Name: שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: חקור את השפעת נוקשות המטריקס החוץ-תאי על התנהגות תאים באמצעות הידרוג'לי אקרילאמיד. השיטה כוללת יצירת הידרוג'לים עם רמות נוקשות שונות וניתוח באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ו-PCR כמותי בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה היא במעבדה שלנו נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות.

הכנה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips צריך להיות autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים או deionized ועיקור יש להשתמש כדי להכין פתרונות עבור coverslips כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AC (40% w / v) bis-AC (1% w / v) פתרונות עיקור על ידי סינון 0.2 מיקרומטר. הכן persulfate אמוניום 10% (APS; מים 100μg/ml) זמן קצר לפני השימוש לסנן סטרילית. החלף את הפתרון APS חודשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים כימיים כגון 3-APTMS, כלורופורם, glutaradehyde, NHS, ו SurfaSil שלא ניתן autoclaved נשמרים בקבוק מוקצה ורק לצורך הכנת הידרוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הידרוג צריך להיות מנוצל בתוך כמה ימים לאחר הדגרה למשך הלילה עם החלבון ECM המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון SurfaSil 10% כלורופורם (10 מ"ל בדרך כלל מספיק עבור 20 coverslips למעלה) בתוך שפופרת 50 מ"ל פלקון פוליפרופילן לפני שוטף של הידרוג'ל. (המעבדה שלנו בדרך כלל siliconizes coverslips העליון במהלך הצעד 0.5% הדגירה glutaraldehyde). מוסיפים את coverslips אל הצינור פלקון ורוק דקות לפחות 10. למזוג את הפתרון SurfaSil ואוויר יבש coverslips על Kimwipes בממשלה בטיחות ביולוגית שבו הידרוג יהיה מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון חום מומת BSA כדלקמן: 20 מ"ג / מ"ל ​​פתרון של BSA שומן חומצה חופשית PBS היא מודגרות בתוך אמבט המים 68 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אז הפתרון הוא סינון סטרילי מאוחסנים 4 ° C. </li></ul> נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שכבה של Parafilm על החצי התחתון של צלחת פטרי 150 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עד 9 25 מ"מ coverslips על גבי Parafilm ו לכסות אותם עם 1 מ"ל 0.1 M NaOH. דגירה של 3 דקות ואז לשאוב עם קו ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במנדף כימי, במקום 0.5 מ"ל 3-APTMS על כל coverslip. דגירה של 3 דקות ואז לשאוב APTMS. אם אתה ממתין זמן רב מדי, קצף יהוו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את coverslips פעם עם מים 20 מ"ל deionized בצלחת אחת. הסר את coverslips מצלחת באמצעות מלקחיים מעוקל ולהעביר אותם, עם טיפול בצד שלהם פונה כלפי מעלה, אל צלחת 150 מ"מ חדשה. שטפו את coverslips עם מים deionized שלוש פעמים, על כיסא הנדנדה, כל 10 דקות לשטוף. אם לא תצליח להסיר את כל APTMS, הוא יגיב עם glutaraldehyde בשלב הבא ולהשאיר משקע עכור לבן (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה glutaraldehyde (~ 10 דקות לפני השימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים מעוקל, העברת coverslips לצלחת נקייה שכבתית עם Parafilm ואת לשאוב כל נוזל הנותרים. השתמש בקו ואקום או Kimwipe למחוק את המים הנותרים לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל coverslip לחלוטין עם 0.5 מ"ל של glutaraldehyde 0.5% במים deionized סטרילית דגירה למשך 30 דקות במנדף כימי. לשאוב glutaraldehyde. לשטוף לשטוף את coverslips כמו בשלב 4. יבש coverslips לחלוטין. [אתה יכול לעצור כאן ולהשאיר את coverslips למשך מספר שבועות באזור יבש]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן להכין את הידרוג, להשתמש במלקחיים מעוקל להעביר את coverslips, למעלה בצד תגובתי, לגיליון של Parafilm כי כבר מודבק על פני השטח של הקבינט בטיחות ביולוגית. ודא כי coverslips הן שטוחות על פני השטח Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון רווי NHS ב טולואן. (להמיס כמות קטנה של NHS ב טולואן מספיק לצורך הניסוי בפרט. המשך להוסיף קצת NHS טיפין עד NHS כבר לא נמס. הפתרון רווי הוא בדרך כלל מעונן וורוד.