Name: מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למד להשתמש במערכות אלפא-וירוס טרנסדוצינג להבעת דווחנים פלואורסצנטיים ביתושים בוגרים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר זיהום וקטורים והעברת נגיפים במחקר ארבובירוסים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH R01 AI46435) ואת RMRCE (NIH AI065357).

<ol><li>Brault, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+patterns+of+o%27nyong+nyong+virus+in+the+malaria-transmitting+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).</li>
<li>Campbell, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+uses+RNA+interference+in+defense+against+Sindbis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection.</a> BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).</li>
<li>Cirimotich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+interference+increases+alphavirus+replication+and+virus-associated+mortality+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes.</a> BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).</li>
<li>Capurro, deL. ara, M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-expressed%2C+recombinant+single-chain+antibody+blocks+sporozoite+infection+of+salivary+glands+in+Plasmodium+gallinaceum-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).</li>
<li>Foy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+Sindbis+virus+transducing+system+and+its+characterization+in+three+Culicine+mosquitoes+and+two+lepidopteran+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species.</a> Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).</li>
<li>Foy, B. D., Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus+transducing+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alphavirus transducing systems.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).</li>
<li>Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).</li>
<li>Hahn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Sindbis+virus+transient+expression+vectors+for+studying+antigen+processing+and+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).</li>
<li>Keene, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+acts+as+a+natural+antiviral+response+to+O%27nyong-nyong+virus+%28Alphavirus%3B+Togaviridae%29+infection+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mammalian+membrane+proteins+in+mammalian+cells+using+Semliki+Forest+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors.</a> Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).</li>
<li>Myles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus-derived+small+RNAs+modulate+pathogenesis+in+disease+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+resistance+to+dengue-2+virus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes.</a> Science. 272, 884-884 (1996).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+chloramphenicol+acetyltransferase+in+Aedes+albopictus+%28C6%2F36%29+cells+and+Aedes+triseriatus+mosquitoes+using+a+double+subgenomic+recombinant+Sindbis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Sindbis+virus+expression+system+that+efficiently+expresses+green+fluorescent+protein+in+midguts+of+Aedes+aegypti+following+per+os+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection.</a> Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).</li>
<li>Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+haemocyte+tropism+for+an+arbovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A haemocyte tropism for an arbovirus.</a> J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).</li>
<li>Pierro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+orally+infectious+Sindbis+virus+transducing+system+that+efficiently+disseminates+and+expresses+green+fluorescent+protein+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).</li>
<li>Rutledge, L. C. W. ard, A, R., Gould, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+feeding+response+of+mosquitoes+to+nutritive+solutions+in+a+new+membrane+feeder%5BTitle%5D)+AND+%22Mosq.+News%22%5BJournal%5D)">Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder.</a> Mosq. News. 24, 407-407 (1964).</li>
<li>Sanders, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sindbis+virus+induces+transport+processes+and+alters+expression+of+innate+immunity+pathway+genes+in+the+midgut+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).</li>
<li>Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Sindbis+virus-mediated+RNA+interference+to+demonstrate+a+conserved+role+of+Broad-Complex+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).</li>
<li>Vanlandingham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטות שהוצגו כאן לאפשר לחוקרים לעקוב אחר זיהום של alphavirus בתרבות התא יתושים היתוש נקבה בוגרת. היתרונות והחסרונות של השימוש וירוסים ATS מסוכמים בטבלה 2. שיבוט ATS זיהומיות ניתן להשפיע גנטית כדי לבטא כל GOI ולא היה בהם כדי להביע נוגדנים שרשרת אחת, מדכאי של RNAi, RNAs antisense מיקוד גנים אנדוגניים, ופרו חלבונים אפופטוטיים. אם עיתונאי אינו בשימוש, הרי חלק הדמיה של שיטה זו אינה רלוונטית. עם זאת, רבים של הפרוטוקולים זהה הכרחיים להצלת וירוס ATS, התפשטות, זיהום יתושים. ישנן מגבלות בגודל מקסימלי של transgene כאשר מוכנס לתוך מערכת transducing alphavirus. מגבלות גודל משתנים בהתאם לזן ההורים השתמשו כדי ליצור את ATS, אבל הם בדרך כלל על 1kb למרות הגנים הכתב גדול כמו גחלילית בלוציפראז שימשו בבניית ATS לשימוש יתושים. מעבדות מחקר עם סכום צנוע של רקע וירולוגיה אמור להיות מסוגל להשתמש ATS הבא של הפרוטוקולים הללו. מספר מעבדות מחקר עשית זאת באמצעות SINV מבוססי של ATS.

