ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid
8 בדצמבר 2010
בתאי גזע pluripotent הגוברת ההשעיה להתמיין גופים embryoid (EBS). כאן אנו מדגימים כיצד להשיג איכות גבוהה EB cryosections שימושי לחקר ההיבטים תאית ומולקולרית של העובר, תוך שמירה על הארגון שלהם כמו אגרגטים.
חלק ראשון, מבוא. שלום, שמי רפאל. אני פוסט-דוקטור במעבדה של פרופסור Stevens Hans באוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו בברזיל.
שלום, שמי איסמעיל. אני עוזר מחקר וגם פרופסור. בסרטון זה, נראה כיצד להכין חתכים שקופים של גופי Android.
אם כן, נתחיל. חלק שני, חומרים וציוד. עבור הליך זה, נזדקק לתווך שיכון לדגימות קפואות.
תמיסת Paraformaldehyde בריכוז 4% לקיבוע התאים, תמיסות סוכרוז להגנה בקריו (cryo protection). מחט עם קצה כפוף מעט, מיקרוסקופ סטריאו לוויזואליזציה טובה יותר של ה-EBS ומנער (shaker). חלק שלושה.
כאן גופי העוברים האנושיים גודלים בצלחות תרבית שאינן דביקות. באמצעות פיפט, אנו מרכזים את כל גופי העוברים קרוב זה לזה ככל האפשר כדי להעבירם לשפופרת קונית של 15 milliliter. ה-EBS נאספים בזהירות ומועברים לשפופרת.
חשוב לאסוף את כל ה-ebs מכיוון שאין כמות גדולה של חומר. לאחר שפכו את ה-EBS, יש להשליך בזהירות את מצע התרבית. כעת תוכלי לראות את המשקע בתחתית המבחנה. כעת ניתן להמשיך להליך הקיבוע.
יש לקבע את ה-EBS בתמיסת Paraform aldehyde בריכוז 4% ב-PBS או במיץ סליין עם בופר פוספט. חשוב לערבב מחדש את המשקע בעזרת תמיסת PFA. לאחר מכן, מקבעים את ה-EBS בתמיסת הקיבוע למשך 30 דקות.
לאחר הקיבוע, מסירים בזהירות את תמיסת ה-PFA. תוך הקפדה להימנע מהשעיה של ה-EBS, מחליפים את התמיסה בתמיסת סוכרוז 10% ב-PBS כדי להתחיל בהגנה קריוגנית של ה-EBS, ומשאירים את החומר בתמיסה זו למשך 30 דקות. לאחר מכן, מסירים בזהירות את תמיסת הסוכרוז 10% ומשעיים מחדש את ה-EBS בתמיסת סוכרוז 20%.
שוב, משאירים את ה-EBS למשך 30 דקות בתמיסה זו. לבסוף, מסירים את תמיסת ה-20%sucrose ומחליפים אותה בתמיסת 30%sucrose ב-PBS, שבה הם נשמרים למשך 30 דקות נוספות. כעת ניתן להמשיך להכוונת ה-ebs ולחסימתם.
במעבדה שלנו, אנו משתמשים בקליפות קפסולות ריקות כתבניות. לצורך חסימה של ebs, חשוב לצפות את הדפנות הפנימיות של הטיפ בתמיסת סוכרוז לפני איסוף ה-ebs. כעת ניתן לאסוף בזהירות את ה-EBS ולהמתין עד שישקעו לתחתית הטיפ.
בשלב הבא, מניחים את ה-EBS במרכז הבלוק. זה אמור להיות המיקום הסופי של ה-EBS בתוך הבלוק. בעזרת מיקרוסקופ סטריאוסקופי וקצה דק, אנו אוספים ומרוקנים כמה שיותר מתמיסת הסוכרוז.