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להכין את, acrylamide bis-acrylamide, מים APS להגיע אחוז acrylamide הרצוי. מוסיפים את ריאגנטים צינורות microcentrifuge הרשום להלן כדי בהיקף כולל של 0.8ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, אחד aliquot בכל פעם, מוסיפים את שירותי הבריאות ואת TEMED את פתרון ה-AC 0.8 מ"ל, מערבולת בקצרה מיד לשפוך 3-5 ג'לים באמצעות 140 μl לכל coverslip במנדף בטיחות ביולוגי. במידת האפשר, את כל הצעדים מנקודה זו צריכה להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. [הערה: coverslips בגדלים שונים יכול להיות מנוצל על בסיס צורך. אם 18 מ"מ coverslips משמשים, השתמש ~ 33 μl פתרון לכל coverslip AC ו coverslip 18 מ"מ siliconized העליון.] <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Bis-AC (%) </td></tr><tr><td></td><td> 0.3 (נוקשה) </td><td> 0.15 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 (רך) </td></tr><tr><td></td><td> μl </td><td> μl </td><td> μl </td><td> μl </td></tr><tr><td> מים </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED</td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום coverslip siliconized 25 מ"מ על גבי ג'ל אחד לפני שהוא מתחיל לפלמר. הוספת coverslip העליון צריך לאפשר AC כדי מכסות לחלוטין את coverslip התחתונה. דגירה זה "כריך" בטמפרטורת החדר עד AC polymerizes. (בדוק את הפתרון שיורית AC בצינור microcentrifuge כדי לקבוע מתי אירעה פילמור. בדרך כלל מספר דקות ג'ל נוקשה קצת יותר עבור אלה רך יספיק.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את הכריך (כפפות סטריליות על!) והחלק את coverslip העליון עד הסככות ג'ל polymerized. לאחר מכן תוכל לחלץ אותו הג'ל. אם אתה ממתין זמן רב מדי לפני הסרת coverslip העליון, ג'ל יהיה לקרוע את coverslip מוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל coverslip העליון. מניחים את תחתית ג'ל coverslips (להלן שנקרא הידרוג'ל) לתוך 6-גם צלחות עם 2 מ"ל PBS / היטב. PBS ניתן להוסיף לפני או אחרי coverslip ג'ל אל היטב כל אחד. שטפו את הידרוג עם PBS שלוש פעמים, על כיסא נדנדה, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 11-14 עד המספר הנדרש של הידרוג הוכנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל הידרוג'ל עם 2 מ"ל של פתרון פיברונקטין (3 מיקרוגרם / מ"ל PBS) או חלבון ECM אחרים (ראו קליין, et al. 13 לקבלת פרטים.). החלבון ECM הופך מחויב קוולנטית אל הידרוג במהלך הדגירה לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון ECM ו-NHS לחסום unreacted עם BSA 1mg/ml חומצת שומן חום מומת חופשי בסרום ללא מדיה דקות לפחות 30 ב 37 ° C בתוך תרבית תאים חממה. שוטפים את הידרוג פעם עם PBS סטרילי או תרבות בינוני התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים המדיום המתאים תרבות המכילה FBS. מספר התאים שנזרעו על הידרוג צריך להיקבע על ידי המשתמש מבוסס על מידת התפשטות תאים confluency הנדרש לניסויים. כ -10 5 תאים בדרך כלל מספיק לניתוח המערבי סופג qPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, חלבון התא או mRNA ניתן לחלץ. Coverslips מוסרים בזהירות מבארות בעזרת מלקחיים מעוקל והניח (תא בצד למטה) על גבי 100 טיפות של μl חיץ תמוגה אשר היו מפוזרות (2-3 ס"מ) לאורך גיליון Parafilm על הספסל המעבדה. (אנו משתמשים תקן חיץ SDS מדגם TRIzol, בהתאמה, כדי להכין את דגימות סופג המערבי לבודד רנ"א עבור qPCR). דגירה התאים עם למאגר תמוגה למשך דקה אחת בדיוק. הסר את coverslips ולהעביר את החיץ תמוגה לצינור microcentrifuge. לחילופין להפקת RNA בלבד, המשתמש יכול להעביר את כל הידרוג לצלחת 6-היטב חדשה ולהוסיף 1ml של TRIzol / היטב. דגירה במשך 3 דקות ולהסיר TRIzol פתרון לאחסון בתוך שפופרת microcentrifuge. </li></ol> פרטים נוספים על נהלים כגון immunofluorescence, מכתים BrdU, transfection, וכו 'עבור תאים שנזרעו על הידרוג מתואר קליין et al. 2007 