ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid
December 8th, 2010
בתאי גזע pluripotent הגוברת ההשעיה להתמיין גופים embryoid (EBS). כאן אנו מדגימים כיצד להשיג איכות גבוהה EB cryosections שימושי לחקר ההיבטים תאית ומולקולרית של העובר, תוך שמירה על הארגון שלהם כמו אגרגטים.
חלק ראשון, מבוא. היי, שמי רפאל. אני פוסט-דוקטורנט במעבדת פרופסור סטיבנס הנס באוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו בברזיל.
היי, שמי איסמעיל. אני עוזרת מחקר, גם פרופסור. בסרטון זה נראה כיצד להכין חלקים ברורים של גופי אנדרואיד.
אז בואו נתחיל. חלק שני, חומרים וציוד. לצורך הליך זה, נצטרך מדיום הטבעה לדגימות קפואות.
תמיסת אלדהיד 4% פרפורם לקיבוע התאים, תמיסות סוכרוז להגנה מפני קריו. מחט עם קצה כפוף מעט, מיקרוסקופ סטריאו להדמיה טובה יותר של ה- EBS ושייקר. חלק שלישי.
כאן גופי העובר האנושיים מתורבתים בצלחות תרבית שאינן דביקות. בעזרת פיפטה אנו מקבצים את כל גופי העוברים קרוב ככל האפשר זה לזה על מנת להעביר אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. ה-EBS נקצר בזהירות ומועבר לצינור.
חשוב לאסוף את כל ה-ebs מכיוון שאין כמות גדולה של חומר לאחר סילוק ה-EBS, אמצעי התרבות מושלכים בזהירות. אתה אמור להיות מסוגל לראות את הכדור בתחתית הצינור. כעת נוכל להמשיך להליך הקיבוע.
EBS יתוקן בתמיסת אלדהיד 4% Paraform ב-PBS או בתמיסת מלח חוצצת פוספט. חשוב להשעות את הגלולה עם תמיסת PFA. לאחר מכן מקובעים EBS בתמיסת קיבוע למשך 30 דקות.
לאחר הקיבוע, תמיסת ה- PFA מוסרת בזהירות. תוך הקפדה על הימנעות מ-Resus להשהות את ה-EBS והוחלף בתמיסת סוכרוז של 10% ב-PBS כדי ליזום הגנת קריו של ה-EBS, החומר נשמר למשך 30 דקות בתמיסה זו. לאחר מכן, אנו מסירים בזהירות את תמיסת הסוכרוז של 10% ומשעים מחדש את ה-EBS בתמיסת סוכרוז של 20%.
שוב, EBS נשמר למשך 30 דקות בתמיסה זו. לבסוף, תמיסת הסוכרוז של 20% מוסרת ומוחלפת בתמיסת סוכרוז של 30% ב-PBS שם היא נשמרת למשך 30 דקות נוספות. כעת נוכל להמשיך לכיוון ולחסימה של ebs.
במעבדה שלנו, אנו משתמשים בקליפות קפסולות ריקות כתבניות. לחסימת ה- ebs, חשוב לצפות את הדפנות הפנימיות של הקצה בתמיסת סוכרוז לפני איסוף ה- ebs. כעת אנו יכולים לאסוף בזהירות את ה- EBS ולהמתין עד שהם יתפזרו לתחתית הקצה.
לאחר מכן, ה-EBS ממוקם במרכז הבלוק. זה אמור להיות המיקום הסופי של EBS בתוך הבלוק. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו וקצה עדין, אנו אוספים ומשחררים כמה שיותר תמיסת סוכרוז.
תמיד מקפיד לא לאסוף את ה-ebs. בעזרת מחט עם קצה כפוף מעט, כל ה-EBS ממוקמים במרכז הבלוק. לבסוף, תמיסת הסוכרוז שנותרה נאספת עם פיסות נייר פילטר.
