הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

שלום, שמי בראד המילטון. אני במחלקת המחקר והפיתוח כאן ב-STEM Gen. היום נראה לכם פרוצדורה ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים מפיברובלסטים עובריים של עכבר.

ניתן להשתמש בפרוצדורה זו הן ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים והן לחקר תהליך התכנות מחדש. אם כן, בואו נתחיל. התחילו בזריעת פיברובלסטים עובריים של עכבר, או תאי MEF, בתוך צלחת עם ציפוי ג'לטין בקוטר 15 סנטימטרים, בצפיפות של 4 × 10⁵ תאים לצלחת.

כעת הוסיפו 30 milliliters של מצע גידול meth והדגירו את התאים למשך יומיים ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide עד שיגיעו לכ-80% confluency. עם סיום ההדגרה, שאבו את המצע והוסיפו 30 milliliters של מצע גידול המועשר ב-lentivirus רכז.

נערו את הצלחת בעדינות כדי להבטיח התפזרות אחידה של המצע. דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide עד להשלמת הטרנסדוקציה הויראלית. נעבור כעת לתכנות מחדש המושרה על ידי doxycycline.

כדי להתחיל בתהליך התכנות מחדש, 20 עד 24 שעות לאחר התהליך (Post transduction), יש לטפל בתאים שעברו טרנסדוקציה בטריפסין ולסבב אותם בצנטריפוגה במהירות של 200 Gs למשך חמש דקותיות. לאחר מכן, יש לשאוב בזהירות את המדיום מעל משקע התאים ולסבב מחדש את התאים במדיום גידול. לאחר השהייה, יש לזרוע את התאים שעברו טרנסדוקציה בריכוז המתאים לגודל צלחת תרבית התאים שבה נעשה שימוש.

כאן אנו משתמשים ב-2.5 × 10⁵ תאים לכל צלחת של 10 ס"מ עבור ניסויי יעילות תכנות מחדש ובידוד מושבות IPS, וב-2 × 10⁴ תאים לבאר בפלטות של 4 בארות עבור ניסויי אימונוכימיה. כדי לנטר את יעילות הטרנסדוקציה, דגרו את התאים למשך לילה ב-37 °C ו-5% CO2. בשלב זה, ניתן להקפיא את התאים בחנקן נוזלי לצורך אנליזה עתידית במידת הצורך.

ביום למחרת, שאבו את המצע והחליפו אותו במצע גידול טרי המועשר ב-doxycycline בריכוז סופי של 2 µg/mL. אנו כוללים ביקורת שלילית המכילה מצע ללא doxycycline. לבסוף, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2.

התחלנו בתהליך התכנות מחדש. באופן כללי, מושבות של תאי גזע פלוריפוטנטיים יהיו גדולות מספיק לצורך בידוד לאחר 16 עד 22 ימים.

לפני שנדגים את הפרוצדורה, עלינו לאמת תחילה את יעילות הטרנסדוקציה באמצעות כימיה כדי לקבוע את יעילות הטרנסדוקציה. בדיקת אימונוכימיה מבוצעת על התאים שנזרעו מחדש בלוחות בעלי ארבעה בארות 48 שעות לאחר השראה של doxycycline. יש להתאים את כל הנפחים המפורטים בפרוטוקול זה לגודל לוח תרבית התאים; התחילו בשטיפה עדינה של התאים.

לאחר שטיפה ב-PBS שאינו מכיל יוני מגנזיום או סידן, קבעו את התאים באמצעות 500 microliters של 4%paraform aldehyde ב-PBS למשך 15 דקות. בטמפרטורת החדר, שטפו שוב את התאים בעדינות פעמיים עם PBS. לאחר מכן, בצעו פרמיאביליזציה לתאים על ידי הוספת 500 microliters של 0.2%Tween 20 ב-PBS קר (מקרר), והדגיתו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפת התאים פעמיים נוספות, הוסף 200 µL של תמיסת חסום למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי למנוע קישור לא ספציפי של הנוגדנים. כעת הוסף 200 µL של הנוגדן הראשוני הרצוי.

כאן אנו משתמשים במסמני פלוריפוטנציה T 4K LF four, SOX two ו-cmic. דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, לאחר שטיפה עדינה של התאים פעמיים עם PBS, דגרו אותם עם 200 µL של נוגדן משני למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, תוך הגנה על הפלטות מאור.

כאן אנו משתמשים בנוגדנים משניים מתאימים המצומדים לפלואורופורים לצורך ויזואליזציה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לאחר הדגירה. שטפו את התאים פעמיים נוספות ולאחר מכן הוסיפו DPI והדגירו שוב למשך 10 דקות כדי להדגים את הגרעינים. לבסוף, לאחר שטיפה אחרונה, הוסיפו antifa aqua mount לפני דימוי התאים במיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך כדי לקבוע את יעילות ההעברה.

התחילו בבידוד והרחבה של תאי גזע פלוריפוטנטיים. לאחר הפעלת תהליך התכנות מחדש, עקבו אחר התרביות מדי יום והחליפו את המצע המתאים בכל 48 שעות. אנו משתמשים במצע מועשר ב-doxycycline לתרבית התאים ב-12 הימים הראשונים, ולאחר מכן מסירים את ה-doxycycline מהמצע.

את מושבות התאיים הפלוריפוטנטיים המושרים (IPS) שנבחרים ידנית להתרחבות מעבירים לטיפול ב-doxycycline. יש לנטר תאים בודדים מדי יום כדי לזהות שינויים מורפולוגיים המעידים על תהליך התכנות מחדש. כל ניסוי יהיה שונה, אך בדרך כלל המושבות גדולות מספיק לבידוד בין 16 ל-22 ימים לאחר השראת ה-DS, ביום שלפני תחילת תהליך הבידוד וה-trypsin של המושבות שעברו תכנות מחדש.