<table><tbody><tr><td>ערכת QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>ערכת MAXIscript</td><td>Ambion</td><td>AB1312</td><td>יש לוודא שימוש בערכה המכילה את הפולימראז המתאים לקונסטרוקט שלכם.</td></tr><tr><td>אנלוג כובע (m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G))</td><td>Ambion</td><td>AM8050</td><td></td></tr><tr><td>מזרק ננו-ליטר Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור תאים חשמלי (Electro Cell Manipulator)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 630</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת alphavirus transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus מערכות transducing (ATSs) הם כלי חשוב לביטוי גנים עניין (GOI) במהלך ההדבקה. ATSs נגזרות שיבוטים cDNA של יתושים וירוסים RNA (Alphavirus הסוג; משפחה Togaviridae). הסוג Alphavirus מכיל כ 30 שונים יתושים מינים וירוס. Alphaviruses הם נגיפים עטופים ומכילים חד גדילי RNA בגנום (~ 11.7 Kb). Alphaviruses לתמלל subgenomic mRNA המקודד חלבונים מבניים של הנגיף נדרש encapsidation של הגנום והתבגרות של הנגיף. Alphaviruses הם בדרך כלל ממס ביותר בתאים בעלי חוליות, אך בהתמדה להדביק תאים רגישים יתוש עם cytopathology מינימלית. תכונות אלו הופכות אותם כלי מעולה עבור ביטוי גנים וקטורים יתושים. ATSs הנפוץ ביותר בשימוש נגזרות Sindbis וירוס (SINV). כמיהות מינים רחב של SINV מאפשר הדבקה של cells8 חרקים, העופות, היונקים. עם זאת, ATSs כבר נגזר alphaviruses אחרים, כמו גם 9,10,20. ביטוי גנים זרים מתאפשרת על ידי החדרה של אתר נוסף נגיפי RNA חניכה subgenomic או האמרגן. ATSs שבו רצף הגן אקסוגניים ממוקם 5 &quot;לגנים מבניים ויראלי משמש ביטוי חלבון יציב חרקים. ATSs, שבו רצף הגן ממוקם 3 &quot;לגנים מבניים, משמש להפעלת RNAi ושתיקה הביטוי של הגן כי החרק. ATSs הוכיחו להיות כלי חשוב להבנת וקטור הפתוגן אינטראקציות, פרטים המולקולרי של שכפול נגיפי מחזורי תחזוקה זיהומיות 3,4,11,19,21. בפרט, את הביטוי של עיתונאים פלורסנט bioluminescent כבר סייעה מעקב אחר זיהום ויראלי בשידור וקטור הווירוס 5,14-16,18. בנוסף, התגובה החיסונית וקטור תוארה באמצעות שני זנים של SINV שהונדסו GFP 2,9. כאן, אנו מציגים שיטה לייצור SINV ובו כתב ניאון (GFP) מ שיבוט cDNA זיהומיות. זיהומיות, באורך מלא RNA הוא עיבד מ שיבוט cDNA לינארית. זיהומיות RNA מוחדר לתאים יעד מתירני ידי electroporation. תאים transfected ליצור חלקיקי נגיף מדבק המבטא את GOI. וירוס שנקטפו משמש להדביק יתושים, כפי שתואר כאן, או לארח מינים אחרים (לא מוצג כאן). יכולת וקטור נבחנת על ידי גילוי הקרינה מחוץ midgut או על ידי ניטור הנגיף 7 הילוכים. שימוש עיתונאי ניאון כמו GOI מאפשר אמידה נוח להתפשטות הנגיף ברחבי התרבות תאים, לצורך קביעת שיעור הפצת הזיהום, על יתושים חשוף, העברת הנגיף היתוש ומספק מד מהירה של יכולת וקטור.

שיטות באמצעות מערכות alphavirus transducing להביע כתבים פלורסנט במבחנה יתושים בוגרים מתוארים. טכניקה זו עשויה להיות מותאם כדי להביע כל חלבון של עניין במקום או בנוסף לכתב.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

מערכות העברה של Alphavirus (ATSs) הן כלים חשובים לביטוי גנים של עניין (GOI) במהלך זיהום. מערכות ATS נגזרות משיבוטי cDNA של...

