur toute la surface et augmentant considérablement le débit.

[Narrateur] Pour commencer, rincez chaque lame avec deux à trois millilitres d’acétate d’ammonium 150 millimolaires pour éliminer les cristaux de glycérol et de sel qui peuvent interférer avec la microscopie et l’application de la matrice MALDI, puis séchez les lames sous un léger jet d’azote ou laissez-les sécher complètement à l’air. Chargez la lame séchée dans la platine du microscope. Faites la mise au point du microscope à l’aide d’au moins 10 points d’appui répartis uniformément sur l’ensemble de la lame. À l’aide de filtres adaptés à l’imagerie DAPI et à l’imagerie en fond clair, acquérez une image de fluorescence en mosaïque de l’ensemble de la lame à un grossissement de 5x à 10x, en veillant à ce que les marqueurs repères sur les lames de microscopie soient clairement capturés dans l’image. Assemblez les images en mosaïque à l’aide d’un logiciel de microscopie, tel que ZEN ZEISS. Vérifiez que les tuiles adjacentes verticalement ne sont pas décalées. Traitez et exportez chaque image assemblée sous forme de fichier BigTIFF à l’aide du logiciel de microscopie ou en tant que TIFF standard si la taille finale de l’image est inférieure à deux gigaoctets. Dissoudre 20 milligrammes de 2,5-dihydroxyacétophénone dans 1,5 millilitre d’acétone. Placez les lames dans le support de la chambre de sublimation, puis placez le support dans l’appareil de sublimation. Pipetez la solution de matrice dissoute sur la plaquette de céramique et laissez l’acétone s’évaporer complètement, puis fermez la chambre de sublimation pour la sceller. Remplissez la chambre de refroidissement avec une neige fondue d’eau glacée et placez-la solidement sur le dessus de la chambre de sublimation. Allumez la pompe à vide et laissez le système s’équilibrer pendant cinq minutes. Commencez la sublimation en chauffant la chambre à 200 degrés Celsius pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, retirez le bain d’eau glacée de la chambre. Réglez la température à 25 degrés Celsius et placez un dissipateur thermique sur le dessus de la chambre. Ventilez lentement la chambre de sublimation pour relâcher la pression. Ouvrez la chambre et retirez délicatement les lames. Ouvrez MicroMS et décimez les images de microscopie BigTIFF à l’aide de l’option de groupe d’images pour prendre en charge les canaux en fond clair et en fluorescence. Accédez à l’outil Options d’objet blob et ajustez la taille maximale et minimale de l’objet blob pour définir la plage de tailles d’objet blob acceptable. Définissez le seuil du canal de fluorescence pour la détection des blobs. Spécifiez la valeur de circularité pour définir le degré de circulaire des cellules identifiées pour être prises en compte, puis choisissez la couleur. Utilisez l’option Recherche d’objets blob pour détecter les objets blob. Lorsque vous y êtes invité, enregistrez la liste d’objets blob sous le nom de votre choix. Utilisez l’outil Filtre de distance pour définir la distance minimale entre chaque cellule. Testez l’erreur à l’aide de points de test pour déterminer avec précision l’erreur de décalage. Chargez les diapositives dans l’instrument à l’aide de l’adaptateur de glissière MTP II. Après être retourné à l’ordinateur avec MicroMS, accédez à l’ordinateur du spectromètre de masse via une application de bureau à distance. Si vous utilisez l’instrument pour la première fois, vérifiez sa position en accédant à Outils, puis à Paramètres de l’instrument. Dans la fenêtre contextuelle, affichez l’ensemble des coordonnées avec leurs positions X et Y et sélectionnez chacun de ces points spécifiques sur la géométrie de l’adaptateur de diapositive II. Mettez à jour les positions X et Y dans la fenêtre MicroMS. À l’aide de la caméra du spectromètre de masse et des commandes de la platine, naviguez jusqu’à un emplacement facilement identifiable sur la diapositive et copiez les coordonnées de l’instrument. Dans MicroMS, localisez la même position dans l’image du microscope, cliquez avec le bouton droit de la souris et entrez les coordonnées dans la fenêtre contextuelle. Arrondissez les coordonnées aux entiers les plus proches et séparez-les par un espace. Après l’ajout de trois points d’enregistrement, l’un des cercles devient rouge, indiquant qu’il s’agit de la position la plus éloignée de l’enregistrement. Supprimez le point d’enregistrement à l’aide de Ctrl + clic droit et réessayez. Sous Fichier, accédez à Enregistrer, puis à Enregistrement pour enregistrer le fichier d’enregistrement. Avec les taches visibles sur la diapositive, allez dans Fichier, Enregistrer, puis Positions de l’instrument pour enregistrer le fichier de position de l’instrument, puis à l’aide d’un logiciel de bureau à distance, transférez ce fichier sur l’ordinateur de l’instrument. Ouvrez le fichier XEO personnalisé et copiez son contenu dans l’adaptateur de diapositive MTP II . XEO sur l’ordinateur de l’instrument. Enregistrez le fichier pour mettre à jour ce fichier de géométrie avec les emplacements des cellules. Cliquez sur l’onglet Automatisation et sélectionnez Nouveau pour créer une nouvelle exécution automatique. Faites glisser le pointeur sur la région d’échantillonnage affichée pour sélectionner les cellules et cliquez avec le bouton droit de la souris pour les ajouter à la liste d’analyse. Enregistrez l’exécution automatique et cliquez sur Démarrer l’exécution automatique pour commencer l’acquisition. Cette figure illustre comment le profilage par spectrométrie de masse MALDI-2 révèle une hétérogénéité cellulaire basée sur les lipides à travers et au sein de régions cérébrales distinctes. L’approximation et la projection uniformes de la variété, ou analyse UMAP, séparent les cellules par région du cerveau, formant des grappes distinctes pour le striatum, l’hippocampe et le cortex. Le regroupement de Leiden a révélé quatre sous-populations cellulaires à base de lipides. De plus, des signatures lipidiques spécifiques aux grappes ont été observées, avec des profils d’intensité distincts entre les lipides annotés. Les spectres de masse de six cellules corticales ont également montré une détection cohérente des lipides sur les lames. De plus, les cellules corticales de différentes lames ont montré des distributions UMAP chevauchantes, indiquant des effets de lot minimes.