יש להקפיד תמיד לא לאסוף את ה-ebs. באמצעות מחט בעלת קצה כפוף מעט, ממקמים את כל ה-EBS במרכז הבלוק. לבסוף, אוספים את תמיסת הסוכרוז הנותרת באמצעות פיסות נייר סינון.
המיקום הספציפי של ה-EBS בתוך הבלוק חשוב מאוד להשגת פרוסות באיכות טובה. להלן דוגמה למיקום לקוי של ה-EB בתוך המעטפת. לאחר מיקום ה-EBS והסרת תמיסת הסוכרוז, ממלאים את המעטפת ב-OCT החל מהקצוות, תוך הקפדה תמידית להימנע מכך שה-Resus ירפה את ה-ebs.
את הבועות הנותרות מסירים באמצעות פיפטה, ואת הקליפות מערבבים במשך 15 דקות. לאחר הערבוב, מקפיאים את בלוק ה-OCT בקרח יבש.
בשלב זה, ניתן לאחסן את הבלוק עטוף בנייר אלומיניום בטמפרטורה של 80°C- להמשך אנליזה, או להמשיך לחלק ארבעה של הקריוסטט, חיתוך. כדי להכין את הפרוסות הקריוסטטיות, תזדקקו ללהב חד-פעמי או קבוע, ל-OCT ולשקופיות זכוכית שעברו טיפול מוקדם ב-poly L lysine. את בלוק ה-OCT מוציאים מהמקפיא ושומרים בתוך הקריוסטט עד שיגיע לטמפרטורה של 20°C-.
לאחר מכן מניחים את הבלוק על המעמד ומיישרים אותו במקביל לקצה הלהב. דגימות EB קטנות בהרבה מרוב דגימות הרקמה האחרות, ולכן חשוב מאוד לוודא שכל שטח הפנים של הבלוק נוגע בלהב בו-זמנית, ובכך למזער את אובדן החומר. לאחר המיקום, הבלוק נחתך לפרוסות בעובי 10 micrometer, ואלו נאספות ישירות על גבי למסות הזכוכית.
ניתן לאחסן את הדגיות, רצוי בטמפרטורה של 70- °C, או להשתמש בהן באותו היום. ניתן לצבוע את החומר עבור אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה. סיכום. השיטה המתוארת כאן מספקת פרוטוקול זול יחסית וקל לביצוע להשגת חתכים דקים בקריוסטט של גופי עובריים שהתפתחו משושלות תאי גזע של בן אדם H9 או של עכבר US P1.
ניתן להשתמש בחתכי הקריו שהתקבלו במגוון רחב של פרוצדורות לצורך ניתוח של ביטוי חלבונים או מורפולוגיה של EB.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את התהליך להשגת חתכי קריו (cryosections) איכותיים של גופי עובריים (EBs) שנגזרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים שגודלו בתרחיף. חתכי קריו אלו חיוניים לחקר ההיבטים התאיים והמולקולריים של embryogenesis תוך שמירה על הארגון של ה-EBs.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של תאי גזע
- עוברגנזה
- דיפרנציאציה תאית
רקע
- תאי גזע פלוריפוטנטיים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים.
- גופים עובריים (Embryoid bodies) הם אגרגטים המדמים התפתחות עוברית מוקדמת.
- חקר גופים עובריים מסייע להבנת המכניזמים של embryogenesis.
- חתכים קריוסיים באיכות גבוהה הם חיוניים לניתוח מפורט.
מטרת המחקר
- מתן שיטה להכנת חתכים קריוגניים (cryosections) של EBs.
- סיוע בחקר תהליכים תאיים ומולקולריים במהלך דיפרנציאציה.
- שימור הארגון המבני של EBs לצורך הניתוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים בתרבית סספנסיות.
- השראה שלהבניה לגופים עובריים (embryoid bodies).
- טכניקות של חיתוך בהקפאה (Cryosectioning) להשגת דגימות באיכות גבוהה.
- ניתוח של מאפיינים תאיים ומולקולריים של EBs.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של חתכים קפואים (cryosections) מגופי Embryoid (EBs).
