שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

לדגמן תאימות רקמות in vivo באמצעות הידרוג'לים אקרילאמיד. זה מושג על ידי יצירת החלקות כיסוי תחתון תגובתיות והחלקות כיסוי עליון סיליקון. השלב השני בהליך הוא לשפוך וליצור את ההידרוג'לים האקרילאמידים.

השלב השלישי של ההליך הוא קישור צולב של חלבון המטריצה החוץ-תאי הנבחר להידרוג'ל. השלב האחרון בהליך הוא דגירה וניתוח תאים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כיצד היענות משתנה של מטריצה חוץ-תאית במבחנה מווסתת את התנהגות התא באמצעות ניתוח באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, PCR כמותי בזמן אמת וכתמים מערביים.

היום נראה לכם את הנוהל לייצור ושימוש בהידרוג'לים אקרילאמיד. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את נוקשות המטריצה החוץ-תאית שלנו, לווסת את המורפולוגיה של התאים, איתות התאים והתפשטותם. אז בואו נתחיל.

התחל הליך זה על ידי יצירת פתקי כיסוי תגובתיים. ראשית הניחו שכבה של פרפורם על החצי התחתון של צלחת פטרי בגודל 150 מילימטר. לאחר מכן העבירו עד תשע החלקות כיסוי 25 מילימטר חיטוי על סרט הפרה וכסו אותן במיליליטר אחד של 0.1 נתרן הידרוקסיד מולרי.

דגרו את החלקות הכיסוי למשך שלוש דקות לאחר הדגירה, שאפו את הנתרן הידרוקסיד עם קו ואקום העובד בפיפטה מכסה מנוע כימי 0.5 מיליליטר של שלושה פרופיל אמינו טרימתיל או שלושה A-P-T-M-S על כל החלקת כיסוי. דגרו על פתקי הכיסוי למשך שלוש דקות ואז שאפו את שלושת ה-A-P-T-M-S. היזהר לא לדגור זמן רב מדי כדי למנוע היווצרות קצף על הכיסוי.

מחליק לאחר הטיפול. שוטפים את הכיסוי מחליק פעם אחת עם 20 מיליליטר מים דה-יונים באותו צלחת. הסר את החלקות הכיסוי מהצלחת באמצעות מלקחיים מעוקלים והעביר אותם לצד המטופל הפונה כלפי מעלה לכלי חדש של 150 מילימטר.

לאחר מכן שוטפים שוב את הכיסוי מחליק במים נטולי יונים ומניחים אותם על הנדנדה למשך 10 דקות. לאחר הדגירה מוציאים את המים ושוטפים פעמיים נוספות. חשוב מאוד להסיר את כל שלושת ה-A-P-T-M-S כדי שלא יגיב עם הגלוטראלדהיד וישאיר משקעים לבנים עכורים 10 דקות לפני השימוש בגלוטרלדהיד.

בעזרת מלקחיים מעוקלים, העבירו את החלקות הכיסוי לכלי נקי בשכבות פראם ושאבו את כל הנוזלים שנותרו באמצעות קו ואקום, ולאחר מכן כסו כל החלקת כיסוי לחלוטין ב-0.5 מיליליטר של 0.5% גלוטראלדהיד במים סטריליים נטולי יונים כדי לקשר בין שלושת ה-A-P-T-M-S וג'ל הפולי אקרילאמיד. דגרו את החלקות הכיסוי למשך 30 דקות במכסה המנוע הכימי. לאחר מכן שאפו את הגלוטרלדהיד, שטפו ושטפו את הכיסוי שוב במים נטולי יונים.

ואז יבש את הכיסוי מחליק לחלוטין. הוסף פתקי כיסוי חדשים לשפופרת פלקון בנפח 50 מיליליטר המכילה תמיסת איטום פני השטח של 10% בכלורופורם וסלע למשך 10 דקות לפחות. שפכו את תמיסת איטום פני השטח וייבשו באוויר.

הכיסוי מחליק על מגבוני קים בארון הבטיחות הביולוגי שבו יוכנו ההידרוג'לים לתחילת הכנת ההידרוג'ל. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי להעביר את החלקות הכיסוי מהצד הריאקטיבי כלפי מעלה ליריעת פרפורם שהודבקה על פני ארון הבטיחות הביולוגי. ודא שהחלקות הכיסוי שטוחות על משטח הפרפורם.

לאחר מכן הכינו תמיסת CIN רוויה והידרוקסית או תמיסת NHS בטולואן על ידי המסת כמות קטנה של NHS בכמות מספקת של טולואן. עבור הניסויים הספציפיים, הוסף כמויות קטנות של NHS עד שה-NHS כבר לא יתמוסס. התמיסה הרוויה היא בדרך כלל מעוננת וורודה.

לאחר מכן, הכינו את מי האקרילאמיד BIS אקרילאמיד ו-PS כדי להגיע לאחוז האקרילאמיד הרצוי. הוסף את הריאגנטים לצינורות השימוש המיקרו כמתואר בפרוטוקול הכתוב. ואז אליקוט אחד בכל פעם.

תוסיפו לי את ה-NHS וה-TM. מערבל את הצינור לזמן קצר ומיד יוצקים בין שלושה לחמישה ג'לים באמצעות 140 מיקרוליטר לכל החלקת כיסוי בארונות הבטיחות הביולוגיים. הנח במהירות את מעטפת הכיסוי של 25 מילימטר SILICONIZED על גבי כל ג'ל לפני שהוא מתחיל להתפלמר.

