Name: Visualisation et analyse quantitative de l’activation de PARP1/PARP2 induite par la génotoxine dans les cellules à l’aide d’un rapporteur à base de protéines de fusion fluorescentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:48:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie cellulaire pour quantifier l'activation de PARP1/PARP2 et l'accumulation de PAR en réponse aux dommages à l'ADN dans les cellules mammifères. Cette approche utilise un rapporteur EGFP fusionné au domaine PBD de RNF146.

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<table><tbody><tr><td>Réactifs, produits chimiques et peptides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtres Durapore steriflip de 0,45 µm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de couverture pour microscope de 20 x 20 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 22-170-371</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Plats de culture cellulaire, 100 mm</td><td>VWR</td><td>Cat# 25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Plats de culture cellulaire, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 430166</td><td></td></tr><tr><td>Plats de culture cellulaire à 6 puits</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-161</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials de 2 mL</td><td>VWR</td><td>Cat# 89499-722</td><td></td></tr><tr><td>Diéthyl éther</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 60-29-7</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtres stériles jetables de 0,45 µm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, 200 preuve</td><td>Decon Labs</td><td>Cat# 2701</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de microscope en verre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur</td><td>Atlanta Biologics</td><td>Cat# S11150</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10687010</td><td></td></tr><tr><td>Grands essuie-tout Kim</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Cat# 34256</td><td></td></tr><tr><td>Kit Lenti-X GoStix Plus</td><td>Takara</td><td>Cat# 631280</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MNNG</td><td>Molport</td><td>Cat# N493990</td><td></td></tr><tr><td>NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihydroxy-5-(hydroxyméthyl) tétrahydrofurane-2-yl]-4H-pyridine-3-carboxamide)</td><td>Marie Migaud ou  NuChem Sciences Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur PARG (PDD00017273)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SML1781</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur PARPi (Veliparib, ABT-888)</td><td>MedChemExpress&nbsp;</td><td>Cat# HY-10129</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polybrène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>tBuOOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 180345000</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-x2 (réactif de transfection)</td><td>Mirus</td><td>Cat# MIR-6006</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>VWR</td><td>Cat# 0694</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (H-1000) anti-fade medium de montage</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NC1695563</td><td></td></tr><tr><td>Lignes cellulaires&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>293-FT&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>(dérivé de cellules rénales embryonnaires humaines transformées par l'antigène T grand SV40)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>LN428&nbsp;</td><td>Don généreux de</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(Ligne cellulaire de glioblastome humain)</td><td>Dr. Ian Pollack (Université de Pittsburgh)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>(cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines hTERT-immortalisées)</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>U2OS&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>(Ligne cellulaire d'ostéosarcome humain)</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>ADN recombinant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Stock de laboratoire# 253</td><td>Addgene, Cat# 12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Stock de laboratoire# 254</td><td>Addgene, Cat# 12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Stock de laboratoire# 252</td><td>Addgene, Cat# 12259</td><td></td></tr><tr><td>pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR est le domaine WWE de RNF146, résidus d'acides aminés 100-182, fusionné à EGFP; contient un cassette de résistance à l'hygromycine)</td><td>Stock de laboratoire# 1727</td><td>Addgene, Cat# 176063&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Logiciels et algorithmes&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (pour la préparation des figures)</td><td>Adobe Systems</td><td>Version 2024</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Version 10.5.0&nbsp;(Mac OS X)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation et analyse quantitative de l’activation de parp1/parp2 induite par la génotoxine dans les cellules à l’aide d’un rapporteur à base de protéines de fusion fluorescentes

Visualization and Quantitative Analysis of Genotoxin-Induced PARP1/PARP2 Activation in Cells Using a Fluorescent Fusion Protein-Based Reporter

Visualisation et analyse quantitative de l’activation de PARP1/PARP2 induite par la génotoxine dans les cellules à l’aide d’un rapporteur à base de protéines de fusion fluorescentes

Poly(ADP-ribose) (PAR) is a polymer of ADP-ribose synthesized by four members of the ADP-ribose polymerase family of enzymes&#8212;PARP1, PARP2, PARP5a, ...

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Procédé pour surveiller l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes est décrit. Un degron-GFP déstabilisée-(GFP-dgn) et une protéine de fusion GFP-stable dgnFS sont générés et transduites dans la cellule en utilisant un vecteur d'expression lentiviral. Cette technique permet de générer une lignée stable de cellules exprimant GFP-dgn/GFP-dgnFS dans lequel l'activité ubiquitine-protéasome peut être facilement évaluée en utilisant épifluorescence ou la cytométrie en flux.

Suivi de l&#39;activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d&#39;un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

L'activité cytotoxique de l'phénanthridiniques PJ-34 dans les cellules cancéreuses en mitose a été documentée en temps réel par imagerie confocale en direct. 34-PJ cancer du sein humain éradiqué MDA-MB-231 cellules hébergeant des extra-centrosomes dans la mitose. Contrairement à la mitose bifocal normale, les extra-centrosomes sont regroupés dans les deux pôles du fuseau, en présence d'PJ-34.

La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Ce protocole décrit la caspase bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC) ; une méthode axée sur l’imagerie qui permet de visualiser la proximité induite par des caspases initiateur, qui est la première étape de leur activation.

Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

Nous décrivons ici un test haut débit fluorescence qui mesure la membrane plasmique rescellage d’efficacité grâce à des analyses fluorimétrique et imageries de cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des drogues ou des gènes de cible qui régulent la membrane plasmique réapposition de sceau sur des cellules mammaliennes.

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

Cet article décrit les protocoles afin d’évaluer l’effet des protéines fluorescentes sur l’agrégation et la toxicité de l’expansion de polyglutamine mal repliées pour l’évaluation rapide d’une protéine fluorescente nouvellement indéterminée dans le contexte de reporters fluorescents.

Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Le présent protocole met en évidence une méthode modifiée pour détecter et quantifier les réticulations ADN-protéines (DPC) et leurs modifications post-traductionnelles (PTM), y compris l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation induites par les inhibiteurs de la topoisomérase et par le formaldéhyde, permettant ainsi l’étude de la formation et de la réparation des DPC et de leurs PTM.

Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

Dans cette étude, nous présentons un test cellulaire in vitro pour identifier les produits chimiques tératogènes. La dynamique de la signalisation du facteur de croissance des fibroblastes (FGF)/facteur de réponse sérique (SRF) a été mesurée dans les cellules rapporteures de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS), et le risque de tératogénicité a été évalué en quantifiant la perturbation chimique de cette voie de signalisation.<br...

Essai de toxicité pour le développement basé sur la surveillance en temps réel de la perturbation du signal du facteur de croissance des fibroblastes dans les cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Découvrez une méthode d'imagerie cellulaire pour quantifier l'activation de PARP1/PARP2 et l'accumulation de PAR en réponse aux dommages à l'ADN dans les cellules mammifères. Cette approche utilise un rapporteur EGFP fusionné au domaine PBD de RNF146.

Visualisation et analyse quantitative de l’activation de PARP1/PARP2 induite par la génotoxine dans les cellules à l’aide d’un rapporteur à base de protéines de fusion fluorescentes (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation et analyse quantitative de l’activation de PARP1/PARP2 induite par la génotoxine dans les cellules à l’aide d’un rapporteur à base de protéines de fusion fluorescentes

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