ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

שלום, שמי ריק פסקווה, סטודנט במעבדה להנדסת תאי גזע כאן במחלקה למדעי הכימיה והחיים באוניברסיטת וירג'יניה קומונוולת'. בסרטון זה, אדגים כיצד המעבדה שלנו משתמשת במנגנון ספין STO זול ומתוצרת עצמית כדי ליצור שכבה חד-שכבתית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לכימות סמני פני התא. בהתחשב בכך שפרוטוקולים אימונוכימיים רבים מותאמים ל-h PSCs הגדלים בשקופיות תא כמושבות, עלולות להיווצר בעיות באפיון הביטוי של הסמנים הביולוגיים ברמת התא הבודד.

הימצאות התאים בשכבה אחת מסייעת לא רק בניתוח חזותי של אלה, אלא אולי גם בכימות הביטוי שלהם, ניתן לבנות את מנגנון הספין של הסינוס שבו משתמשות המעבדות שלנו באמצעות חומרים שנמצאים ברוב המעבדות זקוק רק לדגימת תאים קטנה ואינו זקוק לשום סוג של מגיב ספציפי. וחשוב מכך, הוא מסוגל לשחזר באופן אמין התפשטות של תאים בודדים לתצפית. הנה כמה מהדברים שתצטרך כדי לבנות את מנגנון הציטוזין.

מגלשות פלסטיק, מכיוון שאלו לא בהכרח חייבות להיות נקיות, אתה יכול להשתמש במגלשות קאמריות ישנות אם תרצה. מגלשות זכוכית מנוקות מראש. יש לנקות אותם מכיוון שכאן תיווצר שכבת התא החד-שכבתית.

נייר סינון, כל סוג צריך לעשות, וקצות מיקרו פיפטה. טיפים של 1 עד 10 מיקרוליטר הם מה שהמעבדה שלנו משתמשת בו לפני תחילת הבנייה. ראשית יש ליצור חורים במגלשות הפלסטיק.

ניתן לעשות זאת באמצעות מקדחה. קוטר החורים תלוי בגודל קצה הפיפטה המיקרו וצריך להיות בערך ברוחב החלק הרחב ביותר של הקצה המשמש לקצה פיפטה סטנדרטי של אחד עד 10 מיקרו. זה צריך להיות בסביבות שבעה מילימטרים.

כמות החורים שאתה יוצר במגלשות הפלסטיק תלויה לחלוטין בשימוש המיועד שלך לכך. עבור הצביעה האימונוכימית של המעבדה שלנו, למשל, אנו משתמשים בדרך כלל בשני חורים, אחד עבור הצביעה החיובית והשני עבור בקרת הרקע השלילי. ניתן לעשות שימוש חוזר בשקופיות אלה למספר בלתי מוגבל של פעמים.

עבור נייר המסנן, פשוט גזרו חתיכה ממנו לפרמטרים של שקופית הפלסטיק. השתמש בחורי השקופית כהתייחסות ליצירת חורים בנייר המסנן. גודל החור בנייר הסינון צריך להיות גדול מספיק כדי שקצה המיקרו פיפטה יוכל להתאים היטב כפי שמוצג כאן.

לאחר מכן עלינו לחתוך את המספר המתאים של קצות מיקרו פיפטה, אחד לכל חור בערך במחצית אורכו. זה ישמש כבסיס לשקופית הזכוכית למקום בו תיווצר שכבת המונו הסלולרית. לאחר מכן, נייר הסינון יונח על גבי זה.

נייר הסינון ישמש לספיגת כל המדיום העודף מכתמי המתלים. לאחר מכן תמלא זאת מגלשת הפלסטיק שתשמש כתמיכה מוצקה של המכשירים. לאחר מכן ניתן לאטום את זה מכל ארבעת הצדדים עם סרט ביתי רגיל.

לבסוף, קצות מיקרופיפט שלמים מוכנסים לאחר מכן לקצות החתוכים של המכשיר. זה יהיה המקום שבו יוכנסו הדגימות הסלולריות לאחר צביעת ההשעיה. זה עשוי להיות מועיל גם לסמן תחילה היכן בשקופית הזכוכית קצות החיתוך מופעלים לזיהוי נוח יותר.

פרוטוקול צביעת התרחיף האימונוכימי שבו משתמשת המעבדה שלנו כולל קציר ראשון של תאי גזע לתרחיף תא בודד, הנעשה בדרך כלל על ידי אנזימטי, באמצעות טריפסין או חוצצי דיסוציאציה של תאים מבוססי EDTA שאינם אנזימטיים. לאחר מכן התאים מועברים למ"ל אחד הם צינורות מיקרו צנטריפוגות של שני מ"ל ומצע הגידול הסטנדרטי שלהם. לאחר מכן אלה צנטריפוגות ב -200 גרם למשך ארבע דקות.

אותה מהירות צנטריפוגה תשמש לכל שלבי הכביסה והסחיטה הבאים. לאחר מכן נשאב המדיום החוצה באופן ידני, היזהר במיוחד בזמן השאיבה כדי להבטיח שכדור התא יישאר ללא הפרעה. לאחר מכן זה נשטף עם מ"ל אחד של PBS פעמיים מסתובב למטה ושואב החוצה בכל פעם.

