Name: תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: למד שיטה יעילה ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מדם אנושי באמצעות וירוס סנדאי ללא טרנסגנים. הטכניקה משפרת את יעילות ההשבה ומאפשרת יישומים בטוחים ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).

1. הכנת נייד ומדיה (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולהרחיב פיברובלסטים אנושיים עם תקשורת DMEM המכילה 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts צלחת אדם (איור 1) על גבי צלחת 24 גם בצפיפות המתאימה לכל גם ביום שלפני התמרה. הערה: דילולים סדרתי הבאים מומלצים (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K ו6.25K) בגלל שיש לי תאים מסוגים שונים יכולת התקשרות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים לעוד יום אחד במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור, על מנת להבטיח את התאים יש דבק באופן מלא ומורחבים. </li></ol> 2. בצע התמרה (יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של התמרה, לבדוק את צפיפות התאים ובחר בארות צפיפות היעילה ביותר (איור 2). עדיף לבחור שלוש צפיפויות שונות: (80 ~ 90%) גבוהים, (20 ~ 40%) באמצע (50 ~ 70%) ונמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה לפחות 1 לפני התמרה, לשאוב fibroblתקשורת AST מהתאים ולשנות 300 μl החדש של מדיום פיברובלסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סט אחד של 4 צינורות וירוס סנדאי שונים מ-80 ° C האחסון. להפשיר צינור אחד באותו הזמן באמבט מים C ° 37 לכמה שניות, ולאחר מכן לקחת את הצינורות החוצה מאמבט המים. אחרי זה, להפשיר אותם לטמפרטורת חדר; צינורות צנטריפוגות ב 6,000 XG במשך 10 שניות ומניחים אותם על קרח עד שימוש. אל מחדש הקפאה ולהפשיר את הווירוס מאז כותרות לא לשמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכרכים מצויינים של כל אחד מארבעת צינורות וירוס סנדאי (אוקטובר -4, KLF-4, c-Myc וסוקס-2) לצינור מיקרו צנטריפוגות. ודא כי הפתרון הוא מעורב היטב על ידי pipetting בעדינות. לדוגמא, אם 50K תאים / גם אחד lookwell צלחת 24 גם לתמרה: (כייל מבוסס על תעודת ניתוח מחיים טכנולוגיים, יכול להיות שונה מיצווה כדי תצווה) צינור hOct-4 = 6.0 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 5 μl צינור hSox-2 = 6.5 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 4.6 μ; L צינור hKlf-4 = 6.3 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 4.8 μl צינור HC-Myc = 7.8 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 3.8 μl סה&quot;כ = 18.2 μl של ארבעה גורמי וירוס תערובת / טוב אחד (50K תאים) של צלחת 24 גם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לצפיפויות תא; להוסיף 2X, 1X, ו0.5x נפח של תערובת הווירוס לתוך הבאר. נער בעדינות את הצלחת קדמית לגב, משמאל ומימין (2X: 36.4 μl של תערובת וירוס, 1X: 18.2 μl ו0.5x: 9.1 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור ודגירת הלילה. </li></ol> 3. החלפה של תרבות בינונית (יום 3 והיום 5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר התמרה, להחליף את המדיום עם 500 בינוני פיברובלסטים μl טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, לשנות בינוני עם תקשורת פיברובלסטים טרי. </li></ol> 4. להכין מנות MEF לעמית התרבות (יום 8) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תאי MEF ב60 תרבות מנות מ&quot;מ עם 10% FBS הכיל מדיום DMEM דה אחדy לפני passaging פיברובלסטים transduced על מזין תאי MEF. הערה: אנו משתמשים 5 x 10 5 של MEF בכל מנה 60 מ&quot;מ. </li></ol> 5. התחל משותף תרבות transduced תאים עם תאי מזין MEF (יום 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ציפוי תאי transduced, לשאוב 10% FBS הכיל DMEM תקשורת ממנות מזין MEF ולהוסיף טריים 10% FBS הכיל מדיום DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המדיה מfibroblasts transduced שנמצאים בצלחת 24 היטב ולשטוף תאי פעם אחת עם D-PBS. הוסף 200 μl של 0.25% טריפסין / EDTA לתוך תאי פיברובלסטים ביישום לוח 24 גם צלחת. לאחר פחות מ -5 דקות דגירה עם טריפסין / EDTA, כאשר התאים מתחילים להתנתק מהצלחת, אוסף את התאים עם מדיום גידול ב15 מיליליטר צינור חרוטי. אז צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 4 דקות. הערה: איגום 2X, 1X, ווירוס 0.5x פיברובלסטים transduced מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום supernatant ולשטוף מחדש להשעותהתא גלולה עם 4-5 