Name: ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למד ניתוח immunocytochemical של תאי גזע pluripotent אנושיים באמצעות מנגנון cytospin מתוצרת עצמית. השיטה יוצרת שכבה חד-שכבתית לצפייה וכימות סמנים פני תאיים SSEA-3/SSEA-4.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון חלקי עבור עבודה זו סופק על ידי קריירה NSF 0744556 (Rao) וכן מלגה דרך VCU-HHMI המדע החינוך תוכנית המחקר (פסקואל).

חלק 1: מכתים השעיה Immunocytochemical <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נקצרים לתוך ההשעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מועברים לאחר מכן לתוך 1.5-2ml צינורות microcentrifuge ו centrifuged ב 200 גרם במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפים החוצה על ידי aspirating supernatant, מחדש תלויה 1mL של PBS - (ללא Mg 2 + ו - Ca 2 +) ולאחר מכן centrifuged שוב למשך 4 דקות 200 גרם. זה צריך להיעשות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, תאים מקובעים אז paraformaldehyde 1mL של 4% (PFA) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על ידי השעיית אותם מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפים שוב פעמיים עם 1mL של PBS -. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר, על ידי שטיפת התאים לחסום מחדש השעיית אותם 1mL הפתרון בלוק (6% serum/94 PBS% -). דגירה אלה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר, צנטריפוגה צינורות ב 200 גרם במשך 4 דקות לשאוב את הפתרון חסום. Re-להשעות תאים 1mL הפתרון נוגדן ראשוני (עשה עם פתרון בלוק בדילול מומלץ). תאים יכולים להיות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C למשך הלילה לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפים לאחר מכן פעמיים עם 1mL הפתרון חסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר, מחדש תאים להשעות 1mL של פתרון נוגדנים משני (עשה עם פתרון בלוק בדילול מומלץ) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, תאים אמור להיות שטף שוב פעמיים עם 1mL הפתרון חסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כביסה עם הפתרון בלוק, לכבס שוב עם תאים 1mL של PBS -. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שוטף שונים, מחדש תאים להשעות 1mL של DAPI גרעיני כתם (1:10,000 דילול DAPI ב PBS -) ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 דקות, צנטריפוגה צינורות ב 200 גרם במשך 4 דקות. לשאוב את הפתרון גרעיני DAPI כתם מחדש להשעות תאים 1mL של PBS -. </li></ol> חלק 2: התאגדות של hPSCs בשקופיות שנוצר באמצעות מנגנון cytospin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות פלסטיק מוכנים ידי הפיכת הסכום הרצוי בהם חורים עם העיתונות תרגיל. הקוטר צריך להיות לכל היותר 1 מ&quot;מ גדול יותר בקוטר הרחב ביותר של קצה micropipette (ים) לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נייר מסנן לחתוך את הפרמטרים של השקופית פלסטיק עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חורים נעשים אז בעיתון הסינון. גודלו של החור (ים) צריך להיות גדול מספיק, כי את קצה micropipette (ים) מתאים מלבב דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אחד שקופיות פלסטיק מוכנים ממוקם על גבי שקופיות הזכוכית ממוקם בחלק התחתון של הנייר לסנן בסלע (איור 1). השכבות מובטחות עם הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקסימום של 100μL (תלוי בצפיפות monolayer הרצוי) של ההשעיה תא מוכתם חלק 1 ממוקם מכן לתוך החלק העליון של קצה micropipette (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, המנגנון עם פתרון התא יכול להיות שקל ומאזן נגדית של משקל דומה נוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון cytospin ו לאזן יכול ממוקמות אז בצנטריפוגה שולחניים centrifuged ב 200 גרם במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, המנגנון cytospin הוא מפורק בזהירות באופן doesn&#39;t לסלק את התאים מן שקופיות הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, PBS שמסביב עודף - בצד זכוכית aspirated החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לאחר מכן ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק אם monolayer תא הרצויה הושגה. </li></ol> חלק 3: שקופיות הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של התקשורת הרכבה הרצוי ממוקם ישירות במרכז של כל אזור המכיל תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר, להחליק כיסוי הוא הוריד בעדינות על גבי שקופיות מנסה להימנע בועות אוויר אם זה אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת הרכבה עודף מוסר אז משקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי, צד של תלושי לכסות חתומות עם מסמר לכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות יכולים להישמר בשטח אחסון כהה עד התוצאות הם נצפו ותועדו. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לענין במעבדה שלנו, צלחת 35mm של תא גזע תרבויות גדל על fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הוא המוקצב ההליך מכתים immunocytochemical לשימוש עם מנגנון cytospin. התאים נאספים אז באמצעות האנזימטית passaging, הסרת כמה שכבת MEF ככל האפשר, תוך השעיית תא בודד. אם גזע יותר יעיל תא הבידוד מהשכבה MEF הוא הרצוי, מושבות יכול להיות מעוכל לאחר מכן באופן ידני הרים לתוך ההשעיה. אם התנאים מזין חינם משמשים גדל בתאי גזע תרבויות, המושבות יכול להיות פשוט לגרד ו מעוכל לתוך ההשעיה. למרות ההשעיה הראשונית תא ...

