הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

היי, שמי בראד המילטון. אני במחלקת המחקר והפיתוח כאן ב-STEM Gen. היום נראה לכם נוהל כיצד ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מפיברובלסטים עובריים של עכברים.

ניתן להשתמש בהליך זה הן ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים והן לחקר תהליך התכנות מחדש. אז בואו נתחיל. התחל בזריעת פיברובלסטים עובריים של עכברים, או תאי מת' על צלחת מצופה ג'לטין בגודל 15 סנטימטר בצפיפות של ארבע פעמים 10 מהתאים החמישיים למנה.

כעת הוסיפו 30 מיליליטר של מצע גידול מת' ודגרו על התאים במשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד שהם מגיעים ל-80% בערך. בסיום, הדגירה שואבת את המדיום ומוסיפה 30 מיליליטר צמיחה. בינוני בתוספת לנטי-וירוס מרוכז.

נדנד את המנה בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד של המדיום. דגרו על התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם התמרה ויראלית הושלמה. בואו נעבור לתכנות מחדש המושרה על ידי דוקסיציקלין.

כדי להתחיל לתכנת מחדש 20 עד 24 שעות לאחר התמרת טריפסין הוא התאים המומרים ולצנטריפוגה אותם ב-200 Gs למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיה מכדור התא והשעו מחדש את התאים במדיום הגידול. לאחר השעיית הזרע, ה-mes המועבר בריכוז מתאים לגודל צלחת תרבית התאים שבה אתה משתמש.

כאן אנו משתמשים ב-2.5 כפול 10 לתאים החמישיים לכל צלחת של 10 סנטימטר לתכנות מחדש של ניסויי יעילות ובידוד מושבת IPS ופעמיים 10 לתאים הרביעיים לבאר בארבע צלחות באר לניסויים אימונוכימיים. כדי לפקח על יעילות ההתמרה, דגרו את התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. בשלב זה ניתן להקפיא את התאים בחנקן נוזלי לניתוח עתידי במידת הצורך.

למחרת, שאפו את המדיום והחליפו אותו במצע גידול טרי שנוסף לו דוקסיציקלין לריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר. אנו כוללים בקרה שלילית המכילה מדיום ללא דוקסיציקלין. לבסוף דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

התחלנו בתהליך התכנות מחדש. באופן כללי. מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות יהיו גדולות מספיק לבידוד לאחר 16 עד 22 יום.

לפני שנדגים את ההליך הזה, עלינו לאמת תחילה את יעילות ההתמרה באמצעות כימיה כדי לקבוע את יעילות ההתמרה. בדיקות אימונוכימיה מתבצעות על התאים המצופים מחדש בארבע צלחות באר 48 שעות לאחר השראת דוקסיציקלין. יש להתאים את כל הנפחים המפורטים בפרוטוקול זה בהתאם לגודל לוחית תרבית התאים להתחיל בשטיפת התאים בעדינות.

לאחר ש-PBS אינו מכיל יוני מגנזיום או סידן, תקן את התאים עם 500 מיקרוליטר של 4% אלדהיד פרפורמי ב-PBS למשך 15 דקות. בטמפרטורת החדר יש לשטוף את התאים שוב בעדינות פעמיים עם PBS. לאחר מכן, חלחל לתאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר קר כקרח 0.2%Tween 20 בדגירה PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפת התאים פעמיים נוספות. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לחסום קשירת נוגדנים לא ספציפיים. כעת הוסף 200 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני הרצוי.

כאן אנו משתמשים בסמני הפלוריפוטנטיות T 4K LF ארבע, SOX שניים ו-cmic. דגרו על התאים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת. לאחר שטיפת התאים בעדינות פעמיים עם PBS, דגרו אותם עם 200 מיקרוליטר נוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר, והגנו על הצלחות מפני אור.

כאן אנו משתמשים בנוגדנים המשניים המתאימים המצומדים עם ארבע פלואורו להדמיה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לאחר הדגירה. שטפו את התאים פעמיים נוספות ואז הוסיפו DPI ודגרו שוב למשך 10 דקות כדי לדמיין גרעינים. לבסוף, לאחר שטיפה אחרונה, הוסף תושבת אנטיפה אקווה לפני הדמיית התאים במיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך כדי לקבוע את יעילות ההתמרה.

התחל בידוד והרחבה של תאי גזע פלוריפוטנטיים. לאחר התחלת תהליך התכנות מחדש, עקוב אחר התרביות מדי יום והחלף את המדיום המתאים כל 48 שעות. אנו משתמשים במדיום בתוספת דוקסיציקלין כדי לתרבית התאים במשך 12 הימים הראשונים ולאחר מכן מסירים את הדוקסיציקלין מהמדיום לזה.

תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים או מושבות ה-IPS שנבחרו ידנית להרחבה הם דוקסיציקלין. יש לעקוב אחר תאים עצמאיים מדי יום לאיתור שינויים מורפולוגיים המעידים על תהליך התכנות מחדש. כל ניסוי יהיה שונה, אך מושבות בדרך כלל גדולות מספיק לבידוד בין 16 ל-22 יום לאחר השראת DS יום לפני תחילת תהליך הבידוד ותכנות מחדש של מושבות טריפסין.

