Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית

על מנת לבצע שחזורים של איברים מתפתחים בתוך Drosophila melanogaster, עלינו לקבוע את המודל הקדמי המתאר בצורה הטובה ביותר את התפשטות האור בתוך הגולם עצמו. ההליך מתחיל בבחירת גולם לבן והדבקתו בקצה צינור נימי כך שהציר האחורי הקדמי של הפופה מכוון במקביל לצינור. צינור נימי קטן ממולא בצבע פלואורסצנטי ומוחדר למארז האישון.

לאחר התאמת ציר זהירה, הגולם מסובב 360 מעלות. תמונות נרכשות בזוויות שונות. נתוני תאורת הטרנס הפלואורסצנטית הנרכשים משמשים לקביעת המודל הקדמי שישמש להדמיית התפתחות איברים.

היי, שמי קלאודיה ואני במרכז לביולוגיה מסייעת בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד. אני אולה פטו ממעבדת פרמאונט בבית הספר לרפואה של הרווארד, ואני דניאל רוז'נסקי מהמכון להדמיה ביולוגית ורפואית באוניברסיטה הטכנית של מינכן ומרכז הלימן במינכן. היום נראה לכם הליך לשחזור תלת מימדי של כל הגוף באופ מלאנו קסטה.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו להדמיה in vivo של התפתחות האיברים במהלך מצב האישון. אז בואו נתחיל לפני שמתחילים. שים לב שאין סרטון נלווה שצריך לצפות בו לפני זה, שבו כמה היבטים טכניים של טומוגרפיה של הקרנה אופטית מוסברים בפירוט רב יותר ממה שהם כאן.

בנוסף, הסרטון השני מסביר הדמיה של רקמות או איברים מוכנים של בעלי חיים גדולים יותר. עבור כל הניסויים המכוסים בסרטון זה, ייעשה שימוש בטרנסגנים של דרוזופילה. הם EL A gal four המתבטא בבלוטות הרוק, apteris gal four, המתבטא ברקמות מבשר הזחל של הכנף הבוגרת ובית החזה, הטרנסגן המייצר חלבון פלואורסצנטי.

בתגובה לגל ארבע הנקרא U-A-S-G-F-P ו-1118 לבן, זכרי הביקורת שאינם פלואורסצנטיים הנושאים את הטרנסגנים של הכטב"מים מוצלבים לנקבות בתולות הנושאות את ארבעת הטרנסגנים של GAL כדי להשיג רקמה. ביטוי ספציפי של צלבי GFP מוגדרים משמונה עד 10 נקבות וזכרים בתולים על מצע זבוב סטנדרטי עם זילוף שמרי אופה. על פני השטח, הבקבוקונים מאוחסנים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס באינקובטור לח תחת מחזור חושך בהיר של 12 שעות.

יומיים לאחר חניכת הצלב, ההורים מועברים לבקבוקון חדש וחמישה עד שישה ימים לאחר מכן, PUI יתחיל לאכלס את הבקבוקון הלבן PrepU. אני נבחר לביטוי GFP תחת טווח ניתוח פלואורסצנטי. בחירת פרה-פוי לבן מבטיחה בימוי נכון של בעלי החיים מכיוון שהם נשארים לבנים במשך כשעה.

לאחר האימון, הם הופכים פיגמנטיים או חומים. GFP המבטא pui נאסף בעדינות מהבקבוקונים באמצעות מברשת צבע רטובה ומניח בטיפת מים או PBS בצלחת פטרי, יש לנגב את הקנייה מחומרים אוטופלואורסצנטיים. באמצעות המכחול, הם אמורים להיות מוכנים כעת להדמיה טומוגרפית.

אם ה-PrepU I צריך להמשיך להזדקן כדי להגיע לשלב ההתפתחותי הנכון, ניתן להשאיר אותם בצלחת פטרי עם מגבת נייר רטובה או בבקבוקון מזון נקי. זה יבטיח לחות מספקת והתפתחות נכונה להדמיה. יש להדביק את ה-PrepU לחלק הפנימי של צינור נימי זכוכית בקוטר 800 מיקרון.

צבעו את הקצה האחורי של האישון עם דבק סופר כוונו את המשטח המודבק של הגולם הקדם-גולמי לתוך הצינור כך שהגישה האחורית הקדמית של הזבוב תהיה מקבילה לצינור. החלק הקדמי של החיה יתלה על צינור הנימים. הצינור הנימי מקובע כעת על שלב הסיבוב של המיקרוסקופ.

במצב אנכי, כוונן את ציר ההטיה של שלב הסיבוב כך שציר הסיבוב של הצינור יהיה במקביל לעמודות הפיקסלים של ה-CCD ההדמיה. כאשר מיקום הזבוב השתנה, המשך בהדמיה. בדוגמה זו, בעלי חיים עם בלוטות רוק פלואורסצנטיות אמורים להיות מדומים ל-oph המבטא GFP בבלוטות הרוק שלהם יכול להיווצר מהכלאה בין מניות EAG 4 ו-U-A-S-G-F-P.

