Name: ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: למדו הכנה של קריוסקשנים באיכות גבוהה מגופים אמבריואידיים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי ותאי של תהליכי היווצרות העובר תוך שמירה על מבנה הגופים האמבריואידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי Fundação דה Amparo Pesquisa לעשות Estado לעשות בריו דה ז&#39;נרו (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico דואר Tecnológico (CNPq) ואת Instituto Nacional de Tecnologia Ciência דואר (INCTC). אנו מודים ברונה ס פאולסן ואלין מ פרננדס לתמונות EB.

1. קיבוע ו cryopreservation בתאי גזע pluripotent היו בתרבית על fibroblasts העכבר עובריים (MEF) מומת עם mitomycin C ומתוחזק DMEM/F12 בתוספת החלפת בנוקאאוט 20% נסיוב (KSR) ו 8ng / mL של גורם גדילה פיברובלסטים (FGF-2). על מנת לגרום להיווצרות תאים EB H9 הועברו לא חסיד כלים בתרבית למשך 7 ימים, נשמר DMEM/F12 בתוספת 15% KSR 8. שים לב (!): טכניקה זו ניתן להשתמש EBS נגזר כל עובריים ו המושרה גזע pluripotent. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את EBS מצלחת התרבות עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת EBS על צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ולהמתין החומר שוקע לתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולתקן EBS עם paraformaldehyde 4% (PFA) פתרון PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שים לב (!): עבור התאוששות הכלאה באתרו אנטיגן צריך להיעשות על מנת למנוע תגובה קישור לחצות עם נוגדנים עקב השימוש של PFA 6,7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון PFA ולשטוף עם PBS עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EBS יש להציב דילול סדרתי של PBS שנאגרו פתרונות סוכרוז (10, 20 ו ברצף, 30%) ב 25-28 מעלות צלזיוס, כל פתרון חייב להיות מוחלף כל 30 דקות. חומר אז יכול להיות מצויד בפתרון סוכרוז 30% ב 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הטבעה עם אוקטובר </li></ol> 2. הטבעת רקמות, הדרכה הקפאת <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לאסוף את EBS מהצינור. ככל פריקה סוכרוז פתרון האפשרית. שים לב (!): חשוב להרטיב את הקיר הפנימי של קצה עם פתרון סוכרוז לפני איסוף EBS. הליך זה יכול להימנע EB להיות מחוברת בקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום EBS במתכונת ולהסיר פתרון סוכרוז שנותרו עם נייר סינון. שים לב (!): חשוב לא למלא את התבנית עם EBS, כדי למנוע חפיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא עובש עם אוקטובר לאט, נזהרת שלא מחדש להשעות את EBS. אחרי זה, במקום כל EB במרכז התבנית ולהסיר בועות עם פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעטה להתסיס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את התבנית עם קרח יבש כתוש להקפיא את המדגם. אוקטובר אמור להיות קפוא לחלוטין. בשלב זה חוסם יכול להיות מאוחסן ב -70 ° C, למשך שנה אחת לפחות. </li></ol> 3. Cryosectioning טכניקה <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גוש קפוא מ -70 מעלות צלזיוס ומניחים על cryostat מקורר בעבר בין -18 ו -21 בטמפרטורה ° C. שים לב (!): הטמפרטורות מחוץ לטווח זה עלול לגרום לבעיות כמו קטעי מסתלסל, נמס או פיצוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק לחסום אוקטובר מהתבנית ומניחים אותה לתמוך cryostat ידי הוספת אוקטובר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לכוון את הבלוק שצריך ליישר אותו במקביל קצה הלהב. שים לב (!): כפי EBS הם קטנים יותר מאשר דגימות רקמות אחרות, שלב זה חשוב מאוד כדי להקטין את איבוד של חומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוקים אוקטובר אמור להיות מחולק באופן שטחי עד המטוס משטח מתקבל. סעיפים דק (10μm) של הדגימה רקמות חייב להילקח ועלה על שקופיות הזכוכית מצופה בעבר עם 200 מ&quot;ג / מ&quot;ל פולי L ליזין (10 μL לכל שקופית) 9,10. שים לב (!): כדי להימנע בסעיפים torned לשים לב לנזקים בבית הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הסעיפים צריכים להיות באוויר יבש לשעה 1 בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשמש או מאוחסנים -70 ° C עד השימוש. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-117 (1998).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6, 88-95 (2000).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+embryoid+body+formation%3A+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).</li>
<li>Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).</li>
<li>Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+combined+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry.</a> Mol Cells. 24, 76-82 (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).</li>
<li>Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+cell+survival+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies.</a> Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).</li>
<li>Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+section+adhesion+for+immunocytochemistry+using+high+molecular+weight+polymers+of+L-lysine+as+a+slide+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating.</a> Histochemistry. 77, 275-279 (1983).</li>
<li>Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+specific+relaxin-binding+cells+in+thecervix%2C+mammary+glands%2C+and+nipples+of+pregnant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats.</a> Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן מספק קל לעקוב אחר פרוטוקול להשיג PFA סעיפים קבועים cryostat דקה של גופים embryoid שימושי immunofluorescence וב מבחני הכלאה באתרה. Cryosections וכתוצאה מכך לאפשר חקר היבטים תאית ומולקולרית של האדם התמיינות בתאי גזע עובריים, תוך שמירה על המבנה שלהם בארגון כמו אגרגטים.

