Visualisation et analyse quantitative de l’activation de PARP1/PARP2 induite par la génotoxine dans les cellules à l’aide d’un rapporteur à base de protéines de fusion fluorescentes

Notre laboratoire étudie les voies de réparation de l’ADN dépendantes de PARP1 et PARP2 ainsi que les voies de réponse aux dommages à l’ADN dans des cellules normales et transformées. Un défi dans ce domaine est l’analyse quantitative de l’activation de PARP1 et PARP2 dans les cellules tout en évitant la lyse cellulaire. Cela permet des études de localisation subcellulaire.

Pour commencer, ajoutez 375 microlitres de sérum bovin fœtal et de DMEM sans pénicilline-streptycine dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’un réactif de transfection à base de lipides et tous les plasmides nécessaires dans le tube. Tapotez doucement le tube de microcentrifugation pour mélanger le milieu, le réactif de transfection et l’ADN plasmidique.

Incubez à température ambiante pendant 15 à 30 minutes pour permettre la formation d’ADN et de réactifs de transfection. Ensuite, ajoutez le plasmide et le mélange de réactif de transfection goutte à goutte sur la plaque de 60 millimètres contenant les cellules cultivées de 293 FT sans retirer le milieu, puis remettez les cellules dans l’incubateur pendant 48 heures. Ensuite, il faut prélever le milieu de culture des cellules transfectées de 293 FT.

Pour isoler les particules de lentivirus, filtrez le milieu collecté à travers un filtre stérile de 0,45 micromètre afin de séparer les débris cellulaires des particules lentivirales. Pour la transduction, faites cultiver les cellules souhaitées pendant 24 heures et vérifiez que la confluence cellulaire se situe entre 20 % et 40 %. Ensuite, ajoutez un millilitre de virus, un millilitre de milieu de croissance et deux microlitres de Polybrene dans un tube conique de 15 millilitres, mélangés doucement par inversion. Maintenant, retirez le milieu de croissance de la plaque à six puits.

Ajoutez le mélange de virus, de médium et de polybrene dans chaque puits. Placez les cellules avec le mélange de transduction dans un incubateur contenant une atmosphère humidifiée à 32 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 16 à 18 heures. Pour valider l’expression des acides aminés RNF146, de 100 à 182 EGFP, graine 200 000 cellules exprimant LivePAR par plat de culture contenant des bandes de couverture.

Laissez les cellules adhérer 24 à 36 heures aux couches de couverture, conditionnez le milieu et commencez à se répliquer. Ensuite, exposez les cellules exprimant LivePAR aux réactifs donnés. Ajoutez les composés directement au milieu contenant les cellules sur les glissants et faites doucement tourner le milieu dans les plats de culture cellulaire pour répartir les composés.

Faites couver les plats de 60 millimètres à 37 degrés Celsius pendant 60 à 90 minutes. Pour fixer les cellules, retirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS. Préfixez les cellules à 4 % de formaldéhyde dans le PBS pendant 15 minutes à température ambiante.

Après avoir retiré le formaldéhyde, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez trois millilitres de méthanol froid et d’acétone aux cellules dans un ratio de 7:3 pour les fixer. Placez les plats à moins 20 degrés Celsius pendant neuf minutes.

Ensuite, retirez la solution de méthanol acétone. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS, pipettez 15 microlitres de médium antifade contenant du DAPI sur une lame en verre. Montez doucement le couvercle sur le support de montage avec les cellules tournées vers l’intérieur, tout en minimisant les bulles.

Centrez et fixez le couvercle, passez la glisse sur la glissière en verre et scellez les côtés en appliquant une petite quantité d’émail transparent pour clous sur les bords. Placez les lames dans l’obscurité pour laisser sécher l’émail des ongles. Après avoir téléchargé et installé Image J, ouvrez Image J et installez le fichier texte macro LivePAR_Macro en cliquant sur Plugins, en sélectionnant Macros et en choisissant Installer.

Ouvrez tous les fichiers confocaux dans l’image J et enregistrez les fichiers en fichiers TIFF pour préserver les fichiers originaux. Ensuite, ouvrez un tableau Excel et enregistrez-le comme Date_CellLineFociAnalysis. Analysez un fichier TIFF à la fois.

Appuyez sur 1 pour trouver les noyaux. Lorsque la fenêtre du gestionnaire de ROI s’ouvre, sélectionnez toutes les entrées et appuyez sur ajouter pour superposer la zone des noyaux sur l’image originale. Supprimez les noyaux mal identifiés et excluez ceux qui ne sont pas entièrement dans le référentiel.

Ensuite, dessinez le noyau à l’aide de l’outil de sélection à main levée et appuyez sur 2 pour quantifier les foyers PAR. Sélectionnez chaque noyau dans le gestionnaire de ROI et comptez le nombre de foyers par noyau. Copiez-collez les données quantifiées dans le document du tableau ouvert après avoir noté tous les noyaux dans le fichier.

De même, répétez l’analyse pour tous les fichiers TIFF. Une fois terminé, tracez les foyers PAR par noyau dans le logiciel de votre choix. Les cellules de contrôle du véhicule ont montré une coloration pancellulaire à l’EGFP.

Les cellules traitées à la génotoxine ont montré une accumulation de foyers nucléaires représentant la localisation dans le noyau. Le prétraitement avec les inhibiteurs de PARP1 et PARP2 veliparib a entraîné la perte des foyers de PAR. La quantification du nombre de foyers de PAR par noyau en fonction du temps et des conditions de traitement a montré des résultats similaires.

Ce protocole nous permet de quantifier l’activation des axes de signalisation PARP1 et PARP2 en réponse aux génotoxines et à la suite de modifications génétiques. Nous avons utilisé des techniques traditionnelles d’immunofluorescence avec ce test pour valider la colocalisation des protéines avec du polyADP-ribose. À l’avenir, nous utilisons ce test pour les tests de génotoxicité pour l’analyse à haut débit des inhibiteurs de PARP1, PARP2 ou PARP, ainsi que pour identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la signalisation de PARP1 et PARP2.