המיקום הספציפי של EBS בתוך הבלוק חשוב מאוד להשגת פרוסות באיכות טובה. הנה דוגמה למיקום גרוע של הברונזה הקדומה בתוך הקונכייה. לאחר מיקום ה-EBS והסרת תמיסת הסוכרוז, המעטפת מתמלאת ב-OCT החל מהקצוות, תוך הקפדה תמיד להימנע מהשעיית ה-ebs של Resus.
את הבועות הנותרות מסירים בעזרת פיפטה, והקליפות נסערות למשך 15 דקות. בעקבות התסיסה. בלוק ה-OCT קפוא בקרח יבש.
בשלב זה, אתה יכול לאחסן את הבלוק עטוף בנייר אלומיניום במינוס 80 מעלות צלזיוס להמשך ניתוח או להמשיך לקריוסטט חלק רביעי, חיתוך. כדי ליצור את קטעי הקריו, תזדקק ללהב חד פעמי או קבוע, שקופיות זכוכית OCT ופולי L ליזין. בלוק ה-OCT מוציא מהמקפיא ונשמר בתוך הקריוסטט עד שהוא מגיע למינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן הבלוק ממוקם על המעמד ומיושר במקביל לקצה הלהב. דגימות EB קטנות בהרבה מרוב דגימות הרקמה האחרות, ולכן חשוב מאוד לוודא שכל פני השטח של הבלוק נוגעים בלהב בו זמנית, ובכך למזער את אובדן החומר. לאחר מיקומו, חותכים את הבלוק לפרוסות של 10 מיקרומטר, ואלה נאספים ישירות על שקופיות הזכוכית.
ניתן לאחסן את המגלשות, רצוי במינוס 70 מעלות צלזיוס, או להשתמש בהן גם באותו היום. החומר עשוי להיות צבוע לאימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנטיות. מסקנה. השיטה המתוארת כאן מספקת פרוטוקול זול למדי וקל לביצוע להשגת קטעי קריוסטט דקים של גופי עובר שפותחו הן משושלות תאי גזע H 9 אנושיים והן משושלות תאי גזע US P 1 של עכבר.
ניתן להשתמש בקטעי הקריו המתקבלים במגוון רחב של הליכים על מנת לנתח ביטוי חלבון או מורפולוגיה של EB.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מדגים את התהליך להשגת קריו-סקציות באיכות גבוהה של גופי עוברים (EBs) שמקורם בתאי גזע רב-עוצמיים הגדלים בהשעיה. קריו-סקציות אלו חיוניות לחקר ההיבטים התאיים והמולקולריים של בריאה תוך שמירה על הארגון של גופי EBs.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- בריאה
- התמיינות תאית
רקע
- תאי גזע רב-עוצמיים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים.
- גופי עוברים הם אגרגטים שמדמים התפתחות עוברית מוקדמת.
- חקר גופי EBs עוזר להבין את מנגנוני הבריאה.
- קריו-סקציות באיכות גבוהה חיוניות לניתוח מפורט.
מטרת המחקר
- לספק שיטה להכנת קריו-סקציות של גופי EBs.
- להקל על חקר התהליכים התאיים והמולקולריים במהלך התמיינות.
- לשמר את הארגון המבני של גופי EBs בניתוח.
שיטות ששימשו
- הכנת תאי גזע רב-עוצמיים בתרבית השעיה.
- גירוי של התמיינות לגופי עוברים.
- טכניקות קריו-סקציה להשגת דגימות באיכות גבוהה.
- ניתוח של מאפיינים תאיים ומולקולריים של גופי EBs.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של קריו-סקציות מגופי EBs.
- שימור הארגון של גופי EBs בקריו-סקציות.
- יכולת משופרת לחקר בריאה ברמה התאית.
- הוכח שהשיטה ניתנת ליישום בהקשרים מחקריים שונים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת ניתוח מפורט של גופי EBs.
- קריו-סקציות באיכות גבוהה הן חיוניות למחקרים עובריים.
- גישה זו יכולה לקדם את ההבנה של התמיינות תאי גזע.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