<table><tbody><tr><td>D (+) סוכרוז</td><td>ריאגנט</td><td>Vetec</td><td>228</td><td></td></tr><tr><td>פראפורמאלדהיד</td><td>ריאגנט</td><td>Rieden-de Ha&amp;#235;n</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת PBS</td><td>ריאגנט</td><td>LGC Biotecnology</td><td>13-30259.05</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>200mg/mL במים</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>ריאגנט</td><td>Sakura Finetek</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת סוכרוז</td><td>ריאגנט</td><td></td><td></td><td>תמיסת סוכרוז 10% ב-PBS w/v</td></tr><tr><td>תמיסת סוכרוז</td><td>ריאגנט</td><td></td><td></td><td>תמיסת סוכרוז 20% ב-PBS w/v</td></tr><tr><td>תמיסת סוכרוז</td><td>ריאגנט</td><td></td><td></td><td>תמיסת סוכרוז 30% ב-PBS w/v</td></tr><tr><td>מבחנה קונית</td><td>כלי</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td>מבחנה קונית 15mL</td></tr><tr><td>ניעור פלטות</td><td>כלי</td><td>Biomixer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קריוסטט</td><td>כלי</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>תבנית לפלטפורמת OCT</td><td>כלי</td><td></td><td></td><td>פלטפורמת תבנית פלסטיק</td></tr></tbody></table>

ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות cryosections של גופים embryoid

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

גזע עובריים (ES) התאים הם תאים שמקורם pluripotent מסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט בשלב עוברי מוקדם יונקים 1. שלב מכריע התמיינות של תאים עובריים היא היווצרות של גופים embryoid (EBS) אגרגטים 2, 3. היווצרות EB מבוסס על צבירת ספונטנית כאשר תאים עובריים הם בתרבית צלחות חסיד לא. תלת ממדי משחזר EB היבטים רבים של יונקים embryogenesis מוקדם להתמיין שלוש שכבות נבט: האאקטודרם והמזודרם ואת האנדודרם 4. Immunofluorescence וב הכלאה באתרו נמצאים בשימוש נרחב בטכניקות לצורך זיהוי של חלבונים היעד הנוכחי mRNA בתאים של קטע רקמה 5, 6, 7. כאן אנו מציגים טכניקה פשוטה ליצירת cryosections האיכות הגבוהה של הגופים embryoid. גישה זו מסתמכת על האוריינטציה המרחבית של הטבעה EB ב אוקטובר ואחריו הטכניקה cryosection. סעיפים שהתקבל יכולה להיות נתונה למגוון רחב של נהלים אנליטיים על מנת לאפיין אוכלוסיות של תאים המכילים חלבונים מסוימים, RNA או DNA. במובן זה, הכנת EB cryosections (10μm) הם כלים חיוניים לצורך ניתוח מכתים היסטולוגיה (למשל Hematoxilin ו Eosin, DAPI), immunofluorescence (למשל Oct4, nestin) או הכלאה באתרה. טכניקה זו יכולה גם לעזור להבין את ההיבטים של העובר ביחס לשמירה על מבנה תלת מימדי כדורית של EBS.

בתאי גזע pluripotent הגוברת ההשעיה להתמיין גופים embryoid (EBS). כאן אנו מדגימים כיצד להשיג איכות גבוהה EB cryosections שימושי לחקר ההיבטים תאית ומולקולרית של העובר, תוך שמירה על הארגון שלהם כמו אגרגטים.

ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid

תאי גזע עובריים (ES) הם תאים פלוריפוטנטיים המופקים מהמסה התאית הפנימית של עוברים מוקדמים של יונקים בשלב הבלסטוציסט 1. שלב מכריע ב...

