RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיל ביטוי גנים אנדוגני על ידי הזרקת RNA דו-גדילי לעוברי דרוזופילה כדי לזהות גנים הנדרשים להתפתחות איברים. זה מושג על ידי איסוף ושורה של עוברים בקו ישר. לאחר מכן, מכינים מחטים ומשמשות להזרקת RNA דו-גדילי לעוברים.

לבסוף, העוברים מוכנסים לתוך תא לח כדי להתפתח. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פגמים באיחוי ענפי קנה הנשימה של דרוזופילה באמצעות צביעת נוגדנים של עוברים בשלב מאוחר, או על ידי התבוננות בזחלים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. היתרון העיקרי על פני טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו סקר גנטי קדימה לזיהוי גנים הנדרשים להתפתחות איברים הוא שמדובר בגישה גנטית הפוכה פשוטה יחסית ומהירה לניתוח תפקודי גנים לפני שמוטציה זמינה לאותו גן.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון זיהוי גנים קריטיים הנדרשים להתפתחות מערכת קנה הנשימה D. זהו מודל מצוין לחקר המורפוגנזה של איברי יונקים כגון דרכי הנשימה של בעלי החוליות, מערכת הדם, צינורות הכליות ואפיתל הגישוש. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שלוקח זמן ללמוד את השיטות כמו ריפוד עוברים, שבירת מחטים והזרקת RNA תקוע לעוברים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו השלבים הכרוכים בכמות הגדילים הכפולים. RNA המוזרק משתנה בין העוברים והדגמה כתובה של איך נראים עוברי עור סינציאלים ובלסטו יכולה להיות קשה. קשה ללמוד את השלבים הללו מכיוון שהזרקת כמויות מתאימות של RNA דו-גדילי לעוברי בלסטו סינציאלי היא צעד כה קריטי כדי להפיל ביעילות את הביטוי של גנים אנדוגניים.

כדי להתחיל, הקמת כלובים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, באמצעות זבובים בני יומיים עד ארבעה ימים, W 1 1 1 8 מחליפים את צלחות מיץ הענבים כל שעה במהלך היום כדי לסנכרן את איסוף הביצים על פני תקופה של יום עד יומיים. לפני האיסוף. אוספים עוברי עור סיניר או פיצוץ למשך שעה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, חתיכה מלבנית של אגר מיץ ענבים ואז חותכים קלות קו באמצע האגר בעזרת סכין הגילוח.

השתמש בבדיקה מתכתית כדי להעביר עוברים מצלחת מיץ הענבים לחתיכת מיץ הענבים. אגר. סדרו כ-50 עוברים בקו ישר עם העוברים, צירים ארוכים יותר בזווית של 45 מעלות לקו באמצע האגר. ודא שכל העוברים מצביעים לאותו כיוון כשהקצוות האחוריים שלהם פונים הרחק מהקו.

חותכים חתיכה מלבנית של סרט דו צדדי ומדביקים אותה על פתק כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר. הרם עוברים באמצעות הסרט שעל פתק הכיסוי. הנח את תלוש הכיסוי על מגלשת זכוכית.

לחץ מעט את העוברים לסרט הדו-צדדי ואפשר לעוברים להתייבש באוויר למשך כ-10 דקות. מכסים את העוברים בשכבה דקה של 700 שמן פחמן הילה. המתן כ-10 דקות עד שהעוברים יתבהרו תחת המיקרוסקופ.

מחטים מוכנות להזרקת מיקרו על ידי משיכת צינורות נימי זכוכית. אנו משתמשים במושך מחט מבית World Precision Instruments תחת הגדרות התוכנית. מחממים עיכוב אחד ארבע אחורה.

טען את המחט בשני מיקרוליטרים של RNA דו-גדילי באמצעות פיפטה Einor P 20 עם קצות מעמיס מיקרו של Einor. הכן שקופית עם החלקת כיסוי נקייה מעליו והדביק אותם יחד. הביאו את המחט המלאה אל קצה החלקת הכיסוי, וצרו נקודה חדה.