תוספת של החלקת הכיסוי העליונה תאפשר לאקרילאמיד לכסות לחלוטין את החלקת הכיסוי התחתונה. דגרו את הכריך הזה בטמפרטורת החדר עד שהאקרילאמיד יתפלמר כדי לקבוע מתי התרחשה פילמור. בדוק את שאריות תמיסת האקרילאמיד בצינור המיקרו צנטריפוגה.

הפילמור ייקח כמה דקות לג'לים נוקשים וקצת יותר זמן לג'לים רכים. לאחר שהתרחשה פילמור, הרם בזהירות את הכריך כשהוא לובש כפפות סטריליות. לאחר מכן החלק את החלקה של המכסה העליון עד שהוא תלוי על הג'ל הפולימרי.

ואז חטט את הכיסוי. החלק את הג'ל, השליך את החלקת הכיסוי העליונה. הנח כל תלוש כיסוי ג'ל תחתון הנקרא להלן ההידרוג'ל לצלחת שש בארות.

לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של מי מלח חוצץ פוספט או PBS לכל באר של צלחת שש בארות. לאחר מכן שוטפים את ההידרוג'לים עם PBS ודוגרים על נדנדה למשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים.

כדי להתחיל בניסוי, יש לכסות כל הידרוג'ל בשני מיליליטר של תמיסת פיברונקטין או חלבון מטריצה חוץ-תאי אחר. דגרו את החלבון על ההידרוג'ל למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לו להיקשר קוולנטית להידרוג'ל לאחר הדגירה של הלילה לשאוב את תמיסת ה-ECM. לאחר מכן חסום את ה-NHS הלא מגיב עם מיליגרם אחד למיליליטר של אלבומין סרום בקר פעיל ללא חומצות שומן במדיה נטולת סרום ודגירה למשך 30 דקות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה יש לשטוף את ההידרוג'לים פעם אחת עם PBS סטרילי. לאחר מכן הצלחת את התאים במדיום המתורבת המתאים המכיל סרום בקר עוברי. על ההידרוג'ל כאן.

להקים פיברובלסטים עובריים של עכברים משמשים. קבע את מספר התאים שיש לזרוע על ההידרוג'ל על סמך מידת התפשטות התאים והמפגש הנדרש לניסויים. כ-10 עד חמשת התאים הדרושים לניתוח כתם מערבי ו-PCR כמותי.

לאחר מכן דגרו את התאים בתנאים המתאימים לסוג התא הספציפי. לאחר תקופת הדגירה. חלץ את חלבון התא או ה-mRNA בהתאם לצורך.

פיפטה 100 טיפות מיקרוליטר של חיץ ליזה על יריעת פרפורם על ספסל המעבדה, ומשאירות כשניים עד שלושה סנטימטרים בין כל טיפה. לאחר מכן, הסר בזהירות כל הידרוג'ל על ידי הרמת החלקה של הכיסוי התחתון מהבאר. שימוש במלקחיים מעוקלים והנחת צד התא כלפי מטה על גבי הטיפות.

דגרו את התאים עם מאגר הליזיס למשך דקה אחת בדיוק. לבסוף, הסר את החלקות הכיסוי והעביר את מאגר הליזיס לצינור מיקרו צנטריפוגה. לחלופין, בעת מיצוי RNA העבירו כל הידרוג'ל לצלחת חדשה של שש בארות והוסיפו מיליליטר אחד של טריאזול לבאר.

דגרו על הג'לים במשך שלוש דקות לאחר הדגירה. הסר את תמיסת הטריאזול לאחסון בצינור מיקרו צנטריפוגה. שטיפה יסודית של פתקי הכיסוי לאחר הוספת A-P-T-M-S היא שלב חשוב בייצור פתקי כיסוי תגובתיים.

החלקות כיסוי שטופות ויבשות כראוי נקיות מכל שאריות משקעים. A-P-T-M-S יגיב עם הגלוטרלדהיד וייצר משקעים מעוננים לבנים. אם המשקעים, יש לחזור על כל ההליך מכיוון שהחלקת הכיסוי אינה שמישה עוד.

לאחר היווצרות הידרוג'ל וציפוי בחלבוני ECM, נזרעים תאי לילה. יש הבדל מובהק בין תאים המתפשטים על הידרוג'לים נוקשים לעומת הידרוג'לים רכים, כפי שניתן לראות על ידי FOID בצביעה ותאי פיברובלסטים עובריים של עכברים מתפשטים במידה רבה יותר על נוקשים בהשוואה להידרוג'לים רכים. ואכן, רוב התאים המחוברים להידרוג'ל רך יישארו קומפקטיים וייצמדו בצורה פחות יעילה.

תוצאות PCR כמותיות מייצגות של רמות mRNA של מחזור D אחד בפיברובלסטים עובריים של עכברים מראות כי רכיבה על אופניים D one מווסתת באופן משמעותי על מטריצה נוקשה, אך לא על מטריצה רכה. זה מצביע על כך שנוקשות המטריצה מווסתת את התקדמות מחזור התא במבחנה. זה עתה הראינו לך כיצד ליצור קשיחות ניתוק הידרוג'ל, דוגמנות בתנאים פיזיולוגיים in vivo בעת ביצוע הליך זה חשוב לזכור לבצע החלקות כיסוי תגובתיות נוספות מכיוון שתתרחש תאונה ושגיאה.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.