<table><tbody><tr><td>שקופית תא Lab Tek Permanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>חומר לשקופיות פלסטיק לשימוש חוזר</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ Superfrost/Plus מנוקות מראש</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>טיפים עם מסנן 0.1-10&amp;mu;L</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי למיקרוסקופ</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>תושור להרכבה</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים נורמלי</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מונוקלונלי Mouse Anti-SSEA-4</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>נוגדן ראשוני לצביעת SSEA-4</td></tr><tr><td>נוגדן מונוקלונלי Rat Anti-SSEA-3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>נוגדן ראשוני לצביעת SSEA-3</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>נוגדן משני לצביעת SSEA-4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>נוגדן משני לצביעת SSEA-3</td></tr><tr><td>DAPI, Dihydrochloride</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית cytospin

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

אדם בתאי גזע pluripotent (hPSCs) הכוללים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) האדם הנגרמת גזע pluripotent תאים (hiPSCs) הם מקורות תא מרגש עקב התחדשות עצמית שלהם יכולות בלתי מוגבלות הפוטנציאל שלהם להתמיין לסוגי תאים שונים. המדינה pluripotent של hPSCs נבחנת בדרך כלל על ידי טכניקות כגון qPCR, immunocytochemistry, ועל ידי אחרים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em&gt; בידול אסטרטגיות לתוך תאים מסוגים שונים. בין אלה, טכניקות immunocytochemical פותחו לאפיון שגרתית של המדינה מובחן של hPSCs מבוסס על ניתוח של סמנים ביולוגיים המועמד תאיים על פני קרום התא. בהתחשב בעובדה hPSCs לגדול מושבות, בעיות המתעוררות לכימות ביטוי של סמנים אלה ברמת התא היחיד על בסיס שגרתי. Cytometry ניתוח תזרים לשמש כדי לטפל בבעיה זו אך דורשים מספרים סלולריים השימוש ריאגנטים כי הם לא תורם בדרך כלל הערכה מלאה שגרתית איכות של תרבויות hPSC. לפיכך, פיתוח של אמצעים מעשיים לשעתקו של יצירת תאים בדגימות monolayer עם יושרה נשמרים לצורך הערכה סמן יש יתרונות רבים במחקר בתאי גזע. זה מאוד יתרונות ניתוח immunocytochemical כי תאים בודדים מתוך monolayer ניתן להבחין בקלות לכמת ביטוי של סמנים ספציפיים. לקראת מטרה זו, מנגנון מתוצרת עצמית cytospin נבנה מותאם לשימוש עם מכתים immunocytochemical. שני סמנים על פני קרום התא (SSEA3/SSEA4) ביטוי נותחו קו גרסה BG01 תא גזע לצורך פרוטוקול זה.

מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.

ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs), הכוללים תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (hiPSCs), הם תאים מרגשים...