RNA דו-גדילי דולף מקצה המחט. כאשר דוושת הרגל של משאבת הפיקו נלחצת, הכינו שקופית עם טיפת שמן באמצע. הכנס את המחט לתוך טיפת השמן.

כוונן את ההגדרה במשאבת הפיקו כדי להוציא 100 עד 200 פיקוליטר של RNA דו-גדילי כאשר דוושת הרגל נלחצת. תקוע כפול. ניתן לראות RNA כמיקום טיפה קטנה.

קצה המחט בחלק האחורי של העובר הראשון לחץ על דוושת הרגל של משאבת הפיקו. RNA דו-גדילי יופיע כקטן. באתר ההזרקה.

סיים להזריק RNA דו-גדילי לעוברים בשקופית. להרוג את כל עוברי העור שאינם מפוצצים. הנח את החלקת הכיסוי לתוך תא לח מכוסה, כגון צלחת פטרי מפלסטיק בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס עד שהעוברים התפתחו לשלב העוברי או הזחל הרצוי.

עבור עוברים שהתפתחו לשלב העוברי הרצוי, השתמש בבדיקה כדי להסיר את העוברים מהסרט הדו-צדדי ולדחוף אותם לקצה החלקת הכיסוי. שוטפים את העוברים עם הפטן לבקבוקון איסוף עם רשת ניילון בתחתית. שטפו את העוברים שלוש פעמים עם PB ב-50% אקונומיקה למשך חמש דקות ושטפו את העוברים שוב שלוש פעמים עם PBT.

העבירו את העוברים מבקבוקון האיסוף לחתיכת רשת ניילון בעזרת פיפטה, טבלו את חתיכת רשת הניילון בתמיסה המקבעת. תקן את העוברים למשך 30 דקות. הסר את השכבה התחתונה של תמיסת הקיבוע.

לאחר מכן מביאים אותם עם מתנול, עוברים מועברים לצינור אפנדורף ואימונוסטיין עם שני נוגדנים A12 ודיפוזיה באמצעות פרוטוקולי צביעת נוגדנים סטנדרטיים לעוברים שהתפתחו לשלב הזחל הרצוי. הכן שקופית עם טיפת פחמן הילה, 700 שמן באמצע ושתי החלקות כיסוי קטנות מכל צד של טיפת השמן. העבירו זחל אחד למגלשה ולאחר מכן מרחו החלקת כיסוי על גבי טיפת השמן.

התבונן בזחלים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. תוצאות מייצגות הן של דיפוזיה של RNA דו-גדילי והן של GFP כפול גדילי. הזרקת RNA מוצגת כאן.

GFP כפול תקוע. עוברים שהוזרקו ל-RNA מראים איחוי קנה נשימה תקין וחלבון דיפוזיה קיים בתאי היתוך. החצים מצביעים על תאי היתוך חיוביים של דיפוזיה צדדית של תא המטען והכוכבית מציינת את מיקום האיחוי הרגיל.

עם זאת, עוברים שהוזרקו RNA דו-גדילי דיפוזיה מראים איחוי ענפים כושל וחלבוני דיפוזיה אינם קיימים בתאי היתוך. המשולש מציין את אתר איחוי הענפים הכושל כאשר עוברים שהוזרקו על ידי RNA דו-גדילי התפתחו לשלב הזחל. זחלי ה-G-F-P-R-N AI מראים איחוי תקין של ענף קנה הנשימה המסומן בכוכבית.

מצד שני, זחלי הדיפוזיה RN AI הדגימו היתוך ענפים כושל המסומן על ידי משולשים. תוצאות אלו מראות את ההשפעה של הפלה של ביטוי גן דיפוזיה אנדוגנית על ידי הזרקת RNA דו-גדילי לעוברי דרוזופילה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להרוג את כל עוברי ה-Enseal Blaster לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור את תפקודם של גנים חדשים להתפתחות איברים בדרוזופילה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפיל גנים אנדוגניים על ידי הזרקת RNA דו-גדילי לעוברי דרוזופילה.