תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם עם נגיף סנדאי. זה מושג על ידי הכנה וציפוי תאי פיברובלסטים לשינוי. השלב הבא בהליך הוא הדבקת התאים בנגיף סנדאי.

לאחר מכן תאי הפיברובלסטים הנגועים מועברים לתאי הזנה פיברובלסטים עובריים טריים של עכברים. השלב האחרון הוא לבחור ידנית את המתוכנת מחדש. כעת ניתן להראות תאי גזע פלוריפוטנטיים, בסופו של דבר תכנות מחדש של תאי פיברובלסטים ל-I PSCs, ללא שימוש בגנים טרנס, באמצעות תיוג חיסוני ו-R-T-P-C-R.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא שהיא משפרת את יעילות התכנות מחדש מבלי להישאר טרנסינג ובאופן חסכוני עבור פרוטוקול זה, יש פיברובלסטים אנושיים מוכנים בתרבית ב-DMEM. עם FBS מעבירים תאים אלה ל-24 לוחות באר עבור צלחת הניסוי התאים בשישה דילולים סדרתיים כדי לקבוע את הצפיפות הטובה ביותר לחיבור תאים. כל שורה של צלחת 24 הבארות יכולה להכיל סדרת דילול אחת של תאים.

כך ניתן לבדוק ארבעה סוגי תאים בצלחת אחת, לדגור את הדילול למשך 24 שעות. למחרת בחר בארות בשלוש רמות מפגש להעברה. אחד ברמה גבוהה של 80 עד 90% מפגש, אחד בכ-60% מפגש, והשלישי בכ-30% מפגש שעה או יותר לפני ההתמרה.

החלף את המדיה ב-300 מיקרוליטר של מדיה פיברובלסטים טרייה להפשרת ההתמרה. סט אחד של צינורות וירוס סנדאי ב-37 מעלות צלזיוס למשך כמה שניות, ואז לסיים. מפשירים אותם בטמפרטורת החדר.

צנטריפוגה את הנגיפים המופשרים ב-6,000 גרם למשך 10 שניות ומאחסנת אותם על קרח בצינור מיקרו צנטריפוגה אחד. הכינו תערובת של הנגיפים המחושבת לפי מספר התאים שיש להמיר. ניתן למצוא את פרטי החישוב בפרוטוקול הטקסט.

מערבבים היטב את הנגיפים עם פיפטינג עדין. כעת לתאים הצפופים ביותר, הוסף שני נפחים של נגיף. הוסף נפח אחד של וירוס לתאים בצפיפות בינונית והוסף חצי נפח של וירוס למבחר הפחות צפוף.

סובבו את הצלחת ותנו לה לדגור למשך הלילה כדי שהתגובה תתרחש למחרת. החלף את המדיה ב-500 מיקרוליטר של מדיית פיברובלסטים טרייה. עשו זאת שוב יומיים לאחר מכן, שלושה ימים לאחר שינוי המדיה השני שבוצע בתאים המומרים.

הכינו תאי מת' בכלים של 60 מילימטר עם DMEM המכיל 10% צלחת FBS 500,000 תאים למנה ודגרו אותם למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיה בתאי המת' במדיה חדשה ואז המשך בהקמת התרבות המשותפת. ראשית, הסר את המדיה מהפיברובלסטים המומרים ושטוף אותם פעם אחת עם DPBS.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל באר של תאים תוך חמש דקות. אסוף את כל התאים המנותקים לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. סובב את התאים ב -1, 350 גרם למשך ארבע דקות.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים הגלולים בכחמישה מיליליטר של מדיום טרי כדי לנטרל את הטריפין. כעת אסוף את התאים עם סיבוב של ארבע דקות נוספות ב -1, 350 גרם.הצלחת הבאה. רוב התאים הם שישה דילולים סדרתיים במת'.

ייתכן שלא יהיה צורך בדילולים הראשונים והאחרונים בהתאם לשיעור התמותה של התאים. שמרו חלק מהתאים למיצוי RNA ודגרו על הצלחות למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיום במדיה ES אנושית בתוספת 10 מיקרומולר של מעכב RO קינאז Y 2 7 6 3 2.

כדי לשפר את הישרדות התאים במהלך הימים הבאים, שנה את המדיה למדיה ES אנושית רגילה בתוספת unsu. לאחר שבוע של תרבית, התחל לבדוק את הכלים כל כמה ימים להיווצרות מושבת ES כמו גושי תאים. ברגע שהם מופיעים, עקוב אחר הצמיחה.

שלושה שבועות לאחר ההעברה, המושבות של גושי תאי ES צריכות להיות מוכנות להתרחבות. הכינו תאי הזנה של מת' ב-24 צלחות באר בדיוק כפי שהוכנו לצלחות של 60 מילימטר. לפני בחירת מושבות כלשהן, שנה את המדיה על תאי המת' למדיה ES עם 10 מיקרוליטר של Y 2 7, 6, 3, 2.

בחר מושבה אחת בכל פעם מבין הכלים. העבירו את המושבה לצינור של 15 מיליליטר עם תמיסה. לפרק את המושבה באמצעות הפיטר.

ואז תכסה אותי. ובכן עם המושבה המפורקת. בסופו של דבר העמיסו על כל באר מושבה אחת מפורקת והעמיסו כמה שיותר בארות.

שמרו על התאים עם שינויי מדיה יומיומיים והרחיבו אותם לשש צלחות באר ולאחר מכן לכלים של 60 מילימטר. בדרך כלל, פיברובלסטים הנגועים בנגיף סנדאי אינם מראים שינויים מורפולוגיים עד לאחר חמישה ימים. ואז התאים מקבלים צורה עגולה עם גרעין גדול יותר וציטופלזמה קטנה יותר.

פרוטוקול בקנה מידה קטן זה כולל מספר פרמטרים הניתנים לאופטימיזציה, כגון צפיפות פיברובלסטים, טיטר וירוס וצפיפות ציפוי ל-mes. ניתן גם לייעל התמרה של תאים בשטף שונה המוצג בצבעים שונים. לאחר שבוע של תרבית משותפת עם תאי הזנה של מת', לפיברובלסטים שתוכנתו מחדש חלקית יש צורה דמוית רופפת והם נקטפים בקלות בניגוד לאיסוף באמצעות טריפסין.

מתוכנתים מחדש לחלוטין, ניתן לזהות בבירור PSCs מתאים שתוכנתו מחדש חלקית. תאים שתוכנתו מחדש במלואם ארוזים היטב ולמושבות יכולים להיות גבולות ברורים. תאים שתוכנתו מחדש חלקית יוצרים אשכולות רופפים שניתנים לניתוק בקלות.

לאחר הרחבת שיבוטי ה-IPSC למשך מספר שבועות, יש צורך בצביעה לסמני תאי גזע בהשוואה לתאי H 9. ה-IPCs חיוביים למספר נוגדנים צפויים, כולל SSEA 4, OCT 4, TRA 81 ו-nano G התומכים באיכותם הפלוריפוטנטית. שימוש בביטוי טרנסגנים R-T-P-C-R לא נצפה בשיבוטי IPSC אנושיים.

לאחר 10 פריימרים ל-OCT 4 אקסוגני, נעשה שימוש ב-SOX two, klf four ו-Cmic עם דגימות ביקורת חיוביות שהראו רמות ביטוי טרנסגנים חזקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנת מחדש תאים סומטיים כדי לגרום לתאי הגזע הפולי-פוטנטיים וכיצד לבחור אותם, לתכנת מחדש לחלוטין את התאים מהתאים האחרים.