תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס
23 באפריל 2014
כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם עם נגיף סנדאי. זה מושג על ידי הכנה וציפוי תאי פיברובלסטים לשינוי. השלב הבא בהליך הוא הדבקת התאים בנגיף סנדאי.
לאחר מכן תאי הפיברובלסטים הנגועים מועברים לתאי הזנה פיברובלסטים עובריים טריים של עכברים. השלב האחרון הוא לבחור ידנית את המתוכנת מחדש. כעת ניתן להראות תאי גזע פלוריפוטנטיים, בסופו של דבר תכנות מחדש של תאי פיברובלסטים ל-I PSCs, ללא שימוש בגנים טרנס, באמצעות תיוג חיסוני ו-R-T-P-C-R.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא שהיא משפרת את יעילות התכנות מחדש מבלי להישאר טרנסינג ובאופן חסכוני עבור פרוטוקול זה, יש פיברובלסטים אנושיים מוכנים בתרבית ב-DMEM. עם FBS מעבירים תאים אלה ל-24 לוחות באר עבור צלחת הניסוי התאים בשישה דילולים סדרתיים כדי לקבוע את הצפיפות הטובה ביותר לחיבור תאים. כל שורה של צלחת 24 הבארות יכולה להכיל סדרת דילול אחת של תאים.
כך ניתן לבדוק ארבעה סוגי תאים בצלחת אחת, לדגור את הדילול למשך 24 שעות. למחרת בחר בארות בשלוש רמות מפגש להעברה. אחד ברמה גבוהה של 80 עד 90% מפגש, אחד בכ-60% מפגש, והשלישי בכ-30% מפגש שעה או יותר לפני ההתמרה.
החלף את המדיה ב-300 מיקרוליטר של מדיה פיברובלסטים טרייה להפשרת ההתמרה. סט אחד של צינורות וירוס סנדאי ב-37 מעלות צלזיוס למשך כמה שניות, ואז לסיים. מפשירים אותם בטמפרטורת החדר.
צנטריפוגה את הנגיפים המופשרים ב-6,000 גרם למשך 10 שניות ומאחסנת אותם על קרח בצינור מיקרו צנטריפוגה אחד. הכינו תערובת של הנגיפים המחושבת לפי מספר התאים שיש להמיר. ניתן למצוא את פרטי החישוב בפרוטוקול הטקסט.
מערבבים היטב את הנגיפים עם פיפטינג עדין. כעת לתאים הצפופים ביותר, הוסף שני נפחים של נגיף. הוסף נפח אחד של וירוס לתאים בצפיפות בינונית והוסף חצי נפח של וירוס למבחר הפחות צפוף.
סובבו את הצלחת ותנו לה לדגור למשך הלילה כדי שהתגובה תתרחש למחרת. החלף את המדיה ב-500 מיקרוליטר של מדיית פיברובלסטים טרייה. עשו זאת שוב יומיים לאחר מכן, שלושה ימים לאחר שינוי המדיה השני שבוצע בתאים המומרים.
הכינו תאי מת' בכלים של 60 מילימטר עם DMEM המכיל 10% צלחת FBS 500,000 תאים למנה ודגרו אותם למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיה בתאי המת' במדיה חדשה ואז המשך בהקמת התרבות המשותפת. ראשית, הסר את המדיה מהפיברובלסטים המומרים ושטוף אותם פעם אחת עם DPBS.
לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל באר של תאים תוך חמש דקות. אסוף את כל התאים המנותקים לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. סובב את התאים ב -1, 350 גרם למשך ארבע דקות.
לאחר מכן הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים הגלולים בכחמישה מיליליטר של מדיום טרי כדי לנטרל את הטריפין. כעת אסוף את התאים עם סיבוב של ארבע דקות נוספות ב -1, 350 גרם.הצלחת הבאה. רוב התאים הם שישה דילולים סדרתיים במת'.