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי לנטרול מטריפסין. אז צנטריפוגות ב135 XG במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים כמו צפיפות דילול סדרתי ולהתחיל לתרבות משותפת עם תקשורת פיברובלסטים על MEF: כגון 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, ו1/128 ל60 מנה מ&quot;מ. בהתאם לשיעור המוות של תאים במהלך השבוע של התמרה הראשון, אחד עשוי שלא צריך לדלל עד 1/2 או 1/128 צפיפות. לשים בצד את התאים שנותרו כדי לחלץ רנ&quot;א הכל כביקורת חיובית לtransgene RT-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 60 מנות מ&quot;מ ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך לילה. </li></ol> 6. Feed תאי גזע עוברי האנושי בינוניים ולפקח על תאים (יום 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשנות את תקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. אחרי זה, לשנות בינוני יומי עם מדיום ES אנושי: 800 מיליליטר DMEM/F12 + 200 מיליליטר החלפת נוק סרום + 10 מיליליטר של L-גלוטמין + 10 מיליליטר של 10 חומצות אמינו מ&quot;מ MEM מינימום שאינו חיוניות+ 1 מיליליטר של 2-mercaptoethanol + 10 / מיליליטר ng הבסיסי פיברובלסטים Growth Factor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם שינוי בתקשורת יומיומי עם תקשורת ES אדם טרי. אחרי שבוע, לבדוק את הכלים פעם אחת לכל 2 ~ 3 ימים תחת מיקרוסקופ להיווצרות של גושי תאים כמו מושבה-ES. בהתאם לסוג התא, התרבות תיקח יותר או פחות זמן לפני שהמושבות נמצאות. </li></ol> 7. בחירת המושרה pluripotent גזע מושבות תאים ומרחיב את התאים (יום 20 ~) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה שבועות לאחר התמרה, מושבות צריכה להיראות גדלו כראוי לקטיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני לקטוף את המושבות, להכין מזין MEF בצלחת 24 גם. הערה: אנו משתמשים 12.5 x 10 5 של MEF בצלחת אחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשנות בינוני של מנות MEF מתקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. באופן ידני לבחור מושבה אחת בכל פעם מתחת למיקרוסקופ בקטיף מכסה המנוע ולהפוך את הגושים קטנים יותר על ידי pipetting ולהעביר אותםגבי הכין חדש MEF dishes.Try לאסוף כמה שיבוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר ולהרחיב את כל טוב מצלחת 24 גם לצלחת גם 6 בתחילה. ואז מצלחת 6 היטב ל60 מ&quot;מ כלים לפני התפשטות נוספת. </li></ol> 8. אפיון iPSCs האדם (לאחר 10 מעברים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs צלחת אדם בצלחת 24 גם ותרבות במהלך 4-5 ימים עם שינוי תקשורת מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחלת assay Immunofluorescence, לשטוף את הצלחת עם D-PBS פעם אחת. ואז לתקן את התאים באופן מיידי בparaformaldehyde 0.4% למשך 30 דקות. אחרי זה לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאים קבועים עם 0.1% טריטון ב PBS פתרון X-100 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון permeablization (0.1% פתרון X-100 טריטון), ולאחר מכן להוסיף 0.5% פתרון חסימת BSA במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע זיהוי של Nanog, אוקטובר -4, SSEA (antig העוברי בשלב מסויםen) וTRA-1-81 (אנטיגן הסרטני דחייה) באמצעות נוגדן אנטי אנושי ב0.5% פתרון BSA (לבדוק את טבלת חומר לשיעור דילול נוגדנים). דגירה העיקרית נוגדן ל2 שעות בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 1 שעות של דגירה עם 488 עיזים נוגדני IgG אנטי עכבר Alexa פלואוריד כנוגדן 2 nd, אשר בדילול 1:2,000 ב0.5% פתרון BSA בטמפרטורת חדר. להכתים את כל הגרעינים של כל תאי MEF מזין וhiPSCs עם DAPI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RT-PCR של אישור transgene <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ה-mRNA הכולל מתא גלולה באמצעות ריאגנטים מיצוי RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם שעתוק לאחור על aliquots (1 מיקרוגרם) של רנ&quot;א הכל וcDNA הנגזר לPCR הגברה על ידי הפוך transcriptase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תערובות PCR להכיל 2 μl של תבנית cDNA, 10 μl של תערובת אמן 2X PCR, 2 μl של 2 pmol של פריימרים(קדימה: μl 1 הפוך: μl 1) ו -6 μl של DW. כדי לזהות את ביטוי גנים, לעשות RT-PCR עם פריימרים המופיעים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RT-PCRs עם גן GAPDH כביקורת על יעילות של תגובות ההגברה. לחזות ולנתח מוצר ה-PCR ב -1% אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

