Patterned Photostimulation עם התקנים דיגיטליים Micromirror לחקור שילוב דנדריטים מעבר סניף נקודות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלוט בדפוסי אור מורכבים בזמן ובמרחב, כך שניתן יהיה להשתמש בו כדי לעורר נוירונים. זה מושג על ידי מיקום ראשון של שבב DMD במישור תמונה מצומד מתאים בנתיב האופטי של המיקרוסקופ. השלב השני של ההליך הוא להאיר כראוי את הדושן עם מקור אור עז כמו לייזר.

השלב השלישי של ההליך הוא ביטול אפקט הכתמים של תאורה קוהרנטית. השלב האחרון של ההליך הוא שילוב ממשק משתמש גרפי למניפולציה של שבב DMD. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כי ניסויים שבעבר היו קשים לביצוע יכולים כעת להסתיים בקלות יחסית באמצעות ליזה מרובת אתרים של נוירוטרנסמיטר כלוב המשתמש במערכת הדושן.

היי, אני מייקל מוחמד והמעבדה של ד"ר צ'מאן טאנג במחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת מרילנד. היום נראה לכם נוהל ליצירת דפוסי חיסול מורכבים במיקרוסקופ אופטי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור אינטגרציה דנדריטית.

אז בואו נתחיל. פרוטוקול זה ידגים את פעולתו של מכשיר מיקרו מראה דיגיטלי או מערכת תאורה DMD למדעי המוח הניסויים. DMD הוא שבב מוליכים למחצה אופטי עם כמה מאות אלפי מראות ניידות מיקרוסקופיות המסודרות במערך מלבני על פני השטח שלו, המיקום של כל מראה תואם את הפיקסל של תמונה.

ניתן לשלוט בכל מראה בנפרד כדי להטות בין שני כיוונים. בכיוון כבוי, האור מופנה הרחק מהציר האופטי של תאורת הדגימה. בכיוון מופעל, האור מופנה לאורך הציר האופטי.

DMD מתאים היטב לליזה מכיוון שהוא סובל אור UV חזק מאוד, מייצר יחסי ניגודיות גבוהים בין הפיקסלים להפעלה וכיבוי ויכול לעבור בין שני המצבים בעשרות מיקרו-שניות. היישום של דושן למחקר ביו-רפואי נעזר בשימוש נרחב בתוכנה ובחומרה למניפולציה של תמונות, ובעניין מסחרי בתחום תצוגת התמונה. רכיבים מודולריים משווקים על ידי Texas Instruments כערכות גילוי DLP המספקות את הדרייברים האלקטרוניים התומכים להתאמת ה-DMD למערכת מיקרוסקופית.

יש להבין מושגים בסיסיים לגבי האופטיקה של המיקרוסקופיה. המיקרוסקופ הפלואורסצנטי המודרני הבסיסי מורכב מנתיב הדמיה ונתיב תאורה. הוא מורכב ממטרה, קוביית פילטר ושתי עדשות צינור נפרדות לנתיב ההדמיה והתאורה.

המיקרוסקופ מתוכנן להיות בעל מיקומים מצומדים למישור תמונת הדגימה, כאשר אובייקטים בפוקוס במישור הדגימה יופיעו גם במישורי התמונה המצומדים הללו. המסקנה של תפיסה זו היא שכל תמונה בהירה שנוצרת במישור התמונה המצומד תוקרן בחדות גם על מישור התמונה של הדגימה. אסטרטגיה זו משמשת להקרנת דפוס תאורה שנוצר על ידי מחשב על הדגימה.

קרן הלייזר משמשת כמקור אור בהיר מאוד שיאיר את התבנית המיושמת על ידי מראות המיקרו על שבבי DMD הממוקמים במישור תמונה מצומד. התכנון של מערכת תאורה DMD תלוי באורות העירור המשמשים לניסויים אופטוגנטיים, המשתמשים באור באורך הגל הנראה. ניתן להביא את הדפוס המואר דרך נתיב המצלמה.

לכן, ניתן פשוט להרכיב את שבב ה-DMD על אחת משתי יציאות מצלמה של מודול יציאת מצלמה כפולה. לעומת זאת, עבור ניסויים המשתמשים באור בתחום ה-UV, כגון ליזה של תרכובות כלוב, יש להביא את האור דרך נתיב התאורה של האפי וליצור מישור תמונה מצומד נגיש יותר. הסיבה לכך היא שעדשת צינור ההדמיה אינה מיועדת להעברת UV.

במקום זאת, עדשת צינור התאורה משמשת להעברת UV ומבצעת עבודה נאותה ביצירת תמונה. כל מיקרו מראה ב-DMD יכולה לעבור בין הטיה חיובית לשלילית של 12 מעלות ביחס למישור השבב. בהתאם לקלט הדיגיטלי שהוא מקבל מהמחשב, ציר הסיבוב נמצא לאורך הפינות האלכסוניות של כל מראה, 45 מעלות לצדדים המלבניים של השבב.

כיוון הטיית המראה מסומן על ידי משולש בצבע זהב בפינה אחת על המשטח הקדמי של השבב. הטיית המראה המיקרו מכתיבה את יישור הגובה והאזימוט של אלומת התאורה הנכנסת. כדי להאיר את ה-DMD, הגדר תחילה את גובה אלומת התאורה כך שיהיה 24 מעלות מהציר הניצב של שבב ה-DMD והגדר את האזימוט כך שיהיה מאונך לציר סיבוב המראה.