ייתכן שלא יהיה צורך בדילולים הראשונים והאחרונים בהתאם לשיעור התמותה של התאים. שמרו חלק מהתאים למיצוי RNA ודגרו על הצלחות למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיום במדיה ES אנושית בתוספת 10 מיקרומולר של מעכב RO קינאז Y 2 7 6 3 2.
כדי לשפר את הישרדות התאים במהלך הימים הבאים, שנה את המדיה למדיה ES אנושית רגילה בתוספת unsu. לאחר שבוע של תרבית, התחל לבדוק את הכלים כל כמה ימים להיווצרות מושבת ES כמו גושי תאים. ברגע שהם מופיעים, עקוב אחר הצמיחה.
שלושה שבועות לאחר ההעברה, המושבות של גושי תאי ES צריכות להיות מוכנות להתרחבות. הכינו תאי הזנה של מת' ב-24 צלחות באר בדיוק כפי שהוכנו לצלחות של 60 מילימטר. לפני בחירת מושבות כלשהן, שנה את המדיה על תאי המת' למדיה ES עם 10 מיקרוליטר של Y 2 7, 6, 3, 2.
בחר מושבה אחת בכל פעם מבין הכלים. העבירו את המושבה לצינור של 15 מיליליטר עם תמיסה. לפרק את המושבה באמצעות הפיטר.
ואז תכסה אותי. ובכן עם המושבה המפורקת. בסופו של דבר העמיסו על כל באר מושבה אחת מפורקת והעמיסו כמה שיותר בארות.
שמרו על התאים עם שינויי מדיה יומיומיים והרחיבו אותם לשש צלחות באר ולאחר מכן לכלים של 60 מילימטר. בדרך כלל, פיברובלסטים הנגועים בנגיף סנדאי אינם מראים שינויים מורפולוגיים עד לאחר חמישה ימים. ואז התאים מקבלים צורה עגולה עם גרעין גדול יותר וציטופלזמה קטנה יותר.
פרוטוקול בקנה מידה קטן זה כולל מספר פרמטרים הניתנים לאופטימיזציה, כגון צפיפות פיברובלסטים, טיטר וירוס וצפיפות ציפוי ל-mes. ניתן גם לייעל התמרה של תאים בשטף שונה המוצג בצבעים שונים. לאחר שבוע של תרבית משותפת עם תאי הזנה של מת', לפיברובלסטים שתוכנתו מחדש חלקית יש צורה דמוית רופפת והם נקטפים בקלות בניגוד לאיסוף באמצעות טריפסין.
מתוכנתים מחדש לחלוטין, ניתן לזהות בבירור PSCs מתאים שתוכנתו מחדש חלקית. תאים שתוכנתו מחדש במלואם ארוזים היטב ולמושבות יכולים להיות גבולות ברורים. תאים שתוכנתו מחדש חלקית יוצרים אשכולות רופפים שניתנים לניתוק בקלות.
לאחר הרחבת שיבוטי ה-IPSC למשך מספר שבועות, יש צורך בצביעה לסמני תאי גזע בהשוואה לתאי H 9. ה-IPCs חיוביים למספר נוגדנים צפויים, כולל SSEA 4, OCT 4, TRA 81 ו-nano G התומכים באיכותם הפלוריפוטנטית. שימוש בביטוי טרנסגנים R-T-P-C-R לא נצפה בשיבוטי IPSC אנושיים.
לאחר 10 פריימרים ל-OCT 4 אקסוגני, נעשה שימוש ב-SOX two, klf four ו-Cmic עם דגימות ביקורת חיוביות שהראו רמות ביטוי טרנסגנים חזקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנת מחדש תאים סומטיים כדי לגרום לתאי הגזע הפולי-פוטנטיים וכיצד לבחור אותם, לתכנת מחדש לחלוטין את התאים מהתאים האחרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לתכנות מחדש של תאים סומטיים אנושיים לתאי גזע פלוריטנטיים אינדוקים אנושיים (iPSCs) ללא טרנסגן באמצעות וירוס סנדאי. ההליך מדגים תוצאות עקביות ויעילות משופרת ביצירת iPSCs.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- תכנות מחדש של תאים
- וירולוגיה
רקע
- תאי גזע פלוריטנטיים אינדוקים (iPSCs) הם בעלי ערך לרפואה רגנרטיבית.