השלב הבא כולל תיקון התאים באמצעות 4% זוג פורמלדהיד או ריאגנטים PFA הדרושים לייצור זה או המפורטים בכתיבה הנלווית לסרטון זה. התאים מודגרים בתמיסת פורמלדהיד 4% זוג ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מומלץ לבצע שלב זה לפני ההשעיה החוץ-תאית לשעבר, מכתים לשימוש במנגנון הסיבוב של ציטו.

לאחר מכן, התאים נשטפים פעמיים עם PBS כדי להסיר עקבות של ה-PFA. לאחר מכן יש לחסום את התא כדי למנוע כתמים לא ספציפיים. לאחר שטיפת ה- PBS בשלב הקודם, שאפו את הכביסה והוסיפו מ"ל אחד מתמיסת החסימה.

לאחר מכן יש להשאיר אותו בטמפרטורת החדר למשך כ- 45 דקות. בזמן ההמתנה לתמיסת החוסם, ניתן להכין את הנוגדן הראשוני על ידי דילול לתמיסת הדילול והחסימה המומלצת. אחסן את זה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר שהתאים נמצאים בתמיסת החסימה במשך כ-45 דקות, יש לסובב ולשאוף אותה החוצה ולהחיות אותם בתמיסת הנוגדנים הראשונית. למטרות זיהוי קשירה ובקרת רקע לא ספציפית, עדיף לשמור לפחות דגימה אחת כשלילית. לא הופעלו נוגדנים ראשוניים והם פשוט מושעים ב-PBS.

כל הדגימות נותרות בטמפרטורת החדר למשך כשעה. אם תרצה, ניתן להשאיר תאים קבועים בתרחיף בתמיסת הנוגדנים העיקרית למשך הלילה ולשטוף אותם פעמיים בתמיסת חסימה. ניתן לייצר את תמיסת הנוגדנים המשנית בזמן הכביסה.

נוגדנים משניים הם בדרך כלל רגישים לאור, כך שאם אפשר לעמעם את אורות המעבדה ולכסות את כל המיכלים המשמשים בנייר אלומיניום, זה נעשה כדי למנוע הלבנת פלואורסצנטיות. ניתן לשלב ריאגנטים של אנטיפה בפרוטוקול, אך יש לנקוט משנה זהירות בשימוש בהם מכיוון שהוא יכול לגרום לרקע גבוה יותר כמו הנוגדן הראשוני המדולל לריכוז המומלץ בתמיסת החסימה. החל ויס אחד על כל הדגימות בין אם נוספה להן ראשונית ובין אם לאו לאחר השלמת הכביסה.

הניחו לזה לעמוד באזור חשוך כמו בתוך צנצנת למשך כשעה. שוטפים את התאים עם מ"ל אחד של תמיסת חסימה פעמיים. התא אמור להיות מוכן כעת לצביעה גרעינית בצבע DPI.

הכן את תמיסת ה- DPI בדילול של 1 עד 10, 000 ב- PBS בתחילה, שטוף תאים במ"ל אחד של PBS פעם אחת, ואז החזר, השהה ב- dpi, ובואו נעמוד בטמפרטורת החדר כחמש עד 10 דקות. כמו הנוגדן המשני, DAPI רגיש לאור, לכן בצע את ההתאמות הנדרשות כדי למנוע פלואורסצנטיות, הלבנה. יש לשטוף פעם אחת עם מ"ל אחד של PBS ולבסוף, ראוס.

יש להשעות שוב ב-PBS אחד מ"ל. לאחר מכן זה אמור להיות מוכן לשימוש עם מכשיר סיבוב ציטו. הנח אופטימום 100 מיקרוליטר מקסימום של תמיסת התא הבודד בחלק העליון של קצות המיקרו פיפט.

עם זאת, מומלץ להשתמש בכמות נמוכה יותר כדי למנוע הצפה או טפטוף מיותרים. אחר־כך. הנח מנגנון סיבוב ציטו ואת איזון הנגד בצנטריפוגה שולחנית וסובב מטה ב-1000 סל"ד למשך ארבע דקות. לאחר מכן, פרק בזהירות את מנגנון הסיבוב של הציטו באופן שממזער את הסיכוי לעקירת התאים ממגלשת הזכוכית.

ודא שהעמידה התרחשה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני ההרכבה. אלו תמונות שצולמו של חד-שכבת של תא BG אחד V צבוע בארבעה סמני משטח תא SSCA ממנגנון הספין cyto. שימו לב עד כמה התאים מבודדים זה מזה, מה שמאפשר תצפיות ורישום של תא בודד.

מה שטוב בפרוטוקול זה הוא שהוא מסוגל לשחזר תאים חד-שכבתיים שהוא אפשרי, חסכוני וניתן להתאמה בקלות לכל ניתוח שגרתי של תרביות תאי גזע. אז עם זה, אני מקווה שתצייר את הסרטון הזה ותמצא את פרוטוקול השימוש במחקר שלך.