נגיפי אלפא (Alpha viruses) הם נגיפי RNA המועברים על ידי יתושים, המדביקים תאי יתוש רגישים באופן מתמיד עם פתולוגיה תאית מינימלית. פרוטוקול זה מדגים את התועלת של מערכות העברה (transducing systems) של נגיפי אלפא זיהומיים המבטאים חלבונים פלורסצנטיים לצורך זיהוי הדבקה של הווקטור והעברה של הנגיף. ראשית, האכילו נקבי יתושים בארוחת דם המכילה את נגיף האלפא הרלוונטי, לאחר מכן קבעו את יעילות ההדבקה של היתושים, ובחרו רק יתושים המבטאים את הגן המסמן.בשלב הבא, אספו רוק מהיתושים המודבקים והדגימו את יכולת ההדבקה על ידי הדבקת תאי יתוש בתרבית באמצעות הרוק שנאסף. התוצאות התקבלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi-fluorescent microscopy). הדמיאן של חלבון דמוי GFP מאפשר לעקוב אחר ההדבקה של הווקטור והעברת הנגיף על ידי מיני יתושים מסוג eighties או QE.ניתן להשתמש במערכות ביטוי של נגיפי אלפא (Alpha virus expression systems) או ATSs להערכה מהירה של ביטוי גנים ושל פיתוחי יתושי וקטור, הן לצורך מחקרי ארבּו-וירוס (arbovirus) והן לפני ביצוע מניפולציות מורכבות יותר ביתושים, כגון טרנסגנזיס של יתושים. את הפרוצדורות הללו ידגימו ד"ר Irma Sanchez Vargas, ד"ר Eric Mossel ואהרון פיליפס מהמעבדה של ד"ר Ken Olson. כדי לייצר נגיף TS בתאי Bhk 21, השתמשו בנגיף רקומביננטי סימביוטי המבטא את הדיווח GFP לאחר תמלול חוץ-תאי (in vitro transcription), והעבירו באמצעות אלקטרופורזה את ה-RNA של מערכת ההעברה הגנומית של נגיף האלפא אל תוך תאי bhk 21.לאחר מכן, הצילו והשכילו את הנגיף לפני ההדבקה. הכינו את היתושים להזנה יעילה בדם ממזין מלאכותי באמצעות הרעבה. הסירו את הסוכר 24 שעות לפני ההזנה ואת המים 12 שעות לפני ההזנה.ערבבו דם בעלי חיים שנרכש מסחרית, דפיברילי או ציטראטי, עם תרבית תאים שהוכנה כדי להפיק תרחיף של נגיף TS להדבקה יעילה של המעי האמצעי של היתושים. הגדירו תיתור נגיפי של 10⁷ יחידות יוצרות פלאק למיליליטר עבור ארוחת הדם כדי לעודד את היתושים להיגמר. הוסיפו TP לריכוז סופי של 0.02 molar.הניחו ממбраנה מעיית בעלת נקבים מעל פתח של המזין הזכוכית בעל מעטפת מים. לאחר מכן, הכינו את המזינים עם מים במחזוריות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, פפטו את הארוחה לתוך התא והניחו את המזינים בצורה מאובטחת על גבי הקרטון.לאחר האכלת הפיתוחיים למשך 10 עד 30 דקות, מיין את הפיתוחיים שהורדמו בקור כדי לבודד את הדגימות ששבעו דם, זאת כדי לאפשר שכפול והפצה של נגיף TS בפיתוחיים הנבחרים. דגור אותם בטמפרטורה של 28 °C ובלחות יחסית של 75% למשך שמונה עד 10 ימים. זאת על מנת לנייד את הפיתוחיים.הניחו את קופסת הנייר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות. כעת, העבירו חמישה עד 10 יתושים לשולחן קירור המותאם לשימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בחנו ומיינו את היתושים על סמך נוכחות או היעדר פלואורסצנציה.החזירו את הפקידים שנבחרו לקרטון הנייר לשימוש לפי הצורך. בנקודה זו, קבעו את יעילות ההדבקה תוך שימוש בעוצמת הפלורסצנציה כמדד עקיף (proxy). לבסוף, בצעו דיסקציה של רקמות כגון המעיים האמצעיים, בלוטות ה-SIV וגופי השומן, ועקבו אחר פלורסצנציה.ניתן לבצע נתיחה של איברים ורקמות אלו במועדים מוקדמים יותר במידת הצורך. יש למנוע מהיתושים גישה למקור סוכר במשך 24 שעות לפני ההזנה. הכינו צינור קפילרי בנפח 50 µL שעבר חימום, מתיחה וחיתוך, ומלאו אותו ב-3 עד 5 µL של Cargill.הסב שמן טבילה מסוג B כדי להבטיח שהיתושים לא יברחו. הסר את הרגליים והכנפיים שלהם. כעת הכנס את ה-proboscis אל תוך המבחנה.עקבו בקפידה אחר טיפות הרוק המהוללות מהחרטום אל תוך שמן הטבילה. במידת הצורך, הניחו טיפה של 1% pilocarpine על חזה היתוש כדי להגביר את ההרצעה. לאחר 60 עד 90 דקות, הסירו את היתושים ואחסנו אותם לצורך בידוד נגיפים בעתיד. כעת, כדי לאסוף את התמיסה מצינור הנימיות, דחפו את תערובת הרוק והשמן אל תוך מבחנה המכילה 500 µL של 20% F-B-S-P-B-S סטרילי.סננו את האינוקולום באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרון, ולאחר מכן השתמשו באינוקולום זה כדי להדביק תאי יתוש בתרבית. יעילות ההדבקה עם נגיף five prime DS MRE 16 GFP מוערכת על ידי ביטוי של GFP. לאורך זמן, תאים אלו הודבקו בנגיף בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) של 0.01.מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי מאפשר תצפית על כל הגוף של ה-GFP ביתוש הנגוע, וכן בחלקיו השונים של הגוף, כאן ביום ה-10 לאחר ההדבקה. ביטוי סלקטיבי של GFP באיברים מעיד על זיהום מפושט. במעיים האמצעיים מופיעים בדרך כלל מוקדי זיהום מובחנים זמן קצר לאחר בליעת ארוחת דם המכילה נגיף, אשר מתפשטים לכל רחבי החלק האחורי של המעי האמצעי במועדים מאוחרים יותר לאחר ההדבקה.אירועים אלו מסומנים על ידי רפורטרים של GFP ו-DS RED. בדיקת ההעברה מעידה כי נגיף DS MRE 16 GFP בעל חמישה פריימרים מבטא GFP באופן יציב לאורך כל תקופת הדגירה החיצונית. ביתוש זה, GFP ורוק יתוש מזוהים כבר שמונה ימים לאחר ההדבקה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכושו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להדביק יתוש בנגיף A TS באופן אוראלי, כיצד להעריך חזותית זיהום נגיפי ביתוש, וכיצד להעריך את העברת הנגיף מהיתוש.