- שיטות מסורתיות כרוכות לעתים קרובות בשימוש בטרנסגנים, אשר יכולים להציב חששות בטיחותיים.
- וירוס סנדאי הוא וקטור שאינו משתלב המאפשר תכנות מחדש בטוח יותר.
- שיטה זו שואפת לשפר את היעילות של יצירת iPSCs מתאים סומטיים.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה אמינה ליצירת iPSCs ללא טרנסגנים.
- לשפר את היעילות של תהליך התכנות מחדש.
- לספק פרוטוקול שניתן לשכפל בקלות במסגרות מחקר.
שיטות ששימשו
- הכנה והצמדה של תאי פיברובלסט.
- טרנסדוקציה של תאי פיברובלסט באמצעות וירוס סנדאי.
- העברת תאים נגועים לתאי פידר עוברי עכבר פיברובלסט.
- בחירה ידנית של תאים שתוכנתו מחדש שאושרה באמצעות תיוג אימונולוגי ו-RT-PCR.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של iPSCs ללא טרנסגן מתאי פיברובלסט.
- הדגמת תוצאות תכנות מחדש עקביות ברחבי מספר ניסויים.
- יעילות משופרת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- אימות פלוריטנטיות באמצעות מבחנים מבוססים.
מסקנות
- שיטת וירוס סנדאי היא גישה בטוחה ויעילה ליצירת iPSCs.
- טכניקה זו יכולה להקל על מחקר נוסף ברפואה רגנרטיבית.
- מחקרים עתידיים עשויים לחקור את היישום של iPSCs אלו בהקשרים טיפוליים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Efficient generation of transgene-free human iPSCs using Sendai virus addresses a critical bottleneck in early discovery and disease modeling pipelines. This method enhances predictive confidence by eliminating residual transgene expression, supporting more reliable downstream differentiation and phenotypic screening. Its reproducibility and scalability position it as a foundational capability for translational research and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust generation of patient-specific iPSCs for hypothesis-driven disease modeling.
- Reduces mechanistic ambiguity by removing confounding transgene effects in functional assays.
- Supports target validation through reproducible reprogramming and marker-based confirmation.
- Facilitates portfolio triage by providing high-quality, integration-free cellular models.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, transgene-free iPSC lines for assay development and compound screening.
- Improves assay reproducibility by minimizing genetic and epigenetic artifacts.
- Enables quantitative readouts via immunolabeling and RT-PCR for pluripotency markers.
- Supports scalable workflows for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining genomic integrity.
- Reduces risk of misinterpreting disease phenotypes due to residual transgene expression.
- Aligns with requirements for preclinical model standardization and reproducibility.
Pipeline & Workflow Integration
This Sendai virus-based reprogramming method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by generating high-fidelity iPSC models.
- Screening: Provides reproducible, transgene-free cell lines for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of pluripotency via immunolabeling and RT-PCR outputs.
- Translational Research: Maintains disease relevance and biomarker alignment for downstream studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for generating iPSCs across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in disease modeling.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of iPSC generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling reliable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, viral transduction, and stem cell characterization.
- Needs access to Sendai virus reagents, feeder cell infrastructure, and molecular analysis tools.
- Demands cross-team standardization of cell density, virus titer, and marker validation protocols.
- Adaptable to various human somatic cell sources with optimization of key parameters.
- Dependent on rigorous immunolabeling and RT-PCR to confirm transgene-free status and pluripotency.