תכנות מחדש של תאים סומטיים אדם לhiPSCs מחזיק הבטחות חסרות תקדים בביולוגיה בסיסית, תרופות אישיות, והשתלה 12. בעבר, דורות iPSC אדם הנדרשים וירוס ה-DNA כי יש סיכון אינטגרציה לתוך הגנום המארח, אשר יכול ליצור מוטציות גנטיות לא רצויות המגבילות את יישומים קליניים נוספים כגון טיפולי פיתוח תרופות והשתלה 13. עם מסיבה זו, מחקרים רבים כבר דיווחו לייצר וקטור וiPSCs האנושי המערכת ללא transgene על ידי מספר שיטות אלטרנטיביות, אבל באותו הזמן, את היעילות של בידוד &#39;רגל הדפס...

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת pluripotency העצמי לחדש במבחנה ויש לי, שיכול להיות שעשוי להיות שימושי עבור מודלים מחלה, להקרנת סמים, ולפתח טיפולים מבוססי תאים לטיפול בפציעות מחלות ורקמות. עם זאת, יש לי hESCs הגבלה לטיפול בתחליפי תא בגלל מחסומים חיסוניים, אונקולוגי ואתיים, וללמוד גנים הקשורים למחלות, יכול להיות מבודד hESCs ספציפי למחלה באמצעות אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) מתקרב, אבל זה עדיין מאתגר מבחינה טכנית ותרומות העובר הן די נדירות. סוגיות אלה קשורות להתקדמות בביולוגיה של תאי גזע, מה שהוביל להתפתחותם של תאים מושרה pluripotent גזע (hiPSCs). iPSCs האנושי לתכנות מחדש מבחינה גנטית מתאי סומטיים מבוגר אנושיים ונמל תכונות גזע pluripotent דמוי תא דומה לhESCs, מה שהופך אותם למקור שימושי עבור רפואת רגנרטיבית כגון דגילוי שטיח, דוגמנות מחלה וטיפול בתאים ב1,2 אופן ספציפי למטופל. עד עכשיו, יש כמה 3, מערכת אספקת חלבון 5-7 (מערכת BAC וtransfection וקטורים) שאינו וירוס בתיווך 4 transductions גן, ושיטות ליצירת iPSCs אדם, לרבות בתיווך וירוסים (רטרווירוס וadenovirus). למרות שמשלוח של גנים בתיווך וירוס יכול להבטיח רמה מסוימת של יעילות, וקטורים ויראליים יכולים להשאיר טביעת רגל גנטית, כי הם להשתלב בכרומוזומים מארח לבטא גנים תכנות מחדש באופן בלתי מבוקר. גם כאשר אינטגרציה נגיפית של גורמי שעתוק יכולה להפעיל או להשבית גנים מארח 8, זה יכול לגרום לסטייה גנטית בלתי צפויה ואת הסיכון להיווצרות גידול ב5,9. מצד השני, ההקדמה הישירה של חלבונים או RNA לתאים סומטיים דווחו, אבל יש כמה חסרונות כגון transf עתיר עבודה, חוזר ונשנהection, ורמה הנמוכה של תכנות מחדש של 7,10. וקטורי adenovirus אפילו episomal ולא שילוב, וירוס adeno הקשורים, ופלסמיד עדיין יחסית פחות יעילים 11. מסיבות אלה, סביר לבחור שיטות תכנות מחדש ללא שילוב עם יעילות גבוהה של דור iPSC ומומים גנטיים פחות. במחקר זה, אנו משתמשים בתכנות מחדש המבוסס סנדאי וירוס. שיטה זו ידועה להיות שאינה משתלב בגנום המארח ובעקביות מייצרת iPSCs האנושי ללא אינטגרציות transgene.