13. נציג תוצאות שטיפה יסודית של coverslips הבאה תוספת של APTMS היא צעד חשוב בהפקת "תגובתי" coverslips. אם אחד לא מצליח להסיר את APTMS לחלוטין, יגיב עם glutaraldehyde בשלב הבא וליצור משקע עכור לבן כפי שניתן לראות באיור 1 א. 1B איור מראה coverslip נשטף כראוי יבשים. אם המשקע מפתחת, ההליך כולו יש להפעיל מחדש מההתחלה כמו coverslip כבר אינו שמיש. בעקבות היווצרות הידרוג ציפוי עם חלבונים ECM לילה, תאים יכולים להיות seeded למחרת. כמו איור 2 מראה, יש הבדל ניכר בין תא מתפשטת על הידרוג נוקשה לעומת הרכות. כפי שניתן לראות על ידי צביעה phalloidin ב fibroblasts העכבר עובריים (MEFs), התפשטות תאים במידה רבה יותר על נוקשות לעומת הידרוג רך. ואכן, רוב התאים הצמדת הידרוג רכה יישאר קומפקטי לצרף בצורה פחות יעילה. אמנם רק מורפולוגיה MEF מוצג באיור 2, ההבדל בתא הפצת עקבי לאורך מספר שורות תאים אחרות שנבדקו 11-12,14. סודות להצלחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הליך זה התחיל, חשוב מאוד לשמור על coverslips עם הצד "תגובתי" מעלה לזכור באיזה צד היה מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש ללבוש כפפות בכל עת במהלך ההליך כדי לספק סביבת עבודה כי הוא סטרילי ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוב הצעדים הראשונים מבוצעים בין במנדף כימי קטר ועל הספסל מעבדה. כל הצעדים הבאים כדי להסיר glutaraldehyde עודף coverslips צריכה להתבצע תחת ארון בטיחות ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשל הבדלים בתא spreaדינג (איור 2), אנו ממליצים זריעת פעמיים את מספר התאים על הידרוג רך לעומת הידרוג נוקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך פילמור AC הוא מהיר מאוד. עבור משתמשים בפעם הראשונה, אפשר להקטין את כמות APS או TEMED בפתרון להאריך את תהליך פילמור. אל תנסו להכין יותר coverslips כמה בבת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחזור התא שבו מחקרים הסינכרון G0 נדרש, אנחנו בדרך כלל בסרום-להרעיב תאים בצלחות פלסטיק תרבות, trypsinize את התאים ולזרוע אותם על הידרוג של התאמות שונות בנוכחות mitogens (FBS ו / או גורמי גדילה). הליך זה מבטיח כי אוכלוסיית המוצא של G0-מסונכרן תאים זהים כל הדגימות. עם זאת, מחקרים רבים התמרה האות, תקופת נדרש גירוי mitogen לא יכול להיות מספיק זמן כדי לאפשר התקשרות והפצת של תאים. במקרה זה, אנו בסרום-להרעיב את התאים הידרוג ולאחר מכן ישירות לגרות אותם עם mitogen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="איור 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1a"> איור 1 א. שטף כיאות coverslip. בעקבות תוספת של APTMS, coverslip נשטף במשך 1-2 דקות לפני תוספת של הפתרון glutaraldehyde. המשקע טפסים coverslip שלא נחפף על פי הצעדים המפורטים בנוהל. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="איור 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1b"> איור 1B. נשטף כראוי coverslip. בנוסף הבאים APTMS, coverslip נשטף במשך שלוש פעמים 10 דקות כל אחד, לפני התוספת של הפתרון glutaraldehyde. המשקע לא טפסים coverslip. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מורפולוגיה של תאים על הידרוג של קשיחות שונות. נוסדה MEFs היו זורעים על פיברונקטין מצופה הידרוג של קשיחות גבוה או נמוך עבור 9 שעות. לאחר תקופת הדגירה, התאים היו קבועים, permeabilized ומוכתמים FITC-phalloidin אשר נקשר אקטין-F. MEFs על ג'לים קשיחות גבוהה התערוכה סיבי מתח מפוזרים היטב בהשוואה לאלו seeded על הידרוג קשיחות נמוכה. בר סולם = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. נציג PCR כמותי תוצאה של cyclin D1 עכבר רמות ה-mRNA. סרום fibroblasts העכבר עובריים היו מורעבים מצופה על גבוה (3% acrylamide) או נמוך (0.3% acrylamide) הידרוג נוקשות מגורה עם FBS 10% עבור 9 שעות. לאחר מיצוי RNA, בזמן אמת, ניתוח כמותי PCR בוצע עבור cyclin D1 רמות mRNA (מנורמל ל 18S RNA). G0 cyclin D1 מייצג mRNA מתאי שקט. Cyclin D1 רמות ה-mRNA להגדיל באופן משמעותי על הידרוג נוקשה אך לא על הידרוג רך. הנתונים הם ממוצע + / - SD של שכפול PCR תגובות.