- שימור הארגון של ה-EB בחתכים הקפואים.
- יכולת משופרת לחקר האמבריוגנזה ברמה התאית.
- השיטה שהודגמה ניתנת ליישום בהקשרי מחקר שונים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת ניתוח מפורט של EBs.
- חתכים קריוגניים (cryosections) באיכות גבוהה הם בעלי ערך למחקרים עובריים.
- גישה זו עשויה לקדם את ההבנה של דיפרנציאציה של תאי גזע.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביצוע חיתוך קריו-סכציוני (cryosectioning) באיכות גבוהה של גופי Embryoid (EBs) שנגזרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מאפשר ניתוח מרחבי מדויק של סממני גזירה וארגון רקמות, ובכך תומך בגילוי מוקדם ובתיקוף מטרות ברפואה רגנרטיבית ובביולוגיה התפתחותית. יכולת זו מגבירה את הביטחון החוזה במודלים מבוססי תאי גזע ומסייעת בקבלת החלטות מותאמות סיכון בנקודות השבחה מרכזיות בתהליך הגילוי. חיתוכים קריו-סכציוניים אמינים של EBs מקלים על אינטגרציה של נתונים רב-תחומיים לקידום תיק הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של ביטוי סמני פלוריפוטנציה וסמנים ספציפיים לשושלות תאים בתוך מבני EB תלת-ממדיים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת מסלולי התמיינות והטרוגניות תאית.
- מספק הקשר מרחבי לתיקוף של מטרות פונקציונליות במערכות המופקות מתאי גזע.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מסייע בהכנת נתחי קריו (cryosections) סטנדרטיים של גופי אמריובלסטים (EB) עבור בדיקות אימונופלואורסצנציה והibridization in situ הניתנות לשחזור.
- מאפשר הערכה כמותית של התפלגות חלבונים ו-RNA בחתכים של EB.
- תומך במדרגיות של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת תרכובות במודלים של תאי גזע.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה בידול in vitro לתהליכים התפתחותיים in vivo לצורך מידול רלוונטי למחלות.
- מאפשרת רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי שימור ארכיטקטורת ה-EB ומיקום הסמנים.
- מספקת תובנות מכניסטיות המנחות אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטת החיתוך בקירור (cryosectioning) זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרי בידול מוקדמים של תאי גזע, דרך פיתוח בדיקות ועד לתיקוף מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי פלוריפוטנטיות והתחייבות לשושראת (lineage commitment) בתוך גופי Embryoid (EBs).
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור ביטוי סמנים וארגון רקמות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידות ברזולוציה מרחבית לצורך ניתוח השוואתי של תנאי גבירה.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים in vitro לרלוונטיות התפתחותית in vivo, כאשר הדבר נתמך על ידי דפוסי ביטוי של סמנים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת זרימת עבודה סטנדרטית לניתוח EBs, הישmimeה להחלה על קווי תאי גזע מרובים ופרוטוקולי גבירה שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בדיפרנציאציה של תאי גזע ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של חיתוך EB עבור אנליזות המשך הניתנות לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים מרחביים ומולקולריים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות גילוי מבוססות תאי גזע.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביצוע חיתוכי קפואים (cryosectioning) ובטיפול במצברי תאים תלת-ממדיים עדינים.
- דורש גישה לקריוסטט (cryostats), לחומרי הטבעה ולתשתיות דימות לצורך ניתוח המשך.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ההכנה והחיתוך של גופי גשמיים (EB).
- ניתן להתאמה לקווי תאי גזע פלוריפוטנטיים שונים ולמודלים של דיפרנציאציה, תוך מתן תשומת לב לגודל ולמורפולוגיה של ה-EB.
- תלוי באוריינטציה ובהטבעה מדויקות כדי להבטיח חיתוכים איכותיים וניתנים לפירוש.