שלום, שמי ריק פסקוואה, סטודנט במעבדה להנדסת תאי גזע כאן במחלקה למדעי הכימיה והחיים באוניברסיטת וירג'יניה קומנוולת'. בסרטון זה, אדגים כיצד המעבדה שלנו משתמשת במכשיר ספין STO זול ומיוצר עצמית כדי ליצור שכבה אחת (monolayer) נצפית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצורך כימות של סממנים על פני השטח של התא. בהינתן שפרוטוקולים אימונוכימיים רבים מותאמים ל-hPSC הגדלים בתוך שקופיות תא (chamber slides) כמושבות, עלולים להיווצר קשיים באפיון הביטוי של הביומארקרים ברמת התא הבודד.שמירה על התאים בשכבה אחת (monolayer) מסייעת לא רק בניתוח חזותי שלהם, אלא ייתכן שגם בכימות הביטוי שלהם. ניתן להרכיב את מכשיר ה-sinus spin שבו אנו משתמשים במעבדותינו מחומרים הנמצאים ברוב המעבדות; הוא דורש רק דגימת תאים קטנה ואינו זקוק לסוג מסוים של ריאגנט. וחשוב מכך, הוא מסוגל לשחזר באופן מהימן פריסה של תאים בודדים לצורך תצפית. להלן חלק מהדברים שיהיו דרושים לכם כדי להרכיב את מכשיר ה-cytosine.שקופיות פלסטיק; מכיוון שהן לא חייבות להיות נקיות, ניתן להשתמש בשקופיות תא (chamber slides) ישנות אם תרצו. שקופיות זכוכית שנקו לפני כן. אלו חייבות להיות נקיות כיוון ששם ייווצר השכבה החד-שכבתיות (monolayer) של התאים.נייר סינון, כל סוג יהיה מתאים, וטיפים לפיפט מיקרו. המעבדה שלנו משתמשת בטיפים של 1 עד 10 µL לפני תחילת הבנייה. ראשית, יש ליצור

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Immunocytochemistry היא שיטה חזקה כדי לקבוע את הנוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן עניין תאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו אחד לשמר נוגדנים להפיק את המרב של מכתים אחד.

Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

בתאי גזע pluripotent הגוברת ההשעיה להתמיין גופים embryoid (EBS). כאן אנו מדגימים כיצד להשיג איכות גבוהה EB cryosections שימושי לחקר ההיבטים תאית ומולקולרית של העובר, תוך שמירה על הארגון שלהם כמו אגרגטים.

ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ליצירת גופים עובריים (EBs). ה- EBs מתורבתים על פיגום פולימרי באמצעות מדיום אינדוקציה, המקדם התמיינות לתאי גזע עצביים, תאי אב ונוירונים לא בוגרים. לבסוף, EBs מוטמעים במטריצה ומועברים למדיום תחזוקה ליצירת אורגנואידים מוחיים.

יצירת אורגנואידים מוחיים פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי גזע

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה להפצת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מדיה מותנית בלבד שמקורה בשליה האנושית בצלחת מצופה ג'לטין ללא תוספת אקסוגנית נוספת או שכבות סינתטיות ספציפיות ל-hPSC.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

אפיון קבוע של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כדי לוודא שמירה על מצבם הפלוריפוטנטי, הוא צעד חשוב לפני שתאים אלה משמשים ליישומים אחרים. כאן אנו מתארים שיטה להתפשטות בקנה מידה קטן של iPSCs אנושיים שתוכננה במיוחד כדי לאפשר אפיון קל ושגרתי שלהם באמצעות אימונוציטוכימיה.

רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה שני שלבים המבדילים הקרנית תאי גזע limbal אפיתל מתאי גזע pluripotent האנושי בתנאים ללא תא תרבות קסנו - ולא מזין. השיטות התרבות התא המוצג כאן מאפשרים חסכוניים, בקנה מידה גדול ייצור תאי איכות קליניים, החלים על שימוש טיפול תאי הקרנית.

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

למד ניתוח immunocytochemical של תאי גזע pluripotent אנושיים באמצעות מנגנון cytospin מתוצרת עצמית. השיטה יוצרת שכבה חד-שכבתית לצפייה וכימות סמנים פני תאיים SSEA-3/SSEA-4.

ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

גלה סרטונים נוספים