חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר גבישי חלבון לניסויי עקיפה של קרני רנטגן כאן. שלוש טכניקות שונות לסינון גבישים מודגמות שיטות התגבשות דיפוזיה של אדים כולל טיפה תלויה וטיפת ישיבה, כמו גם שיטות התגבשות מיקרו אצווה מתוארות להתגבשות דיפוזיה של אדים. הבארות מלאות במשקעים.

לאחר מכן מערבבים ריכוז גבוה של דגימת חלבון מטוהר עם החומר המשקע. לאחר מכן אוטמים את הטיפה המעורבת בבאר המכילה את תמיסת המשקעים. התגבשות אצווה מיקרו מתחילה במילוי הבאר בשמן פרפין.

לאחר מכן מועמס החלבון לבארות, ואחריו תמיסת המשקעים. השלב האחרון של כל השיטות הוא לתת למערכת להתייצב ולעקוב אחר הופעת הגביש וצמיחתו בתוך הטיפות. בסופו של דבר, ניתן להשיג גבישים מטכניקה זו ולקבוע את דפוס עקיפה של החלבון באמצעות מקור רנטגן עם גלאי מתאים.

היי, אני סאל מהמעבדה של פרופסור יוגה מוטיס במחלקה לביופיזיקה מולקולרית וביוכימיה באוניברסיטת ייל. היום נראה לכם הליך להתגבשות חלבון מטוהר. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את הבסיס המבני של זיהום נגיפי.

אז בואו נתחיל ונגדל כמה גבישים. כדי לזהות שיטת התגבשות למקרומולקולה לבחירה, ניתן לבצע בדיקות ראשוניות באמצעות פתרונות התגבשות זמינים מסחרית שנבחרו כדי לנצל את השיטה הלא שלמה של המטריצה הדלילה של תנאי הניסוי. תנאים אלה נבחרים על סמך תנאי התגבשות ידועים ומוצלחים עבור מקרומולקולות.

לאחר שמצב ההתגבשות ידוע, ניתן להרכיב מסך צר המשנה את ריכוז המשקעים ב-pH סביב הפגיעה המקורית. בדרך כלל תנאי ההתגבשות המשמשים למסכים אלה מורכבים מתקיפת חומר משקע ומאגר להגדרת ה-pH, יש לסנן את כל תמיסות המלאי דרך מסנן 0.22 מיקרון להדגמה זו. תנאי ההתגבשות שזוהו בעבר עבור ליזוזום עוף משמשים עם נתרן כלורי כאשר המשקעים מתחילים את ההליך על ידי הכנת תמיסות מיליליטר של ריכוזים שונים של נתרן כלורי בנתרן אצטט 0.1 מולרי של phs שונים.

לאחר מכן, דגימת החלבון מאוחסנת במינוס 80 מעלות צלזיוס ושומרת אותה על קרח. ריכוזי חלבון אופייניים הם בטווח של חמישה עד 50 מיליגרם למיליליטר עם ריכוזים גבוהים יותר, בדרך כלל נותנים תוצאות טובות יותר. כאן משתמשים בתמיסה של 50 מיליגרם למיליליטר של ליזוזום ביצת תרנגולת ב-0.02 נתרן אצטט מולארי pH 4.9.

סובב את הדגימה למשך 15 דקות ב-18, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר חלבונים מצטברים חלקית או משקעים משלב ההפשרה. אגרגטים אלה יכולים להפריע לצמיחת הגבישים ולקדם צבירה נוספת. בעקבות צנטריפוגה.

קבע את ריכוז החלבון מספיגתו ב-280 ננומטר באמצעות פוטומטר ספקטרום UV. ניתן לחשב את ריכוז החלבון מקריאת הספיגה ומקדם ההכחדה של החלבון. לאחר שדגימת החלבון מוכנה, מלאו מגש התגבשות טיפות ישיבה תלויות היטב ב-500 מיקרוליטר של תמיסת משקעים על פי מפת המגש.

צור טבעת שומן סיליקון סביב קצה כל באר מבלי לסגור את הטבעת בצורה מושלמת כך שאוויר יוכל לברוח היטב. תקרה. נקה את שקופית הכיסוי עם תרסיס אוויר מרוכז או מגבון מקצועי כדי למנוע אבק, מה שיקל על הפרשנות של טיפות ההתגבשות וימנע זיהומים. השלב הבא הוא פיפטה בכמויות שוות של דגימת החלבון ותמיסת המאגר על שקופית הכיסוי.

עם זאת, ניתן לנסות כמויות שונות של חלבון ומשקעים כחלק מתהליך האופטימיזציה תוך שימוש ביותר חלבון מאשר משקעים מביא לריכוז נטו של החלבון בטיפה המאוזנת, מה שעשוי להיות רצוי עבור דגימות חלבון דוט או להאטת גרעין או צמיחה של גבישים. לצורך הדגמה זו, שני מיקרוליטרים של 50 מיליגרם למיליליטר ליזוזים בנתרן אצטט מולארי של 0.02. pH ארבע נטען במרכז שקופית הכיסוי, ואחריו שני מיקרוליטר של תמיסת התגבשות.