חלק ראשון, מבוא. שלום, שמי רפאל. אני פוסט-דוקטור במעבדה של פרופסור Stevens Hans באוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו בברזיל.שלום, שמי איסמעיל. אני עוזר מחקר וגם פרופסור. בסרטון זה, נראה כיצד להכין חתכים שקופים של גופי Android.אם כן, נתחיל. חלק שני, חומרים וציוד. עבור הליך זה, נזדקק לתווך שיכון לדגימות קפואות.תמיסת Paraformaldehyde בריכוז 4% לקיבוע התאים, תמיסות סוכרוז להגנה בקריו (cryo protection). מחט עם קצה כפוף מעט, מיקרוסקופ סטריאו לוויזואליזציה טובה יותר של ה-EBS ומנער (shaker). חלק שלושה.כאן גופי העוברים האנושיים גודלים בצלחות תרבית שאינן דביקות. באמצעות פיפט, אנו מרכזים את כל גופי העוברים קרוב זה לזה ככל האפשר כדי להעבירם לשפופרת קונית של 15 milliliter. ה-EBS נאספים בזהירות ומועברים לשפופרת.חשוב לאסוף את כל ה-ebs מכיוון שאין כמות גדולה של חומר. לאחר שפכו את ה-EBS, יש להשליך בזהירות את מצע התרבית. כעת תוכלי לראות את המשקע בתחתית המבחנה. כעת ניתן להמשיך להליך הקיבוע.יש לקבע את ה-EBS בתמיסת Paraform aldehyde בריכוז 4% ב-PBS או במיץ סליין עם בופר פוספט. חשוב לערבב מחדש את המשקע בעזרת תמיסת PFA. לאחר מכן, מקבעים את ה-EBS בתמיסת הקיבוע למשך 30 דקות.לאחר הקיבוע, מסירים בזהירות את תמיסת ה-PFA. תוך הקפדה להימנע מהשעיה של ה-EBS, מחליפים את התמיסה בתמיסת סוכרוז 10% ב-PBS כדי להתחיל בה

analysis-pluripotent-stem-cells-using-cryosections-embryoid

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים במהלך ההתפתחות. מצאנו כי בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הן שנוצר הרחיב בשליה בתוך נישות microenvironmental ייחודי. כאן אנו מתארים ניסיוני בטכניקות נדרש בידוד להדמיה של HSCs את השליה העכבר.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.

ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ליצירת גופים עובריים (EBs). ה- EBs מתורבתים על פיגום פולימרי באמצעות מדיום אינדוקציה, המקדם התמיינות לתאי גזע עצביים, תאי אב ונוירונים לא בוגרים. לבסוף, EBs מוטמעים במטריצה ומועברים למדיום תחזוקה ליצירת אורגנואידים מוחיים.

יצירת אורגנואידים מוחיים פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי גזע

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת תאי אב עצביים (NPCs) במבחנה מתאי גזע עובריים של עכברים (mESCs). mESCs מתורבתים בתרחיף ליצירת גופים עובריים (EBs), אשר מונחים לאחר מכן להתמיין NPCs באמצעות טיפול בחומצה רטינואית בתרבית דבקה.

טכניקה ליצירת תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים

assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לפתח מערכת תלת ממדית (3-D) מתאי גזע של האדם המושרה-פלוריפוטנט (hiPSCs) הנקראת גוף העובר החופשי בסרום (SFEB). מודל זה 3-D ניתן להשתמש כמו תרבות פרוסה organotypic כדי מודל התפתחות קליפת המוח האנושי ועל חקירה פיזיולוגית של פיתוח מעגלים עצביים.

פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

אנו מדווחים על היישום של לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותי ואחריו רצף תפוקה גבוהה בגופים embryoid שנוצרו בתאי גזע עובריים. טכניקה זו מאפשרת לזהות ולכמת את אנשי הקשר בין משפרי ואזורים היזם של גן נתון במהלך הבידול תא גזע עובריים.

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירה וניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וגרעין יחיד.

יצירה וניתוח במורד הזרם של תעתיקים חד-תאיים וגרעינים בודדים באורגנואידים במוח

למדו הכנה של קריוסקשנים באיכות גבוהה מגופים אמבריואידיים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי ותאי של תהליכי היווצרות העובר תוך שמירה על מבנה הגופים האמבריואידיים.

ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid

גלה סרטונים נוספים