Name: Electroeluting קטעי DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: למדו את שיטת האלקטרואלושן לטיהור קטעי DNA ביעילות של עד 80% לצורך ביוטכנולוגיה ומחקר גנטי. שיטה זו מאפשרת טיהור DNA ממגוון מקורות בעלות נמוכה ותוצאות מעולות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה ד&quot;ר Bermudez מעבדה מומן על ידי Conacyt (גרנט # 82622). אנו מודים גבריאלה גוטיירז, סוסה, Eliuth רייס, מרטינז Ximena רודריגז, טורס עבור הקלטת וידאו הליך electroleution.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לבחור שברי DNA של עניין להיטהר, אלה צריכים להיפתר agarose או ג'לים acrylamide ג'ל מוכתם ברומיד ethidium ידי אלקטרופורזה באמצעות חיץ TBE 0.5X (טריס borate, EDTA) ב 120 וולט במשך שעה 1. לשם כך, ~ 700 ננוגרם של פלסמיד pProEx-GdMre11S (6000-bp) מתעכל בעבר עם NdeI ו HindIII שימש לשחרר קטע 900-bp (560 ננוגרם של ng פלסמיד ו 84 של שבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטנק electroeluter (איור 1) צריך להיות מלא עם TBE 0.5X מופץ באופן שווה בכל צד של הרמה באמצע מטפלת לא לשפוך אותו על הרמה באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלהקה שנבחרה (או רצועות) הוא לגזור של הג'ל, והניח בתא מדגם קרוב ככל האפשר אל הערוץ V (פרוסה אחת לכל היטב). חיץ ריצה יש להוסיף חדר אחד; מספיק כדי לכסות את הפרוסה ג'ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל ערוץ V בשימוש חייב להיות סמוקות עם פיפטה פסטר לחסל כל בועת אוויר לכוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז 100 ul של 10 אצטט M 4 NH (כדי להקל על ויזואליזציה כמות קטנה של כחול bromophenol הוא הוסיף, מספיק כדי צבע זה) מוסיפים בעדינות בתוך ערוץ ה-V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכסה יש לסגור בעדינות כדי למנוע כל resuspension של כרית מלח גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroelution הוא החל ב -100 וולט במשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר electrolution הושלמה, 400 ul יוסרו V-channel, והניח בתוך שפופרת microfuge להיות זירז עם 2 כרכים של אתנול הגליקוגן קר (מומלץ לשפר את ההתאוששות DNA) בשעה 4 ° C למשך שעה 1 או לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 20 דקות, להסיר ולשטוף supernatant עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור יבש ולכמת את ה-DNA OD 260 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתאוששות שהושג היה 75% (63 ng התאושש כאשר 84 ng הונחו על ה-V-channel). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1. דיאגרמה Electroeluter. Anod קטודה מצוינים בכל צד של ה-DNA טנק, הכלול ג'ל פרוס (מאויר כמו ריבוע שחור) יהגרו לכיוון הקתודה בשל מטען שלילי שלה. ואז זה יהיה לכוד בתוך כרית מלח (כפי שהוא מיוצג משולש שחור הפוך) ממוקם ה-V-הערוץ.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

משך הריצה יהיה תלוי מאוד על גודל של שברים, בדרך כלל שברי עד 20 kb 50 דקות עד שעה 1 מספיק, בעוד שברי קטן אור UV ניטור כל 10 דקות נדרש כדי למנוע שבר לעבור את מלח כרית ועקב לחדר חיץ anodal ירידה התאוששות. חשוב לוודא כי כאשר אתה מגדיר אספקת החשמל שלכם ב 100 וולט, יש mAmp הנוכחי של לפחות 10. להקת ה-DNA ניתן לנטר באמצעות מנורת UV-יד לזהות מתי זה נוטש את הפרוסה ג&#39;ל. מלח כרית אפשר גם עם אצטט 3 Na M. הליך זה מאפשר טיהור של שברי דנ&quot;א או רנ&quot;א בגדלים שונים עם התאוששות טובה (~ 80%) להיות radiolabeled, מתעכל על ידי אנזימי הגבלה, מעובד על ידי האנזימים שינוי, וכו &#39;

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; אצטט</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>ביופוטומטר</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרו-&amp;#8211;לוטר</td><td>מרווח בין פעימות (IBI)</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