<table><tbody><tr><td>ערכת תכנות מחדש של CytoTune-iPS</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6, MEFs, עמיד לניאומיצין, טיפול במיטומיצין C&nbsp;</td><td>גזע גלובלי</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 ס"מ או 12.5 x 105/24 בארות</td></tr><tr><td>צלחת טריפסין EDTA 0.25% טריפסין עם EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 בינוני</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 24 בארות, תחתית שטוחה עם מכסה</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 & #956; M (מלאי: 10 מ"מ)</td></tr> <tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (מלאי: 100 ug)</td></tr> <tr><td>תחליף סרום נוק-אאוט</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), נוזלי (גלוקוז גבוה)</td> <td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין-200 מ"מ (100X), נוזלי</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 11140050 <td>1/100</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול (1,000X), נוזלי</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Hausser שלב ניגודיות Hemacytometers</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% תמיסת ג'לטין</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>אנטי-Tra-1-81</td><td>איתות תאים</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי של עכבר Oct4</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-5279</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>ננוג</td><td>מו"פ D</td><td>AF1997</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 עז נגד עכבר</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2,000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039; s תמיסת מלח עם חומצה פוספט), 1X ללא סידן & מגנזיום</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך QuantiTect</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td> <td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח היקף&nbsp;</td><td>ניקון</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

לפני כמה שנים, הקמת התאים האנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) הובילה עידן חדש ביו. שימושים פוטנציאליים של iPSCs אדם כוללים פתוגנזה מודלים של מחלות גנטיות אנושיות, טיפול בתאים עצמיים לאחר תיקון הגן, והקרנת תרופה מותאמת אישית על ידי מתן מקור של תאים רלוונטיים מטופל ספציפי וסימפטום. עם זאת, ישנם מספר מכשולים להתגבר, כגון ביטול ביטוי transgene גורם תכנות מחדש שנותר לאחר ייצור iPSCs האדם. חשוב מכך, ביטוי transgene שייר בiPSCs אדם שלא עברו התמיינות יכול לעכב בידול נכון ולהטעות את הפרשנות של מחלה רלוונטית בפנוטיפים מבחנה. עם מסיבה זו, ללא אינטגרציה ו / או iPSCs אדם נטול transgene פותחו באמצעות מספר שיטות, כגון אדנווירוס, מערכת piggyBac, וקטור minicircle, וקטורי episomal, אספקת חלבון ישירה ומסונתזת ה-mRNA. עם זאת, יעילות של reprogramming תוך שימוש בשיטות ללא אינטגרציה הוא נמוך למדי ברוב המקרים. כאן, אנו מציגים שיטה לבודד iPSCs אדם באמצעות סנדאי וירוס מערכת מבוססת תכנות מחדש (וירוס RNA). שיטת תכנות מחדש זה מראה תוצאות עקביות ויעילות גבוהה באופן חסכוני.

fibroblasts הנגוע בדרך כלל לא מראה שינויים מורפולוגיים במספר ימים לאחר התמרה וירוס סנדאי, אבל חמישה ימים לאחר מכן, הם מתחילים לקבל צורות שונות (איור 1). כפי שתואר בפנל ימני של איור 1, אין לי תאים פיברובלסטים מורפולוגיה טיפוסית יותר. יש להם צורה עגולה וגדול יותר מגרעין ציטופלסמה. גם כאשר התמרה מתבצעת ב80% confluency הסלולרי, זה נראה כאילו הם פחות מחוברות בהרבה אחרי שהם מתחילים לתכנת מחדש. אם סוגים של שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים לראות ברוב טובים...