<ol><li>Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+analysis+of+heterogeneous%2C+atherosclerotic+human+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta.</a> J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).</li>
<li>Bernini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness%2C+intima-media+thickness+and+carotid+artery+fibrosis+in+patients+with+primary+aldosteronism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism.</a> J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).</li>
<li>Boonyasirinant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stiffness+is+increased+in+hypertrophic+cardiomyopathy+with+myocardial+fibrosis%3A+novel+insights+in+vascular+function+from+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging.</a> J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+mechanical+properties+of+human+atherosclerotic+tissue+by+high-frequency+intravascular+ultrasound+imaging.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb%22%5BJournal%5D)">Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study.</a> Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples.</a> Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).</li>
<li>Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%2C+cellular+tension%2C+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control.</a> Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).</li>
<li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מרכיב חיוני של תהליך פילמור הידרוג הוא להימנע היווצרות בועת אוויר אשר יאפשר תאים להיקשר coverslip הזכוכית ולא הידרוג ECM מצופה עצמו. זה ניתן למנוע על ידי בקפידה pipetting הפתרון פילמור לאחר vortexing ו חזותית ולוודא כי אין בועות אוויר הפכו לכוד בתוך הג&#39;ל. אנחנו תמיד ממליצים על הכנת נוסף &quot;תגובתי&quot; coverslips ו הידרוג כדי להבטיח שיש מספיק לניסויים. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם בכל פעם ג&#39;לים נשט...