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

ניצול של התקדמות בפיתוח fluorophore ואת טכנולוגיית הדמיה, שיטה פשוטה של ​​אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה תוכננה כדי לחזות את האינטראקציות המוקדמות בין וירוס לתא.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

ציור כרומוזום הוא שיטה שימושית לחקר ארגון גרעין התא והתפתחות הקריוטיפ. כאן, אנו מדגימים גישה לבודד ולהגביר אזורים ספציפיים של עניין מכרומוזומי פוליטן יחיד המשמשים לאחר מכן עבור פלואורסצנט דו מימדי בהכלאה situ (FISH).

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

כתב יד זה משתמש VirusMapper חבילת תוכנות הקוד הפתוח המבוססת פיג'י ליישם ניתוח חד חלקיקים לתמונות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה כדי ליצור מודלים מדויקים של מבנה הננומטרי.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

מתודולוגיה זו, שכללה הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה, יכולה להעריך ביעילות את ההשפעה של מחסומי המעי התיכון ו / או בלוטת הרוק על זיהום arbovirus.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד למדוד נתוני פרמטרי חיים נפוצים אצל יתושי Aedes aegypti , כולל פריון, גודל כנפיים, פוריות, יחס מין, כדאיות, זמני התפתחות, תרומת גברים ואריכות ימים של מבוגרים. מדידות אלה יכולות לשמש להערכת כשירותם של יתושים טרנסגניים.

כימות עלויות כושר ביתושים מהונדסים, Aedes aegypti

למד להשתמש במערכות אלפא-וירוס טרנסדוצינג להבעת דווחנים פלואורסצנטיים ביתושים בוגרים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר זיהום וקטורים והעברת נגיפים במחקר ארבובירוסים.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

גלה סרטונים נוספים