מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

נגיפי אלפא הם נגיפי RNA שנולדו על ידי יתושים המדביקים בהתמדה תאי יתושים רגישים עם ציטופתולוגיה מינימלית. פרוטוקול זה מראה את התועלת של מערכות התמרת וירוס אלפא זיהומיות המבטאות מדווחים פלואורסצנטיים לזיהוי זיהום וקטורי והעברת וירוסים. ראשית האכילו את נקבות היתושים בארוחת דם המכילה את נגיף האלפא המעניין, לאחר מכן קבעו את יעילות ההדבקה ביתושים, ובחרו רק יתושים המבטאים את גן הסמן.

לאחר מכן, קצרו רוק מהיתושים הנגועים והפגינו יכולת העברה על ידי הדבקת תאי יתושים מתורבתים ברוק שנאסף. תוצאות שהתקבלו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפי. דמיין דיווח של חלבון כמו GFP וכך עקוב אחר זיהום וקטור והעברת וירוסים על ידי מיני יתושים משנות השמונים או QE.

ניתן להשתמש במערכות ביטוי של נגיף אלפא או ATS כדי להעריך במהירות ביטוי גנים ויתושים וקטוריים הן למחקרי ארבו-וירוס והן לפני ביצוע מניפולציות קשות יותר של יתושים כגון טרנסגנזה של יתושים. ידגימו את ההליכים הללו ד"ר אירמה סאנצ'ז ורגאס, ד"ר אריק מוסל ואהרון פיליפס ממעבדתו של ד"ר קן אולסון. על מנת לייצר נגיף TS בתאי Bhk 21, השתמש בנגיף רקומביננטי סימביס המבטא את מדווח ה- GFP לאחר שעתוק במבחנה, דרג את וירוס האלפא הגנומי המתמיר RNA של המערכת לתאי bhk 21.

לאחר מכן להציל ולהגביר את הנגיף לפני ההדבקה. יתושים ראשונים להזנת דם יעילה ממזין מלאכותי על ידי מניעת מזון. הסר סוכר 24 שעות ומים 12 שעות לפני ההאכלה.

דם מעורב של בעלי חיים שהושג מסחרית עם תרבית תאים מוכנה נגזר תרחיף וירוס TS לזיהום יעיל במעי האמצעי של היתושים. נסח 10 עד שבע יחידות יוצרות פלאק לטיטר וירוס מיליליטר לארוחת הדם כדי לעורר את היתושים לגודש. הוסף TP לריכוז סופי של 0.02 טוחנת.

הנח קרום מעיים של סימן נקבוביות מעל הפה של מזין הזכוכית המצופה במים. לאחר מכן, הגדר את המזינים עם מים במחזור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכניסו את הארוחה לתא והניחו את המזינים היטב על הקרטון.

לאחר האכלת היתושים במשך 10 עד 30 דקות, מיינו יתושים מרדימים קרים עבור הדגימות העמוסות בדם כדי לאפשר שכפול והפצה של נגיף TS ביתושים שנבחרו. דגרו אותם בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 75% למשך שמונה עד 10 ימים. על מנת לשתק את היתושים.

הנח את קרטון החזקת הנייר בארבע מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות. כעת, העבירו חמישה עד 10 יתושים לשולחן קירור המותאם לשימוש במיקרוסקופ פלורסנט. בדוק ומיין את היתושים על סמך נוכחות או היעדר פלואורסצנטיות.

החזר יתושים נבחרים לקרטון הנייר לשימוש כרצונך. בשלב זה, קבע את יעילות ההדבקה באמצעות עוצמת פלואורסצנטי כפרוקסי. לבסוף, נתחו רקמות כמו המעיים האמצעיים, בלוטות SIV וגופי השומן, ועקבו אחר הקרינה.

ניתן לנתח איברים ורקמות אלה בזמנים מוקדמים יותר אם תרצה. מנע מיתושים מקור סוכר במשך 24 שעות לפני ההאכלה. הכן צינור נימי של 50 מיקרוליטר שחומם, נמשך ונחתך עם שלושה עד חמישה מיקרוליטר של קרגיל.

שמן טבילה מסוג B כדי להבטיח שהיתושים לא יברחו. הסר את רגליהם וכנפיהם. כעת הכנס את החרטום לצינור.

עקוב בזהירות אחר טיפות הרוק הנפלטות מהחרטום לתוך שמן הטבילה. במידת הצורך, הניחו טיפה של 1% פילוקרפין על בית החזה של היתושים כדי להגביר את הרוק לאחר 60 עד 90 דקות, הסירו את היתושים ואחסנו אותם לבידוד וירוסים עתידי. כעת כדי לקצור תמיסה מהצינור הנימים, הוציאו את תערובת שמן הרוק לתוך צינור המכיל 500 מיקרוליטר של 20% F-B-S-P-B-S סטרילי.

סנן את החיסון דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרון, ולאחר מכן השתמש בחיסון זה כדי להדביק תאים מתורבתים בתאי יתושים. יעילות ההדבקה בנגיף DS MRE 16 GFP מוערך על ידי ביטוי GFP. עם הזמן, תאים אלה נדבקו בנגיף בריבוי של 0.01 זיהום.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי מאפשר לראות את כל הגוף של GFP ביתוש הנגוע כמו גם בחלקי הגוף השונים כאן 10 ימים לאחר ההדבקה. ביטוי סלקטיבי של GFP מעיד על זיהום מפושט. במעי האמצעי יש בדרך כלל זיהום מוקדים מובהק מוקדם לאחר בליעת ארוחת דם המכילה וירוס המתפשט ברחבי המעי האמצעי האחורי בזמנים מאוחרים יותר לאחר ההדבקה.

אירועים אלה מאותתים על ידי כתבי GFP ו-DS RED. בדיקת ההעברה מצביעה על כך שחמישה נגיפים ראשוניים DS MRE 16 GFP מבטאים ביציבות GFP לאורך כל תקופת הדגירה החיצונית. ביתוש כאן, GFP ורוק יתושים מתגלים כבר שמונה ימים לאחר ההדבקה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להדביק וירוס TS דרך הפה ליתוש, כיצד להעריך חזותית זיהום וירוס ביתוש וכיצד להעריך את העברת הנגיף מהיתוש.