<table><tbody><tr><td>Glutaraldehyde, 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>יש לשמור בטמפרטורה של -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>יש לשמור בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>SurfaSil Siliconizing Fluid</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>יש לשמור בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>NHS (N-hydroxysucinimide Ester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>יש לשמור בטמפרטורה של 4&amp;#x00B0;C להחליף מדי חודש</td></tr><tr><td>Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>יש לשמור בטמפרטורה של 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>zichrot (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>zichrot (18mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות acrylamide מבוססי הידרוג

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

רקמות קשיחות הוא הקובע חשוב של תפקוד הסלולרי, ושינויים רקמות נוקשות קשורות כלל בסרטן פיברוזיס, ומחלות לב וכלי דם 1-11. גישות מסורתיות תא ביולוגי ללימוד פונקציה הסלולר לערב תאים culturing על תשתית נוקשה (צלחות פלסטיק או זכוכית coverslips) אשר אינו יכול להסביר את ההשפעה של ECM אלסטי או וריאציות קשיחות ECM בין רקמות. מודל in vivo ציות התנאים רקמה במבחנה, אנו ואחרים להשתמש ECM מצופה הידרוג. במעבדה שלנו, הידרוג מבוססים על polyacrylamide אשר יכול לחקות את טווח התאמות רקמה ביולוגית לראות 12. &quot;תגובתי&quot; תלושי לכסות מופקים על ידי הדגירה עם NaOH ואחריו תוספת של 3-APTMS. Glutaraldehyde משמש צולבות הקישור 3-APTMS ואת ג&#39;ל polyacrylamide. הפתרון של acrylamide (AC), bis-acrylamide (BIS-AC) ו persulfate אמוניום משמש פילמור של הידרוג. N-hydroxysuccinimide (NHS) הוא שולב פתרון ה-AC חלבון ECM crosslink כדי הידרוג. לאחר פילמור של הידרוג, משטח ג&#39;ל מצופה חלבון ECM של בחירה כגון, קולגן פיברונקטין, vitronectin וכו &#39; קשיחות של הידרוג ניתן לקבוע על ידי rheology או במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ובניכוי ידי שינוי אחוז AC ו / או bis-AC בפתרון 12. באופן זה, נוקשות תשתית ניתן להתאים קשיות של רקמות ביולוגיות אשר ניתן לכמת באמצעות rheology או AFM. תאים אז יכול להיות seeded על אלה הידרוג ותרבותיים בהתבסס על תנאי הניסוי הנדרש. הדמיה של התאים והתאוששות שלהם לניתוח מולקולרית היא פשוטה. במאמר זה, אנו מגדירים לקרקע רך כמו אלה שיש moduli אלסטי (E) &lt;3000 פסקל לקרקע נוקשה / רקמות אלה עם E&gt; 20,000 פסקל.

ההשפעה של קשיחות מתחת לקרקע על התפקוד התאי יכול להיות המודל<em&gt; במבחנה</em&gt; באמצעות הידרוג polyacrylamide של התאמות שונות.

שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

קשיחות רקמה היא גורם מכריע בתפקוד התאי, ושינויים בקשיחות הרקמה קשורים בדרך כלל לפיברוזיס, לסרטן ו...