electroeluting קטעי dna

Electroeluting DNA Fragments

שברי DNA מטוהרים המשמשים למטרות שונות בביולוגיה מולקולרית והם יכולים להיות מוכן על ידי נהלים שונים. רובם דורשים אלקטרופורזה קודמות של שברי DNA על מנת להפריד את הלהקה של עניין. לאחר מכן, הלהקה הזו הוא נכרת מתוך ג&#39;ל agarose או acrylamide וטיהר באמצעות אחת: מחייב elution מן החלקיקים זכוכית או סיליקה, DEAE-תאית ממברנות, &quot;למחוץ ולספוג שיטה&quot;, electroelution או לעתים קרובות מאוד יקר ערכות טיהור מסחרי. לכן, בחירת השיטה יהיה תלוי בעיקר מה זמין במעבדה. ההליך electroelution מאפשרת לטהר DNA נקי מאוד לשמש במספר רב של יישומים (רצף, radiolabeling, הגבלה האנזימטית, שינוי אנזימטי, וכו &#39;שיבוט). הליך זה מורכב הצבת להקת DNA המכיל פרוסות agarose או acrylamide לתוך בארות מדגם של electroeluter, ולאחר מכן להחיל הנוכחי יהפוך את קטע הדנ&quot;א לעזוב את agarose ובכך להיות לכודים מלח כרית להיות התאושש מאוחר יותר על ידי משקעים אתנול.

הליך זה מאפשר טיהור של קטעי DNA עם תשואה גבוהה.

Electroeluting קטעי DNA

מקטעי DNA מופלטים משמשים למטרות שונות בביולוגיה מולקולרית וניתן להכינם באמצעות מספר פרוצדורות. רובן דורשות...

שלום. היום נראה לכם כיצד מבצעים אלקטרו-אלוציה (electrolution) לצורך טיהור מקטעי DNA, כגון תוצרי עיכול ו-PCR. למטרות נוספות כמו שיבוט וריצוף, אלקטרו-אלוציה יכולה להיות אחת השיטות המועדפות. בהתבסס על המטען החשמלי השלילי של ה-DNA, מוצב מחסום תאים גבוה בתוך השדה החשמלי, הגורם להשקעת המקטעים ומונע את נדידתם הלאה.שיטה זו מאפשרת טיהור של מגוון רחב של גדלי מקטעי DNA ממקורות שונים ביעילות גבוהה יחסית של עד 80%. עלותה הנמוכה מהווה יתרון נוסף של אלקטורלוציה (electro elution) בהשוואה לשיטות טיהור אחרות, כגון עמודות, ערכות שרף, בין היתר. תחילה מדאיקים את דגימת ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרז צבוע בברומיד אתידיום, וזאת כדי להדמין ולזהות את המקטע הרצוי לטיהור, ולאחר מכן יש להמשיך באלקטרופורזה.כאשר המקטעים מופרדים היטב, ניתן לקבוע במדויק את גודלם של מקטעים קטנים מהצפוי. לאחר האלקטרופורזה, חוצבים בזהירות את המקטע הרצוי מהג'ל באמצעות להב תער חדש, תוך הקפדה על חיתוך פרוסת הג'ל קרוב ככל האפשר לפס המבוקש.יש לבצע הליך זה תוך הגנה נאותה מאור UV ובשימוש בכפפות. לאחר מילוי ה-electroluter בבופר השריפה המתאים, תוך הקפדה על פריסתו על פני השטח של המישור המרכזי, יש להניח את פרוסת הג'ל בתוך אחד הגלגלים קרוב ככל האפשר לתעלת ה-V. לא צריכות להיות בועות בתוך תעלת ה-vch.ניתן להימנע מכך על ידי שטיפת התעלה בבופר להסרת בועות אוויר כלואות. לאחר מכן, מוסיפים בזהירות 100 µL של מחסום המלח הריכוזי לתעלת ה-V מהצד הקרוב לבאר. סוגרים את התא ומחברים את האלקטרודות למקור המתח כדי להתחיל את תהליך האלקטרולוציה במתח של 100 עד 120 volts.מרווחי הזמן יתלוים בגודל הפרגמנט; עבור פרגמנטים גדולים של עד 20 kbs, 50 דקות עד שעה אמורות להספיק, ואילו עבור פרגמנטים קטנים יש לבצע ניטור כל 10 דקות באמצעות אור UV כדי למנוע אליציה נוספת דרך תמיסת המלח אל תוך בופר השטיפה הסופי. במקרה זה, עיכלנו 560 ננוגרם של פלסמיד באמצעות האנזימים ND one ו-entry כדי לשחרר פרגמנט של 900 base per, שווה ערך ל-84 ננוגרם של דגימה.בהתאם לכך, לאחר הנחת פרוסת הג'ל בתוך הבאר, תתבצע אלקטרו-אלוציה למשך 25 דקות במתח של 100 volts. לאחר השלמת האלקטרו-אלוציה ולכידת מקטעי ה-DNA בכרית התחתונה בתוך תעלת ה-V, יחולצו 400 µL מהתמיסה מהתעלה, מהצד הדיסטלי של המכל, ויועברו למיקרו-מבחנה של 1.5 µL באמצעות טיפ עדין המחובר למיקרו-פיפט. לאחר מכן, יבצעו שיקוע באלכוהול על ידי הוספת שני נפחים של אתנול מוחלט קר וערבוב באמצעות וורטקס. בנוסף, ניתן להוסיף 2 עד 3 µL של גליקוגן כדי לשפר את תנובת השחזור של ה-DNA. יש להקפיא את המבחנות בטמפרטורה של 20°C- למשך שעה אחת, או לחילופין, לאחסן בטמפרטורה זו למשך לילה, ולאחר מכן לסובב בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C במהירות מרבית למשך 25 דקות.שטפו את העלייה (supernatant) על ידי הוספת 1 ml של אתנול 70% קר. סבבו במערך צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C במהירות מקסימלית למשך 5 עד 10 דקות, השליכו את העלייה והניחו לדגימה להתייבש בטמפרטורת החדר כאשר המבחנות נמצאות במצב הפוך. השביו את המשקעים ב-10 עד 15 µL של מים נטולי נוקלאז והמשיכו בקביעת ריכוז הדגימה. במקרה זה, הדגימה המטוהרת הושבית ב-10 µL של מים ונמדדה בספקטרופוטומטר באורך גל של 260 nm, מה שהראה ריכוז של 6.3 ng/µL, המייצג נצילות של 75%. ייתכן שתחשבו שעדיף להשקיע רק 10 דקות מזמנכם היקר בשימוש בערכה מוכנה.עם זאת, למרות הזמן המושקע בתהליך זה, תוכלו לשלוט ברבים מהמשתנים שיאפשרו לכם לטהר מגוון רחב יותר של דגימות בעלות גדלים ומקורות שונים בטבע. כפי שניתן לראות במקרה הנוכחי, נצפתה יעילות של 75%, נתון השווה או עולה על רוב ערכות טיהור ה-DNA. תודה שהצטרפתם אלינו היום.אנו מקווים שפרוטוקול זה יסייע לכם בפרויקטי המחקר שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