הכן צלחת של 24 בארות על ידי זריעה עם שכבת הזנה מוקרנת גמא של מט בצפיפות של חמישה פעמים 10 לתאים הרביעיים לבאר. דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, בחר ידנית כל מושבת IPS ומנסה להחזיר אותה כדי לנתק את אגרגטי התאים, לדחות את תאי ה-IPS במדיום תאי גזע עובריים של עכבר בבארות הבודדות של צלחת 24 הבארות הקודמות, לדגור על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

החלפת מדיה כל 24 שעות. עקוב אחר מושבות ה- IPS מדי יום לצמיחה ופלואורסצנטיות GFP. דגרנו את התרביות שלנו במשך שישה ימים לפני האריזה לארבע צלחות באר לניתוח פלוריפוטנטיות.

קבע אילו בארות של לוחית 24 הגלגלים מבטאות באופן אחיד בארות GFP בעלות ביטוי GFP טוב יכולות להיות משולשות, מורכבות ולהעביר אחת עד שמונה לארבע לוחות באר שקדמו להם שכבות הזנה מוקרנות גמא של mes. לאחר מכן ניתן להשתמש בלוחות אלה לניתוח ICC עבור פלוריפוטנטיות כדי להתחיל בניתוח פלוריפוטנטיות. שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם PBS שאינו מכיל יוני מגנזיום או סידן.

הוסף 0.5 מיליליטר לבאר קר קרח 0.2% בין 20 ב-PBS ודגר על התאים למשך 10 דקות. לאחר שלוש כביסות נוספות בבלוק PBS, כריכה לא ספציפית עם 200 מיקרוליטר של חיץ חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר. כעת הוסף 200 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני הרצוי.

כאן השתמשנו ב-SSEA ננוגרם אחד ו-OCT 4 דגרו על התאים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת התאים בעדינות פעמיים, דגרו אותם עם 200 מיקרוליטר של נוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר, והרחיקו אותם מאור. כאן אנו משתמשים בנוגדנים המשניים המתאימים המצומדים בכוח פלואורו להדמיה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לאחר שתי שטיפות נוספות, מוסיפים DPI ודוגרים על התאים למשך 10 דקות.

כעת לאחר שטיפה אחרונה, הוסף תושבת אנטיפה אקווה לפני הדמיית התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. ניתן לנתח מושבות IPS גם לפעילות פוספטאז אלקליין באמצעות ערכות זמינות מסחרית. ניתן להשתמש בסט ה-tft lentivirus המעורר של עכבר כדי לתכנת מחדש MES לתאי IPS לאחר התמרה של ביטוי MES של גורמי שעתוק.

ניתן לזהות T 4, SOX 2, KLF 4 ו-seic בתאים שטופלו בדוקסיציקלין, אך ניתן לזהות ביטוי מועט או בכלל לא ניתן לזהות בתאים לא מטופלים. שינויים מורפולוגיים יתקדמו עם הזמן כדי ליצור מושבות גדולות יותר דמויות תאי ES עם קצוות מושבה מוגדרים וצמיחה תלת מימדית. כאשר מסירים את הרופאים, יש נסיגה ניכרת במורפולוגיה התאית עבור כמה מושבות דמויות תאי ES.

עם זאת, רבות מהמושבות שמרו על מורפולוגיה של IPS. מושבות IPS אלה כאשר הן נבחרות ועוברים מוצגות. ביטוי סמן פלוריפוטנטיות אופייני של פוספטאז אלקליין, ננו T ארבע ו-SSEA אחד.

סוג תאי המת' ששימשו בניסוי זה ביטא GFP ממקום הנאג האנדוגני. כאשר מתוכנת מחדש למצב פלוריפוטנטיות, ביטוי GFP יכול לשמש כאינדיקטור ראשוני לתכנות מחדש מוצלח. זה עתה הראינו לכם כיצד לגרום לתכנות מחדש של פיברובלסטים עובריים של עכברים כדי לגרום לתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות מערכת אנטי-ויראלית המושרה על ידי ארבעה גורמי שעתוק דוקסיציקלין.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שבעת תכנון ניסויי תכנות מחדש, יש לקחת בחשבון מספר משתנים כדי לייעל את היעילות של תכנות מחדש. ראשית, ניתן לשנות את יחס הנגיף הפעיל לתאי המטרה במהלך שלב ההדבקה הראשוני כדי להגדיל או להקטין את יעילות ההתמרה, ובכך להשפיע על מספר הנגיפים המשולבים באוכלוסיית תאי היעד. שנית, התאמת משך הזמן שבו התאים נחשפים לרופאים יכולה להשפיע על מספר מושבות ה-IPS שנוצרות.

שלישית, יכולת ההתפשטות של תאי המטרה יכולה להשפיע על תכנות מחדש מכיוון שהתאים, שגדלים ומתחלקים באופן פעיל, מוכנים יותר לתכנות מחדש. לבסוף, בעת שינוי הפרוטוקול עבור מספרי תאים שונים או צלחות תרבית רקמות בגדלים שונים, מומלץ להתאים את מספרי תאי המטרה באופן פרופורציונלי לשטח הפנים של צלחת התרבית. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.