למידול גמישות רקמות in vivo באמצעות הידרוג'לים של אקרילאמיד. הדבר מבוצע תחילה על ידי יצירת לוחות כיסוי תחתונים ריאקטיביים ולוחות כיסוי עליונים סיליקוניים. השלב השני של הפרוטוקול הוא מזיגה ויצירה של הידרוג'לים של אקרילאמיד.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא קישור צולב (cross-linking) של חלבון המטריצה החוץ-תאית הנבחר להידרוג'ל. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא אינקובציה ואנליזה של תאים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות כיצד שינוי בגמישות המטריצה החוץ-תאית in vitro מווסת את התנהגות התאים, וזאת באמצעות אנליזה המשתמשת במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה, qPCR כמותי בזמן אמת ו-western blotting.היום נראה לכם את הפרוצדורה להכנה ולשימוש בהידרוג'לים של אקרילאמיד. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד קשיחות המטריצה החוץ-תאית מווסתת מורפולוגיה של תאים, איתות תאי ופרוליפרציה. אז בואו נתחיל.התחילו הליך זה על ידי הכנת זכוכיות כיסוי (cover slips) רהאקטיביות. ראשית, הניחו שכבה של פאראפילם (parafilm) על החלק התחתון של צלחת פטרי בקוטר 150 מילימטר. לאחר מכן, העבירו עד תשע זכוכיות כיסוי שעברו אוטוקלב בקוטר 25 מילימטר אל הפאראפילם וכסו אותן ב-1 מיליליטר של נתרן הידרוקסיד בריכוז 0.1 מולרי.דגרו את לבישי הזכוכית למשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, שאבו את נתרבית ההידרוקסיד באמצעות קו ואקום העובד בתוך מנדף כימי. טפטפו 0.5 milliliters של 3-aminopropyltrimethoxysilane או 3-APTMS על כל לביש זכוכית. דגרו את לבישי הזכוכית למשך שלוש דקות ולאחר מכן שאבו את ה-3-APTMS. היזהרו לא לדגור זמן רב מדי כדי למנוע היווצרות קצף על הלביש.זכוכיות כיסוי לאחר הטיפול. שטפו את זכוכיות הכיסוי פעם אחת עם 20 milliliters של מים דה-יוניים באותה צלחת. הוציאו את זכוכיות הכיסוי מהצלחת באמצעות פינצטה קמורה והעבירו אותן, כאשר הצד המטופל פונה כלפי מעלה, לצלחת חדשה של 150 millimeter.לאחר מכן, שטפו שוב את לביבות הכיסוי במים דה-יוניים והניחו אותן על השייקר (rocker) למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הסירו את המים ושטפו פעמיים נוספות. חשוב מאוד להסיר את כל ה-A-P-T-M-S כדי שלא יגיב עם הגלוטראלהיד ויגרום להיווצרות משקוב לבן ועכור 10 דקות לפני השימוש בגלוטראלהיד.בעזרת פינצטה קמורה, העבירו את לוחות הכיסוי לצלוחית נקייה המצופה ב-param ושאיפו כל נוזל שנותר באמצעות קו ואקום, ולאחר מכן כסו כל לוח כיסוי לחלוטין ב-0.5 milliliters של 0.5%glutaraldehyde במים דה-יוניים סטריליים כדי ליצור קשרי צלב בין ה-A-P-T-M-S לבין ג'ל הפולי-אקרילאמיד. דגרו את לוחות הכיסוי למשך 30 דקות במנדף כימי. לאחר מכן, שאיפו את שטיפת ה-glutaraldehyde ושטפו שוב את לוחות הכיסוי במים דה-יוניים.לאחר מכן ייבשו את הזכוכיות המכסות לחלוטין. העבירו זכוכיות מכסות חדשות לפביאלקון (Falcon) בנפח 50 מיליליטר המכיל תמיסת surface seal בריכוז 10% בתוך כלורופורמיל, וטלטלו בעדינות במשך 10 דקות לפחות. שפכו את תמיסת ה-surface seal וייבשו באוויר.הניחו את לביבות הכיסוי על מגבוטי Kim בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית שבה יוכנו ההידרוגלים, כדי להתחיל בהכנת ההידרוגלים. השתמשו בפינצטה מעוקלת כדי להעביר את לביבות הכיסוי, כאשר הצד הריאקטיבי פונה כלפי מעלה, לדף פאראפילם שהודבק למשטח של קבינת הבטיחות הביולוגית. ודאו שלביבות הכיסוי מונחות בצורה שטוחה על פני שטח הפאראפילם.לאחר מכן, הכין תמיסה רוויה של NHS בטולואן על ידי המסת כמות קטנה של NHS בכמות מספיקה של טולואן. עבור ניסויים ספציפיים, הוסף כמויות קטנות של NHS עד ש-NHS כבר אינו נמס. התמיסה הרוויה היא בדרך כלל עכורה וורודה.בשלב הבא, הכינו את תמיסת האקרילאמיד, ה-BIS-אקרילאמיד והמים, והוסיפו PS כדי להגיע לאחוז האקרילאמיד הרצוי. הוסיפו את הריאגנטים לשפופרות המיקרוסנטריפוגה כמפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, חלקו את התמיסות לאליקוטים, אחד בכל פעם.הוסיפו את ה-NHS וה-TM. ערבלו את המבחנה ב-Vortex למשך זמן קצר ושפכו מיד בין שלושה לחמישה ג'לים, תוך שימוש ב-140 microliters לכל זכוכית כיסוי, בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית. הניחו במהירות את זכוכית הכיסוי ה-SILICONIZED בגודל 25 millimeter מעל לכל ג'ל לפני תחילת הפולימריזציה.