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם עם נגיף סנדאי. זה מושג על ידי הכנה וציפוי תאי פיברובלסטים לשינוי. השלב הבא בהליך הוא הדבקת התאים בנגיף סנדאי.לאחר מכן תאי הפיברובלסטים הנגועים מועברים לתאי הזנה פיברובלסטים עובריים טריים של עכברים. השלב האחרון הוא לבחור ידנית את המתוכנת מחדש. כעת ניתן להראות תאי גזע פלוריפוטנטיים, בסופו של דבר תכנות מחדש של תאי פיברובלסטים ל-I PSCs, ללא שימוש בגנים טרנס, באמצעות תיוג חיסוני ו-R-T-P-C-R.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא שהיא משפרת את יעילות התכנות מחדש מבלי להישאר טרנסינג ובאופן חסכוני עבור פרוטוקול זה, יש פיברובלסטים אנושיים מוכנים בתרבית ב-DMEM. עם FBS מעבירים תאים אלה ל-24 לוחות באר עבור צלחת הניסוי התאים בשישה דילולים סדרתיים כדי לקבוע את הצפיפות הטובה ביותר לחיבור תאים. כל שורה של צלחת 24 הבארות יכולה להכיל סדרת דילול אחת של תאים.כך ניתן לבדוק ארבעה סוגי תאים בצלחת אחת, לדגור את הדילול למשך 24 שעות. למחרת בחר בארות בשלוש רמות מפגש להעברה. אחד ברמה גבוהה של 80 עד 90% מפגש, אחד בכ-60% מפגש, והשלישי בכ-30% מפגש שעה או יותר לפני ההתמרה.החלף את המדיה ב-300 מיקרוליטר של מדיה פיברובלסטים טרייה להפשרת ההתמרה. סט אחד של צינורות וירוס סנדאי ב-37 מעלות צלזיוס למשך כמה שניות, ואז לסיים. מפשירים אותם בטמפרטורת החדר.צנטריפוגה את הנגיפים המופשרים ב-6,000 גרם למשך 10 שניות ומאחסנת אותם על קרח בצינור מיקרו צנטריפוגה אחד. הכינו תערובת של הנגיפים המחושבת לפי מספר התאים שיש להמיר. ניתן למצוא את פרטי החישוב בפרוטוקול הטקסט.מערבבים היטב את הנגיפים עם פיפטינג עדין. כעת לתאים הצפופים ביותר, הוסף שני נפחים של נגיף. הוסף נפח אחד של וירוס לתאים בצפיפות בינונית והוסף חצי נפח של וירוס למבחר הפחות צפוף.סובבו את הצלחת ותנו לה לדגור למשך הלילה כדי שהתגובה תתרחש למחרת. החלף את המדיה ב-500 מיקרוליטר של מדיית פיברובלסטים טרייה. עשו זאת שוב יומיים לאחר מכן, שלושה ימים לאחר שינוי המדיה השני שבוצע בתאים המומרים.הכינו תאי מת' בכלים של 60 מילימטר עם DMEM המכיל 10% צלחת FBS 500,000 תאים למנה ודגרו אותם למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיה בתאי המת' במדיה חדשה ואז המשך בהקמת התרבות המשותפת. ראשית, הסר את המדיה מהפיברובלסטים המומרים ושטוף אותם פעם אחת עם DPBS.לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל באר של תאים תוך חמש דקות. אסוף את כל התאים המנותקים לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. סובב את התאים ב -1, 350 גרם למשך ארבע דקות.לאחר מכן הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים הגלולים בכחמישה מיליליטר של מדיום טרי כדי לנטרל את הטריפין. כעת אסוף את התאים עם סיבוב של ארבע דקות נוספות ב -1, 350 גרם.הצלחת הבאה. רוב התאים הם שישה דילולים סדרתיים במת'.ייתכן שלא יהיה צורך בדילולים הראשונים והאחרונים בהתאם לשיעור התמותה של התאים. שמרו חלק מהתאים למיצוי RNA ודגרו על הצלחות למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיום במדיה ES אנושית בתוספת 10 מיקרומולר של מעכב RO קינאז Y 2 7 6 3 2.כדי לשפר את הישרדות התאים במהלך הימים הבאים, שנה את המדיה למדיה ES אנושית רגילה בתוספת unsu. לאחר שבוע של תרבית, התחל לבדוק את הכלים כל כמה ימים להיווצרות מושבת ES כמו גושי תאים. ברגע שהם מופיעים, עקוב אחר הצמיחה.שלושה שבועות לאחר ההעברה, המושבות של גושי תאי ES צריכות להיות מוכנות להתרחבות. הכינו תאי הזנה של מת' ב-24 צלחות באר בדיוק כפי שהוכנו לצלחות של 60 מילימטר. לפני בחירת מושבות כלשהן, שנה את המדיה על תאי המת' למדיה ES עם 10 מיקרוליטר של Y 2 7, 6, 3, 2.בחר מושבה אחת בכל פעם מבין הכלים. העבירו את המושבה לצינור של 15 מיליליטר עם תמיסה. לפרק את המושבה באמצעות הפיטר.ואז תכסה אותי. ובכן עם המושבה המפורקת. בסופו של דבר העמיסו על כל באר מושבה אחת מפורקת והעמיסו כמה שיותר בארות.שמרו על התאים עם שינויי מדיה יומיומיים והרחיבו אותם לשש צלחות באר ולאחר מכן לכלים של 60 מילימטר. בדרך כלל, פיברובלסטים הנגועים בנגיף סנדאי אינם מראים שינויים מורפולוגיים עד לאחר חמישה ימים. ואז התאים מקבלים צורה עגולה עם גרעין גדול יותר וציטופלזמה קטנה יותר.פרוטוקול בקנה מידה קטן זה כולל מספר פרמטרים הניתנים לאופטימיזציה, כגון צפיפות פיברובלסטים, טיטר וירוס וצפיפות ציפוי ל-mes. ניתן גם לייעל התמרה של תאים בשטף שונה המוצג בצבעים שונים. לאחר שבוע של תרבית משותפת עם תאי הזנה של מת', לפיברובלסטים שתוכנתו מחדש חלקית יש צורה דמוית רופפת והם נקטפים בקלות בניגוד לאיסוף באמצעות טריפסין.מתוכנתים מחדש לחלוטין, ניתן לזהות בבירור PSCs מתאים שתוכנתו מחדש חלקית. תאים שתוכנתו מחדש במלואם ארוזים היטב ולמושבות יכולים להיות גבולות ברורים. תאים שתוכנתו מחדש חלקית יוצרים אשכולות רופפים שניתנים לניתוק בקלות.לאחר הרחבת שיבוטי ה-IPSC למשך מספר שבועות, יש צורך בצביעה לסמני תאי גזע בהשוואה לתאי H 9. ה-IPCs חיוביים למספר נוגדנים צפויים, כולל SSEA 4, OCT 4, TRA 81 ו-nano G התומכים באיכותם הפלוריפוטנטית. שימוש בביטוי טרנסגנים R-T-P-C-R לא נצפה בשיבוטי IPSC אנושיים.לאחר 10 פריימרים ל-OCT 4 אקסוגני, נעשה שימוש ב-SOX two, klf four ו-Cmic עם דגימות ביקורת חיוביות שהראו רמות ביטוי טרנסגנים חזקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנת מחדש תאים סומטיים כדי לגרום לתאי הגזע הפולי-פוטנטיים וכיצד לבחור אותם, לתכנת מחדש לחלוטין את התאים מהתאים האחרים.