הכינו פלטה של 24 בארות על ידי זריעה של שכבת תאי מאכיל (feeder layer) של METs שהוקרנו בגמא, בצפיפות של 5×10⁴ תאים לבאר. הדגירו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. למחרת, בחרו ידנית כל מושבת IPS ובצעו לה trypsanization כדי לפרק את צבירי התאים. זרעו את תאי ה-IPS במצע גידול של תאי גזע עובריים של עכבר בבארות הבודדות של פלטת 24 הבארות שהוכנה קודם לכן. הדגירו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.

החלפת המצע בכל 24 שעות. יש לנטר את מושבות ה-IPS מדי יום כדי לבחון צמיחה ופלואורסצנציית GFP. דגמנו את התרביות שלנו במשך שישה ימים לפני העברתן לפלטות בעלות ארבעה בארות לצורך אנליזה של פלוריפוטנציות.

קבעו אילו בארות בלוחית ה-24 המעגלית מביעות GFP באופן אחיד. בארות עם ביטוי GFP טוב ניתן לטריפס, להעביר למבחנות ולבצע מעבר של אחת לשמונה ללוחיות בעלות ארבע בארות, שהוכנו מראש עם שכבות מאכיל של mes שהקרנו בקוביות גמא. ניתן להשתמש בלוחיות אלו לניתוח ICC לבדיקת פלוריפוטנציות כדי להתחיל בניתוח הפלוריפוטנציות. שטפו בעדינות את התאים פעמיים ב-PBS שאינו מכיל יוני מגנזיום או סידן.

הוסיפו 0.5 milliliters לכל באר של 0.2%between 20 ב-PBS קר מאוד והדגירו את התאים למשך 10 דקות. לאחר שלושה שטיפות נוספות ב-PBS, חסמו קשירה לא ספציפית באמצעות 200 microliters של תמיסת חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. כעת הוסיפו 200 microliters של הנוגדן הראשוני הרצוי.

כאן השתמשנו ב-SSEA1, Nanog ו-OCT4; דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר שטיפה עדינה של התאים פעמיים, דגרו אותם עם 200 µL של נוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר, תוך שמירה על הגנה מאור. כאן אנו משתמשים בנוגדנים משניים מתאימים המשוררים עם fluoro force לצורך ויזואליזציה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך. לאחר שתי שטיפות נוספות, הוסיפו DPI ודגרו את התאים למשך 10 דקות.

כעת, לאחר שטיפה סופית, יש להוסיף antifa aqua mount לפני הדמיית התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. ניתן גם לנתח מושבות IPS לבדיקת פעילות של alkaline phosphatase באמצעות ערכות זמינות מסחרית. ניתן להשתמש בערכת stem gent docs inducible mouse TF lentivirus כדי לתכנת מחדש MES לתאי IPS לאחר טרנסדוקציה של MES לביטוי של transcription factors.

ניתן לזהות T four, SOX two, KLF four ו-seic בתאים שטופלו ב-doxycycline, אך ניתן לזהות ביטוי מועט או לא קיים בתאים שלא טופלו. שינויים מורפולוגיים יתקדמו עם הזמן כדי ליצור מושבות גדולות יותר הדומות לתאי ES, בעלות קצוות מושבה מוגדרים וצמיחה תלת-ממדית. כאשר מסירים את docs, חזרה מורגשת של המורפולוגיה התאית עבור חלק מהמושבות הדומות לתאי ES.

עם זאת, רבות מהמושבות שמרו על מורפולוגיית ה-IPS שלהן. מושבות IPS אלו, כאשר הן נבחרות ומועברות, מראות ביטוי טיפוסי של סמני פלוריפוטנציה של alkaline phosphatase, nano T four ו-SSEA one.

סוג תאי ה-meth ששימשו בניסוי זה ביטאו GFP מהלוקוס האנדוגני nag. לכן, כאשר התאים עוברים תכנות מחדש למצב של פלוריפוטנציות, ניתן להשתמש בביטוי GFP כאינדיקטור ראשוני לתכנות מחדש מוצלח. הרגע הדגמנו בפניכם כיצד להשרות תכנות מחדש של פיברובלסטים עובריים של עכבר לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, באמצעות מערכת אנטי-ויראלית הניתנת להשראה על ידי doxycycline הכוללת ארבעה גורמי שעתוק.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי בתכנון ניסויי תכנות מחדש, יש לשקול מספר משתנים כדי למטב את יעילות התכנות מחדש. ראשית, ניתן לשנות את היחס בין הווירוס הפעיל לתאי המטרה במהלך שלב ההדבקה הראשוני כדי להעלות או להוריד את יעילות הטרנסדוקציה, ובכך להשפיע על מספר הווירוסים המשולבים באוכלוסיית תאי המטרה. שנית, התאמה של משך הזמן שבו התאים חשופים ל-docs עשויה להשפיע על מספר מושבות ה-IPS שנוצרו.

שלישית, יכולת השגשוג של תאי המטרה עשויה להשפיע על התכנות מחדש, שכן תאים הגדלים ומתחלקים באופן פעיל הם פתוחים יותר לתכנות מחדש. לבסוף, בעת התאמת הפרוטוקול למספרים שונים של תאים או לצלחים שונים של תרבית רקמה, מומלץ להתאים את מספר תאי המטרה באופן פרופורציונלי לשטח הפנים של צלח התרבית. וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.