Electroeluting קטעי DNA

שלום. היום נראה לכם כיצד מבצעים אלקטרו-אלוציה (electrolution) לצורך טיהור מקטעי DNA, כגון תוצרי עיכול ו-PCR. למטרות נוספות כמו שיבוט וריצוף, אלקטרו-אלוציה יכולה להיות אחת השיטות המועדפות. בהתבסס על המטען החשמלי השלילי של ה-DNA, מוצב מחסום תאים גבוה בתוך השדה החשמלי, הגורם להשקעת המקטעים ומונע את נדידתם הלאה.

שיטה זו מאפשרת טיהור של מגוון רחב של גדלי מקטעי DNA ממקורות שונים ביעילות גבוהה יחסית של עד 80%. עלותה הנמוכה מהווה יתרון נוסף של אלקטורלוציה (electro elution) בהשוואה לשיטות טיהור אחרות, כגון עמודות, ערכות שרף, בין היתר. תחילה מדאיקים את דגימת ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרז צבוע בברומיד אתידיום, וזאת כדי להדמין ולזהות את המקטע הרצוי לטיהור, ולאחר מכן יש להמשיך באלקטרופורזה.

כאשר המקטעים מופרדים היטב, ניתן לקבוע במדויק את גודלם של מקטעים קטנים מהצפוי. לאחר האלקטרופורזה, חוצבים בזהירות את המקטע הרצוי מהג'ל באמצעות להב תער חדש, תוך הקפדה על חיתוך פרוסת הג'ל קרוב ככל האפשר לפס המבוקש.

יש לבצע הליך זה תוך הגנה נאותה מאור UV ובשימוש בכפפות. לאחר מילוי ה-electroluter בבופר השריפה המתאים, תוך הקפדה על פריסתו על פני השטח של המישור המרכזי, יש להניח את פרוסת הג'ל בתוך אחד הגלגלים קרוב ככל האפשר לתעלת ה-V. לא צריכות להיות בועות בתוך תעלת ה-vch.

ניתן להימנע מכך על ידי שטיפת התעלה בבופר להסרת בועות אוויר כלואות. לאחר מכן, מוסיפים בזהירות 100 µL של מחסום המלח הריכוזי לתעלת ה-V מהצד הקרוב לבאר. סוגרים את התא ומחברים את האלקטרודות למקור המתח כדי להתחיל את תהליך האלקטרולוציה במתח של 100 עד 120 volts.

מרווחי הזמן יתלוים בגודל הפרגמנט; עבור פרגמנטים גדולים של עד 20 kbs, 50 דקות עד שעה אמורות להספיק, ואילו עבור פרגמנטים קטנים יש לבצע ניטור כל 10 דקות באמצעות אור UV כדי למנוע אליציה נוספת דרך תמיסת המלח אל תוך בופר השטיפה הסופי. במקרה זה, עיכלנו 560 ננוגרם של פלסמיד באמצעות האנזימים ND one ו-entry כדי לשחרר פרגמנט של 900 base per, שווה ערך ל-84 ננוגרם של דגימה.

בהתאם לכך, לאחר הנחת פרוסת הג'ל בתוך הבאר, תתבצע אלקטרו-אלוציה למשך 25 דקות במתח של 100 volts. לאחר השלמת האלקטרו-אלוציה ולכידת מקטעי ה-DNA בכרית התחתונה בתוך תעלת ה-V, יחולצו 400 µL מהתמיסה מהתעלה, מהצד הדיסטלי של המכל, ויועברו למיקרו-מבחנה של 1.5 µL באמצעות טיפ עדין המחובר למיקרו-פיפט. לאחר מכן, יבצעו שיקוע באלכוהול על ידי הוספת שני נפחים של אתנול מוחלט קר וערבוב באמצעות וורטקס. בנוסף, ניתן להוסיף 2 עד 3 µL של גליקוגן כדי לשפר את תנובת השחזור של ה-DNA. יש להקפיא את המבחנות בטמפרטורה של 20°C- למשך שעה אחת, או לחילופין, לאחסן בטמפרטורה זו למשך לילה, ולאחר מכן לסובב בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C במהירות מרבית למשך 25 דקות.

שטפו את העלייה (supernatant) על ידי הוספת 1 ml של אתנול 70% קר. סבבו במערך צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C במהירות מקסימלית למשך 5 עד 10 דקות, השליכו את העלייה והניחו לדגימה להתייבש בטמפרטורת החדר כאשר המבחנות נמצאות במצב הפוך. השביו את המשקעים ב-10 עד 15 µL של מים נטולי נוקלאז והמשיכו בקביעת ריכוז הדגימה. במקרה זה, הדגימה המטוהרת הושבית ב-10 µL של מים ונמדדה בספקטרופוטומטר באורך גל של 260 nm, מה שהראה ריכוז של 6.3 ng/µL, המייצג נצילות של 75%. ייתכן שתחשבו שעדיף להשקיע רק 10 דקות מזמנכם היקר בשימוש בערכה מוכנה.

עם זאת, למרות הזמן המושקע בתהליך זה, תוכלו לשלוט ברבים מהמשתנים שיאפשרו לכם לטהר מגוון רחב יותר של דגימות בעלות גדלים ומקורות שונים בטבע. כפי שניתן לראות במקרה הנוכחי, נצפתה יעילות של 75%, נתון השווה או עולה על רוב ערכות טיהור ה-DNA. תודה שהצטרפתם אלינו היום.

אנו מקווים שפרוטוקול זה יסייע לכם בפרויקטי המחקר שלכם.