efficient-generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

שיטה ליצירת אדם המושרה גזע pluripotent תאים (iPSCs) דרך לביטוי רטרווירוס בתיווך חוץ רחמי של OCT4, Sox2, KLF4 ו myc מתואר. באופן מעשי לזיהוי מושבות iPSC אדם המבוססים על ביטוי של GFP נדון גם.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתוכנתים מחדש ומאופיינים ללא גורמים והמרה למצבים קליניים משוערים.

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מתאי T היקפיים אנושיים בתנאים נטולי הזנה באמצעות שילוב של וקטורים של וירוס מטריג'ל וסנדאי המכילים גורמי תכנות מחדש.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

מטרת פרוטוקול זה היא להראות את הפרוטוקול לתכנות מחדש של לימפוציטים חודרים לגידול מלנומה לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

אנו מציעים פרוטוקול לתכנות מחדש של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). על ידי ציפוי תאי הדם המומרים על צלחות מצופות מטריצה עם צנטריפוגה, iPSCs מושרים בהצלחה מתאים צפים. טכניקה זו מציעה פרוטוקול תכנות מחדש פשוט ויעיל עבור תאים כגון PBMCs ו-CBMCs.

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לייצור יעיל של iPSCs ללא אינטגרציה מתאי דם היקפיים אנושיים בוגרים. עם שימוש בארבעה וקטורים אפיזומליים מבוססי oriP/EBNA כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש, KLF4, MYC, BCL-XL, או OCT4 ו-SOX2, ניתן להשיג אלפי מושבות iPSC מ-1 מ"ל של דם היקפי.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

למד שיטה יעילה ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מדם אנושי באמצעות וירוס סנדאי ללא טרנסגנים. הטכניקה משפרת את יעילות ההשבה ומאפשרת יישומים בטוחים ברפואה רגנרטיבית.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

גלה סרטונים נוספים