הוספת כיסוי הזכוכית העליון תאפשר לאקרילאמיד לכסות לחלוטין את כיסוי הזכוכית התחתון. דגרו "סנדוויץ'" זה בטמפרטורת החדר עד לפולימריזציה של האקרילאמיד; כדי לקבוע מתי התרחשה הפולימריזציה, בדקו את תמיסת האקרילאמיד שנותרה במבחורת המיקרו-צנטריפוגה.הפולימריזציה תימשך מספר דקות עבור ג'לים קשיחים וזמן מעט ארוך יותר עבור ג'לים רכים. לאחר השתלמות הפולימריזציה, הרימו בזהירות את ה"סנדוויץ'" תוךempre לבישת כפפות סטריליות. לאחר מכן, החליקו את כיסוי הזכוכית העליון עד שיבלוט מעל הג'ל שעבר פולימריזציה.לאחר מכן, פתחו את הכיסוי. הסירו את הג'ל והשליכו את כיסוי הזכוכית העליון. העבירו כל כיסוי ג'ל תחתון, אשר ייקרא מכאן הלאה הידרוג'ל, לפלטה בעלת שישה בארות.בשלב הבא, הוסיפו שני מיליליטר של phosphate buffered saline או PBS לכל באער בלוח של שישה באערים. לאחר מכן, שטפו את ההידרוגלים ב-PBS והדגירו אותם על רוקר למשך חמש דקות. חזרו על שטיפה זו פעמיים.כדי להתחיל את הניסוי, כסו כל הידרוג'ל בשני מיליליטר של תמיסת פיברונקטין או חלבון אחר של המטריקס החוץ-תאי. דגרו את החלבון על ההידרוג'ל למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לו להיקשר קוולנטית להידרוג'ל; לאחר הדגירה למשך הלילה, שאבו את תמיסת ה-ECM. לאחר מכן, חסמו את ה-NHS שאינו מגיב באמצעות מיליגרם אחד למiliליטר של אלבומין משרת בקר ללא חומצות שומן המופעל בחום, במצע נטול סרום, ודגרו למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, שטפו את ההידרוג'לים פעם אחת ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, זרעו את התאים במצע גידול מתאים המכיל סרום בקר עוברי. יש לזרע אותם על גבי ההידרוג'ל.נעשה שימוש בפיברובלסטים עובריים של עכבר. קבע את מספר התאים שיזרעו על ההידרוג'ל בהתבסס על מידת פריסת התאים וההצפיפות (confluence) הנדרשת לניסוי. עבור אנליזת western blot ו-quantitative PCR נדרשים כ-10⁵ תאים.לאחר מכן, דגרו את התאים בתנאים המתאימים לסוג התא הספציפי. בתום תקופת הדגירה, הוציאו את חלבוני התא או את ה-mRNA בהתאם לצורך.טפטפו 100 µL של תמיסת ליזיס (lysis buffer) על גבי דף פאראפילם שמונח על השולחן במעבדה, תוך השארת רווח של כשני עד שלושה סנטימטרים בין כל טיפה. לאחר מכן, הוציאו בזהירות כל הידרוג'ל על ידי הרמת כיסוי הזכוכית התחתון מהבאר. השתמשו בפינצטה מעוקלת והניחו את צד התאים כלפי מטה על גבי הטיפות.דגרו את התאים עם תמיסת הליזה למשך דקה אחת בדיוק. לבסוף, הסירו את לביבות הזכוכית (cover slips) והעבירו את תמיסת הליזה למבחנה למיקרו-צנטריפוגה. לחלופין, בעת מיצוי RNA, העבירו כל הידרוג'ל לפלטה חדשה של שישה בארות והוסיפו 1 mL של triazole לכל בארה.דגרו את הג'לים למשך שלוש דקות לאחר הדגירה. הסירו את תמיסת ה-triazole לאחסון במבחנה למיקרו-צנטריפוגה. שטיפה יסודית של לביבות הזכוכית (cover slips) לאחר הוספת A-P-T-M-S היא שלב חשוב ביצירת לביבות זכוכית ריאקטיביות.לוחיות כיסוי שנשטפו ויבשו כראוי הן נקיות מכל שארית משקע. APTMS יגיב עם הגלוטראלדהיד ויייצר משקע עכור לבן. אם נוצר משקע, יש לחזור על הפרוצדורה כולה, כיוון שלוחית הכיסוי אינה שמישה יותר.לאחר היווצרות ההידרוג'ל וציפויו בחלבוני ECM, זורעים את התאים למשך הלילה. קיים הבדל מובהק בין פריסת תאים על הידרוג'לים קשיחים לעומת רכים, כפי שניתן לראות בצביעת foid; תאי פיברובלסטים מעוברים של עכבר נפרסים במידה רבה יותר על הידרוג'לים קשיחים בהשוואה להידרוג'לים רכים. למעשה, מרבית התאים הנצמדים להידרוג'ל רך יישארו דחוסים וייצמדו בצורה פחות יעילה.תוצאות PCR כמותיות מייצגות של רמות mRNA של cyclin D1 בפיברובלסטים עובריים של עכבר מראות כי cyclin D1 מוגבה באופן משמעותי על מטריצה קשיחה, אך לא על מטריצה רכה. הדבר מרמז כי קשיחות המטריצה מווסתת את התקדמות מחזור התא in vitro. הרגשנו להראות לכם כיצד לייצר הידרוג'ל בעל קשיחויות שונות, המדמה תנאים פיזיולוגיים in vivo. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להכין כיסויות תגובתיות נוספות, שכן תתרחשו תאונות וטעויות.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר ההשפעה של נוקשות מטריצה חוץ-תאית (ECM) על זיהום חיידקי של תאים דבקים. הידרוג'לים פוליאקרילאמיד בעלי קשיחות משתנה, מצופים בקולגן, מרובדים בצלחת מרובת בארות כדי לחקות את הנוקשות של ECM פיזיולוגי. לאחר כיסוי תאי אנדותל אנושיים על ההידרוג'לים והדבקת התאים בליסטריה מונוציטוגנים חיידקים שהונדסו לבטא חלבון פלואורסצנטי פעם תוך תאי, ציטומטריית זרימה משמשת להשוואה בין חיידקים מופנמים בתאים השוכנים על הידרוג'לים נוקשים יותר לעומת הידרוג'לים רכים יותר.