"ה-DNA" חיישנים, reagentless, biosensors אלקטרוכימיים כי ביצועים טובים גם כאשר תיגר ישירות בדם מטריצות מורכבות אחרות, הותאמו זיהוי של מגוון רחב של חומצת גרעין חלבון, ו analytes מולקולה קטנה. כאן אנו מציגים הליך כללי עבור ייצור ושימוש של חיישנים כאלה.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל מתואר.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

בסרטון זה, אנו מנתחים את התפלגות הגודל של מקטעי DNA או cfDNA ללא תאים באמצעות אלקטרופורזה נימית אוטומטית. טכניקה זו מסייעת לקבל תובנות לגבי הפרופיל של מקטעי DNA המשתחררים על ידי תאים סרטניים במהלך אפופטוזיס.

ניתוח התפלגות גודל מקטע אוטומטי מבוסס אלקטרופורזה נימית של CFDNA: שיטה מבוססת שבב DNA לחקר התפלגות גודל של מקטעי DNA שבודדו מנוזלים ביולוגיים

סרטון זה מתאר את טכניקת האלקטרופורזה הקפילרית המיקרופלואידית להפרדת אמפליקונים PCR בהתבסס על גודלם. טכניקה זו מסייעת בגודל השבר באמצעות צבעים פלואורסצנטיים וסמני גודל מולקולריים סטנדרטיים.

אלקטרופורזה נימית מיקרופלואידית לגודל מקטעים של מוצרי PCR: טכניקת הפרדה אלקטרופורטית מבוססת שבב להפרדת מקטעי DNA על בסיס גודל

אנו מציגים biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לגילוי הכלאת DNA. בעקבות functionalization הבדיקה ssDNA, הסגוליות, הרגישות, וגבול הגילוי נלמדים ביעדי ssDNA משלימים ולא משלימים. תוצאות ממחישות את השפעתם של אירועי הכלאת DNA על מערכת אלקטרוכימיים, עם גבול גילוי של 3.8 ננומטר.

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

ייצוג מופחת משופר ריצוף ביסולפיט הוא שיטה להכנת ספריות ריצוף לניתוח מתילציה של DNA המבוססת על עיכול אנזימי הגבלה בשילוב עם המרת ציטוזין ביסולפיט. פרוטוקול זה דורש 50 ננוגרם של חומר התחלתי ומניב נתוני רזולוציית זוגות בסיסים באזורים גנומיים עשירים ב-GC.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

ג 'ל מסורתי ג' ל אלקטרופורזה (SGE) ניסויים דורשים מנגנון מסובך וצריכה כימית גבוהה. עבודה זו מציגה פרוטוקול המתאר שיטה זולה להפריד שברי DNA בתוך פרק זמן קצר.

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

פרוטוקול כדי להפוך את הבחירה במבחנה אפיון של חומצה פתלית המיועדות לקבוצות אסתר-איגוד ה-DNA aptamers מוצג. היישום של aptamer שנבחר ב aptasensor אלקטרוכימי נכלל גם.

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

למדו את שיטת האלקטרואלושן לטיהור קטעי DNA ביעילות של עד 80% לצורך ביוטכנולוגיה ומחקר גנטי. שיטה זו מאפשרת טיהור DNA ממגוון מקורות בעלות נמוכה ותוצאות מעולות.

Electroeluting קטעי DNA

גלה סרטונים נוספים