Electroeluting קטעי DNA

Hi.Today נראה לכם כיצד מתבצעת אלקטרו לוציה על מנת לטהר שברי DNA כגון מוצרי עיכול ו-PCR. למטרות נוספות כמו שיבוט וריצוף, אלקטרו לוציה יכולה להיות אחת השיטות הנבחרות. בהתבסס על המטען החשמלי השלילי של ה-DNA, מחסום תאים גבוה ממוקם בתוך השדה החשמלי, מפיל את השברים ומונע את נדידתם נוספת.

שיטה זו מאפשרת טיהור של מגוון רחב של גדלי שברי DNA ממקורות שונים ביעילות גבוהה יחסית של עד 80%עלותו הנמוכה. מייצגים יתרון נוסף של אלקטרו לוציה בהשוואה לשיטות טיהור אחרות כמו עמודים, ערכות שרף, בין היתר. דגימת ה-DNA מודגלת לראשונה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אריס מוכתם בשעמום ברומיד על מנת לדמיין ולזהות את השבר הרצוי לטיהור, יש להמשיך באלקטרופורזה.

מתחת לשברים מופרדים היטב, ניתן לקבוע במדויק גודל נמוך. בעקבות אלקטרופורזה. השבר הרצוי נכרת בצורה מסודרת מהג'ל באמצעות סכין גילוח חדש לגמרי ודואג להפוך את פרוסת הג'ל קרוב ככל האפשר לרצועה המעניינת.

הליך זה צריך להתבצע עם הגנה נאותה מפני אור UV ולבישת כפפות. לאחר מילוי האלקטרו לוטר במאגר הבעירה המתאים והקפדה לשפוך אותו על פני הרמה האמצעית, פרוסת הג'ל מונחת בתוך אחד הגלגלים קרוב ככל האפשר לתעלת ה-V. לא אמורות להיות בועות בתוך ערוץ ה- vch.

ניתן להימנע מכך על ידי שטיפת התעלה עם מאגר כדי להסיר אוויר כלוא. ואז מוסיפים בזהירות 100 מיקרוליטר של מחסום המלח הגבוה לתעלת ה- V מהאתר הפרוקסימלי לבאר. החדר סגור והאלקטרודות מחוברות למקור החשמל כדי להתחיל ב-100 עד 120 וולט.

חלוף הזמן יהיה תלוי בגודל השבר עבור שברים גדולים של עד 20 kbs. 50 דקות עד שעה אמורות להספיק ושברים קטנים צריכים לנטר כל 10 דקות באור UV כדי למנוע אליון נוסף דרך תמיסת המלח ולתוך שרשרת החיץ הסופית של הבוגר. במקרה זה, עיכלנו 560 ננוגרם של פלסמיד עם האנזימים ND one וכניסה כדי לשחרר 900 בסיס לכל שבר, שווה ערך ל-84 ננוגרם של דגימה.

בהתאם, לאחר הנחת פרוסת הג'ל בתוך הבאר, האלקטרו לוטוציה תמשיך למשך 25 דקות ב -100 וולט. לאחר השלמת התמיסה החשמלית ושברי ה-DNA נלכדים בכרית הדרומית בתוך תעלת ה-V, 400 מיקרוליטר של תמיסה נשלפים מהתעלה, מהצד הדיסטלי של השקע ומונחים בצינור מיקרו של 1.5 מיקרוליטר באמצעות קצה דק המחובר לבור מיקרו, המשיכו למשקעי אלכוהול על ידי הוספת שני נפחים של אתנול מוחלט קר ומעורבבים על ידי מערבולת. בנוסף, ניתן להוסיף שניים עד שלושה מיקרוליטרים של גליקוגן כדי לשפר את התשואה של צינורות קלאסיים לשחזור DNA במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה או לחילופין, אחסן בטמפרטורה זו צנטריפוגה לילה בארבע מעלות צלזיוס במהירות מרבית למשך 25 דקות.

זה סופרנטנט אירובי ושטיפה על ידי הוספת מיליליטר אחד של צנטריפוגה קרה, 70% אתנול בארבע מעלות צלזיוס במהירות מרבית למשך חמש עד 10 דקות, השליכו את הסופרנטנט והניחו לייבש אותו בטמפרטורת החדר כשהצינורות במצב הפוך, שומנים שהושקעו ב-10 עד 15 מיקרוליטר של מים נטולי גרעין והמשיכו לקבוע את ריכוז הדגימה. במקרה זה, הדגימה המטוהרת הושעתה מחדש ב-10 מיקרוליטר מים וכומתה בספקטרופוטומטר באורך גל של 260 ננומטר המראה ריכוז של 6.3 ננוגרם למיקרוליטר, המייצג יעילות של 75%. אולי אתה חושב שעדיף לך להשקיע רק 10 דקות מזמנך היקר עם ערכה.

עם זאת, למרות הזמן הנצרך בתהליך זה, תוכל לשלוט ברבים מהמשתנים שיאפשרו לך לטהר מגוון רחב יותר של דגימות הנושאות גדלים ומקורות טבע. כפי שניתן היה לראות במקרה הנוכחי, נצפתה יעילות של 75% שווה או טובה יותר מרוב ערכות טיהור ה-DNA. תודה שהצטרפת אלינו היום.

אנו מקווים שמצאת פרוטוקול זה שימושי עבור פרויקטי המחקר שלך.