אנו מתחילים עם גולם קדם רכוב, מאירים את הגולם המקדים עם קרן עירור ואוספים את אות הפלואורסצנט של GFP. בהארה, סובב את ה-PrepU 360 מעלות לאורך הציר האנכי שלו ורכוש את תמונות תאורת הטרנס. כל תמונה מתאימה ל-10 מעלות סיבוב.

זמן הרכישה הכולל תלוי בכמות הקרינה ובעוצמת קרן העירור. הזמנים האופייניים הם בסדר גודל של דקה אחת. בדוגמה זו, גולם DSO המבטא GFP בדיסקים הדמיוניים של הכנף יצולם בתמונות.

ניתן לאסוף את הגולם הזה מבקבוקון של הכלאה בין מניות Aus GAL 4 ו-U-A-S-G-F-P. הגולם המקדים מותקן כפי שתואר קודם לכן. עם זאת, מכיוון שזמן ההדמיה לניסוי זה הוא כשמונה שעות, קריטי שהסביבה תישאר לחה ובטמפרטורת החדר כדי למנוע התייבשות ומוות של החיה, מניחים תריס מעל קרן העירור כדי למנוע כיבוי של רביעיות פרחים ברקמה המעניינת, כמו גם כדי להבטיח שהחיה לא תישרף על ידי קרן הלייזר כמו קודם, להאיר עם קרן העירור ולאסוף את אות הפלואורסצנט GFP על ידי תאורת טרנס.

הגולם הקדם מסתובב לחלוטין לאורך הציר האנכי שלו. במהלך איסוף הנתונים, הסיבוב אורך דקה אחת בלבד וחוזר על עצמו במרווחי זמן שונים. כדי ליצור סדרה של תמונות של הכנפיים במהלך הפיתוח, ניתן להשיג נתונים במשך שש שעות לפחות בקצב של 100 תמונות לשעה.

חיוני שהחשיפה הכוללת לאור תישלט באמצעות תריס זה על מנת למנוע נזק או הלבנת תמונות. סרט זה מציג תמונות שנרכשו בין שלב ה-PrepU לסלידה מראשי התלמידים. בעת שחזור התמונה התלת מימדית, יש פיזור קדימה חזק שצריך לקחת בחשבון, שלא ניתן להעריך אותו על ידי דיפוזיה.

אז כדי להפוך את השחזור למודל פיזור קדימה של התפשטות אור יש לקבוע לשם פשטות, אנו מזניחים את הקליטה. כמות הפיזור נבדקת בניסוי. לשם כך, חפץ זר עם פלואורסצנטיות סטנדרטית מוחדר לתוך הגולם הלבן הלא פלואורסצנטי 1118, אשר נסרק לאחר מכן כדי ליצור את נתוני המודל הקדמי מתחילים במילוי צינור נימי סיליקה 100 מיקרון בצבע פלואורסצנטי PS 5.5.

באמצעות פעולה נימית, דחף את הצינור הנימי לתוך הגולם בזווית של 45 מעלות לציר הקדמי, הרכיב את ה-PrepU בצינור נימי ומקם אותו כראוי על הסיבובtagה כפי שתואר קודם לכן. כעת האירו את הגולם הקדם עם קרן לייזר עירור עם עדשת צמצם מספרית נמוכה ואספו תמונות תאורת טרנס פלואורסצנטית של הגולם הקדם. כפי שתואר קודם לכן, תוכנת MATLAB משמשת להתאמת הנתונים למודל התיאורטי המפורש קדימה כדי להקל על תהליך השחזור, נבחר קירוב הפירמה e למשוואת ההובלה כפי שהוא מתאר את משטר הפיזור קדימה ומתאים גם לנתוני הניסוי.

לאחר שקבענו את המודל הנכון קדימה, נוכל לשחזר את בלוטות הרוק ולקבל את השחזורים הטומוגרפיים של זמן-lapse. אם בכוונתך להשתמש בטומוגרפיה של שטח פנוי, ניתן להגדיר גם אלגוריתמי תצורה להתאמת אינדקס. ראשית, אנו מראים שחזור תלת מימדי של בלוטות הרוק בשלב מוקדם של ההתפתחות.

לשם השוואה, צביעה היסטולוגית של בלוטות הרוק מראה כי השחזורים תואמים היטב את ההיסטולוגיה. סרטון דולג זמן זה של התפתחות הדיסקים הדמיוניים של הכנף נרכש מדגימה חיה אחת. לשם השוואה, צביעה היסטולוגית של דיסקת הכנף באותן נקודות זמן מראה כי השחזורים תואמים היטב את ההיסטולוגיה.

זה עתה הראינו לכם כיצד לבנות מערכת להדמיית מבנים תלת מימדיים בתוך oph in vivo, ולאורך זמן. זה מאפשר לעקוב אחרינו, המורפוגנזה בדרוזופילה, ולעקוב אחר התפתחות הכנפיים במשך שש שעות רצופות. בעת ביצוע הליך זה, חיוני לבחור את המודל קדימה הנכון להתפשטות אור בתוך דרוזופילה.

ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם טכניקות היסטולוגיות כדי לשפוך אור על התפתחות איברים במהלך שלבי אישון, וניתן לשנות אותה לחקר אורגניזמים שונים בגודל דומה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.