בעת פיפטינג חלבון ותמיסת מאגר על מגלשת הכיסוי, היזהר מאוד להימנע מהיווצרות בועות, המתרחשת לעתים קרובות כאשר אוויר נושף מהפיפטה. ערבבו בעדינות את הטיפה כדי לסייע במניעת משקעי חלבון מוקדמים עקב ריכוזי משקעים גבוהים מקומיים בטיפות ערבוב חשוב במיוחד עבור משקעים צמיגים כגון פוליאתילן גליקול באמצעות פינצטה. הפוך את שקופית הכיסוי בעדינות והניח אותה על טבעת השומן מעל, בצע זאת היטב בצורה כיוונית כך שאוויר יוכל לברוח מהבאר.

אחרת, האוויר יכול להרים את מגלשת הכיסוי ולסכן את אטם הבאר. עוברים לבאר הבאה עד להשלמת המגש. לאחר הגדרת המגש, בדוק אותו ויזואלית, תוך הסרת חלקיקי אבק ומזהמים אחרים שיכולים להפחית את הזיהוי החיובי השגוי של גבישי חלבון.

השתמש בגיליון ציונים כדי לתעד את הניסוי. לאחר מכן, הניחו את המגש בטמפרטורת הדגירה הרצויה בדרך כלל בין ארבע מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר. הטמפרטורה המוצלחת ביותר היא 20 מעלות צלזיוס.

הקפד לטפל במגש בעדינות ולהימנע מרעידות רעידות או שינויי טמפרטורה במהלך העברה או דגירה עלולים למנוע צמיחת גבישים או להשפיע לרעה על איכות הגביש. בדוק אם יש גבישים במגש למחרת ולאחר מכן כל כמה ימים, תמיד טפל במגשים בזהירות. תעד את כל הממצאים ושחרר מורפולוגיות במגש גיליון ניקוד ספציפי.

לגבישים לוקח בדרך כלל יומיים עד חמישה ימים להופיע, אם כי גבישים מופיעים מדי פעם כמעט מיד או עד מספר חודשים לאחר מכן. לאחר שזוהו תנאי ההתגבשות וקצב הצמיחה של הגבישים ידוע, עדיף להשאיר את המגשים ללא הפרעה עד שהגבישים הופיעו וגדלו לפחות למחצית מגודלם הסופי. השארת המגשים ללא הפרעה יכולה להפחית את מספר אירועי גרעין הגביש, וכתוצאה מכך מספר קטן יותר של גבישים גדולים יותר להתגבשות טיפה בישיבה עוקבים אחר אותו הליך כמו לטיפה תלויה, אלא שנשתמש במגש טיפה יושב היטב בו אין צורך בשקופיות כיסוי.

במקום זאת, הבאר מכילה מדף שעליו מערבבים את החלבון והמשקעים, שני מיקרוליטר של 50 מיליגרם לתמיסת ליזוזים מיליליטר על מרכז המדף, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת משקעים לדגימה לאחר הגדרת המגש. אטום את הבארות עם סרט אופטי עם טיפת ישיבה.

אין צורך בשקופיות כיסוי. המשך את הדגירה וניקוד הקריסטל כמתואר עבור טיפה תלויה. כדי לבצע הליך מיקרו אצווה.

הכן את תמיסת ההתגבשות והחלבון כמתואר להליך הטיפה התלויה. השג מגש מיקרו אצווה חדש ותרסיס אוויר כדי למנוע אבק וחלקיקים גדולים אחרים במגש המיקרו אצווה. הוסף שמן פרפין לכל באר לעומק של שלושה מילימטרים.

ואז הסר עודפי שמן. לאחר מכן טען מיקרוליטר אחד מתמיסת החלבון לבאר הממולאת מראש, וודא שהטיפה שוקעת לתחתית הבאר. ואז טען מיקרוליטר אחד של תמיסת משקעים לבאר.

ודא שהטיפה שוקעת לתחתית הבאר ומתמזגת עם טיפת החלבון. עברו לבאר הבאה עד להשלמת המגש והמשיכו בניתוח הדגירה והגביש כמתואר כאן. תוצאות אופייניות של התגבשות חלבון.

ניסויים מוצגים. משקעים אמורפיים מתרחשים כאשר החלבון ו/או המשקעים נמצאים בריכוז גבוה. לעומת זאת, טיפות שאינן רוויות בדרך כלל נשארות צלולות.

הפרדת פאזה יכולה להתרחש אם החלבון או חומר הניקוי נפרדים לשלב אחר כאשר הם מעורבבים עם משקעים מסוימים בריכוז גבוה. בתנאים אופטימליים, גבישי חלבון צריכים ליצור Arabidopsis csn. שבעה גבישי חלבון שהתקבלו בפוליאתילן גליקול 8, 000 ומגנזיום אצטט מופיעים בצורת מוט.

גבישים המוצגים גם הם גבישי חלבון ליזוזום שהתקבלו במולחנת אחת, נתרן כלורי ונתרן אצטט. pH 4.9. סרטון דולג זמן זה מדגים כי גבישי ליזוזום גדלים למנסרות גדולות תוך מספר שעות מרגע ההתקנה בעת שימוש בשיטת הטיפה התלויה.

זה עתה הראינו לך כיצד להגדיר ניסוי חלבון כשאתה מבצע את ההליך הזה. חשוב לעבוד בסביבה השולטת באופן קבוע בטמפרטורה ובלחות מכיוון שלחות גבוהה עוזרת למזער את אידוי הטיפה, נסו לאמץ טכניקה שממזערת את חשיפת הטיפה לאוויר הפתוח. מסיבה זו, חיוני לפעול בסביבת עבודה מאורגנת היטב.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.