בדיקה לחקר ההשפעה של נוקשות מטריצה חוץ-תאית על זיהום חיידקי

אנו מציגים הידרוג'ל חדש polyacrylamide, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר ישיר מחייב של חלבוני ECM עם עלות או מומחיות מינימאלית. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת שליטה עצמאית של רמזים רבים של microenvironment התא הטבעי ללימוד mechanostransduction הסלולרי.

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

המעבדה שלנו פיתחה הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide, מערכת הידרוג'ל דינמית, כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של ויסות רקמות נוקשות על תפקוד תא. כאן, אנו מספקים שרטוטים, תיאור, ופרוטוקולים להכנת הידרוג אלה.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

כאן מתוארת שיטה המאפשרת הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'לים פוליאקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לאמץ אותה בקלות על ידי כל מעבדת מחקר. זה יהיה שימושי במיוחד במחקר המתמקד בהבנת תגובות תאים תלויות נוקשות.

Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

פיתחנו assay מבוססי לזיהוי של עיצוב רב טוב עבור בודק את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד. Assay הזה הוא תואם cytometry זרימה immunostaining, מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשרות מדידות כמותיים של אינטראקציות biomechanical בין תאים, מטריצה חוץ-תאית, לבין חיידקים פתוגניים.

Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.

מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה ניסיונית להערכת ההשפעות של רמזים מכניים וביוכימיים על תגובות כימותרפיות של תאי גליובלסטומה שמקורם בחולה בתרביות מטריצה-מימטיות תלת-ממדיות באמצעות התקן תאורת UV מותאם אישית המאפשר פוטו-קרוסלינקינג בתפוקה גבוהה של הידרוג'לים עם תכונות מכניות הניתנות לכוונון.

מערכי הידרוג'ל מאפשרים תפוקה מוגברת לסינון השפעות של רכיבי מטריצה וטיפולים במודלים תלת-ממדיים של גידולים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה...

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

חקור את השפעת נוקשות המטריקס החוץ-תאי על התנהגות תאים באמצעות הידרוג'לי אקרילאמיד. השיטה כוללת יצירת הידרוג'לים עם רמות נוקשות שונות וניתוח באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ו-PCR כמותי בזמן אמת.

שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

גלה סרטונים נוספים