יישור אלומה מדויק הוא קריטי לפעולה יעילה. לניסויי ליזה. השתמש במקור לייזר כדי ליצור את הקרן הניתנת למיקוד בעוצמה גבוהה הנחוצה לפירוק מהיר.

כאן נעשה שימוש בלייזר ND משולש בתדר מצב מוצק משולש דיודה רציפה, השתמש בלייזר בעל הספק גבוה יחסית מכיוון שרק חלק קטן מתפוקת הלייזר מועבר למעשה לדגימה. בעת שימוש במערכת DMD, הפעל את פלט הלייזר לסיב רב-מצבי כך שניתן יהיה למקם אותו בקלות ולכוון אותו לאורך הציר הנכון להארת ה-DMD כדי לספק פתרון לכתם. בעיה הנוצרת מתאורה קוהרנטית מעבירה את האור דרך הסיב האופטי.

הסיב מלופף סביב אלונקה של סיבים חשמליים של פאזו המונעת כדי להניע אותו סביב 40 קילו-הרץ. המתיחה המיקרוסקופית של הסיב מספיקה כדי להזיז את דפוס הכתמים פעמים רבות במהלך אלפית השנייה של כל פולס גירוי צילום, ובכך למעשה לבטל את הכתמים. לבסוף, הפלט של הסיב האופטי נאסף עם מיקרוסקופ UV שמטרתו להאיר את ה-DMDs כדי לרשום את פיקסל ה-CCD עם תוכנת התמונה DMD המתאמת מראות DMD בודדות לפיקסלים ספציפיים של מצלמת ה-CCD ההדמיה נכתבה.

ממשק המשתמש הגרפי בתוך התוכנה מאפשר למשתמש להקצות את כיוון מראה ה-DMD המתאים לאזור בתמונת ה-CCD עם עכבר המחשב באמצעות ממשק המשתמש הגרפי. תייג את המיקום לגירוי תמונות על ידי הזזת הסמן מעל התמונה המוצגת על מסך המחשב ולחץ על אזור העניין המתויג כדי לתכנת את חנות דפוסי אספקת האור. התבנית המסומנת על מסך המחשב כסדרה של תמונות נפרדות מתכנתת את תזמון פעימות הלייזר עבור כל תבנית מרחבית לתוכנה.

זה ישתלב עם תוכנית רכישת הנתונים P clamp. לבסוף, השתמש בתוכנית רכישת הנתונים כדי לתאם את התזמון של האלקטרוניקה של DMD, שער הלייזר ורכישת האות החשמלי המהודק מהתיקון מנוירון המטרה. כאן מוצג כיול של רזולוציית המערכת האופטית.

גודל הנקודה המינימלי מוצג כפי שנמדד ממטרה פלואורסצנטית. הרזולוציה הפיזיולוגית האפקטיבית נמדדת על ידי משרעת זרימת הזרם כפונקציה של גירוי צילום. מיקום נקודתי כאן, גלוטמט בכלוב צולם בסמוך לענף דנדריטי בקוטר שני מיקרומטר.

כשהמקום הוזז. באופן אורתוגונלי על פני ה-dite מודגמות תגובות חשמליות לגירוי פוטו בעוצמות שונות. מוצגות תגובות מהודקות מתח כפונקציה של עוצמת הליזיס.

גירוי דנדריטי מבוזר ניתן ליישום בקלות באמצעות מערכת מבוססת DMD. כאן, עוצמת הקלט השתנתה על ידי הגדלת מספר הכתמים של גירוי תמונות המסומנות כעיגולים על שני הענפים הדנדריטים. סיכום מרחבי יכול להיות לא ליניארי על פני נקודות הסתעפות.

זה הופך יותר ויותר סופר ליניארי עם אמפליטודות קלט הולכות וגדלות המגיעות לשתי הדלתות לענפים. תוצאות אלה ממחישות בבירור את אופן הסיכום הלא ליניארי על פני נקודות הסתעפות דנדריטיות. הסופר-ליניאריות מתווכת במידה רבה על ידי קולטני NMDA ולא על ידי תעלות מגודרות מתח.

ניתן להדגים זאת כאשר יישום של שני אנטגוניסטים של NMDA A PV ו-MK 8 0 1 מבטל במידה רבה את ההתנהגות הלא ליניארית. זה עתה הראינו לכם את התכנון והתפעול הבסיסיים של מערכת מבוססת DMD לגירוי תמונות דפוס של רקמה עצבית. ניתן להתאים את המערכת לגירוי עם אור נראה, כמו למשל לניסויים אופטוגנטיים.

זה יכול להיות גם אדפטיבי עבור נורות UV קרובות כפי שמשמש לליזה של פוטון בודד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שאם יש להשתמש באור באורך גל של פחות מ-400 ננומטר ורוב האנשים יוצאים דרך נתיב התאורה של ה-epi, היישור המדויק של האלומה המאירה בתוך כמה מעלות הוא קריטי, ושאם נעשה שימוש באור קוהרנטי, יש לבטל ביעילות את הכתמים. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.