RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתיק ביטוי של גנים אנדוגניים באמצעות הזרקת RNA דו-גדילי לעוברים של דרוזופילה, וזאת כדי לזהות גנים הדרושים להתפתחות איברים. פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי איסוף העוברים וסידורם בקו ישר. לאחר מכן, מוכנות מחטים המשמשות להזרקת RNA דו-גדילי לתוך העוברים.

לבסוף, העוברים מועברים לתא לחית (moist chamber) כדי להתפתח. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פגמים בחיבור ענפי הקנה של ה-drosophila באמצעות צביעה בנוגדנים של עוברים בשלב מאוחר, או על ידי תצפית בזחלים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield microscope). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סקר גנטי קדימה (forward genetic screen) לזיהוי גנים הדרושים להתפתחות איברים, הוא שזוהי גישה גנטית הפוכה (reverse genetic approach) פשוטה ומהירה יחסית לניתוח תפקודי גנים לפני שזמין מוטנט עבור אותו גן.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון זיהוי גנים קריטיים הדרושים להתפתחות מערכת הטרכיא של ה-D. זהו מודל מצוין לחקר המורפוגנזה של איברים ביונקים, כגון דרכי הנשימה של חרפת-חושה, מערכת הדם, צינורות הכליות ואפיתל חקרני. באופן כללי, מי שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להתקשות בתחילה, שכן נדרש זמן ללמידת הטכניקות, כגון יישור העוברים, שבירת מחטים והזרקת RNA שזוף אל תוך העוברים.

הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהשלבים הכוללים את כמות ה-double stranded RNA המוזרקת משתנים בין עוברים, והדגמה כתובה של המראה של עוברים בשלב ה-syncytial blastoderm עשויה להיות קשה. שלבים אלו קשים ללמידה כיוון שהזרקת כמויות מתאימות של double stranded RNA לעוברים בשלב ה-syncytial blastoderm היא שלב קריטי להשגת knockdown יעיל של ביטוי גנים אנדוגניים.

כדי להתחיל, הכינו כלובים בטמפרטורה של 25 °C באמצעות זבובים בני יומיים עד ארבעה מימי גיל מדגם W 1 1 1 8; החליפו את מצעי מיץ הענבים מדי שעה במהלך היום כדי לסנכרן את איסוף הביצים לאורך תקופה של יום עד יומיים. לפני האיסוף, אספו עוברים מסוג syn city או blaster derm למשך שעה אחת בטמפרטורה של 25 °C, על פיסת מלבנית של אגר מיץ ענבים, ולאחר מכן חרצו בעדינות קו במרכז האגר באמצעות להב תער.

השתמשו בחוט מתכת כדי להעביר עוברים ממעטחת מיץ הענבים אל פיסת אגר עם מיץ ענבים. סדרו כ-50 עוברים בשורה ישרה, כאשר הצירים הארוכים של העוברים נמצאים בזווית של 45 מעלות לקו במרכז האגר. ודאו שכל העוברים פונים לאותו כיוון, כאשר קצותיהם האחוריים פונים הרחק מהקו.

גזרו פיסה מלבנית של סרט דבק דו-צדדי והדביקו אותה על לבישת כיסוי (cover slip) בגודל 18 על 18 מילימטר. אספו עוברים באמצעות הסרט שעל לבישת הכיסוי. הניחו את לבישת הכיסוי על תבנית זכוכית.

הדביקו את העוברים בלחץ קל לסרט ההדבקה הדו-צדדי והניחו להם להתייבש באוויר למשך כ-10 דקות. כסו את העוברים בשכבה דקה של שמן הלוקרבון 700. המתינו כ-10 דקות עד שהעוברים יהיו שקופים תחת המיקרוסקופ.

המחטים מוכנות להזרקה מיקרוסקופית על ידי מתיחה של צינורות נימיות מזכוכית. אנו משתמשים במותח מחטים מבית World Precision Instruments תחת הגדרות התוכנה הבאות: Heat one delay four back.

טענו את המחט עם 2 µL של RNA דו-גדילי באמצעות פיפט Einor P 20 עם טיפים של einor micro loader. הכינו סרטית עם כיסוי זכוכית נקי מעליה והדביקו אותם יחד. הבאי את המחט המלאה אל קצה כיסוי הזכוכית, כדי ליצור נקודה חדה.

RNA דו-גדילי דולף מקצה המחט. כאשר לוחצים על דוושת הרגל של משאבת ה-pico, הכינו סלייד עם טיפת שמן במרכזו. הכניסו את המחט אל תוך טיפת השמן.

כוון את הגדרות משאבת הפיקו (pico pump) כך שתשריג 100 עד 200 picoliters של RNA דו-גדילי בעת לחיצה על דוושת הרגל. ניתן להבחין ב-RNA דו-גדילי כטיפה קטנה במיקום המוגדר.

בעת שהחוד של המחט נמצא בחלק האחורי של העובר הראשון, לחצו על דוושת הרגל של משאבת הפיקו (pico pump). ה-RNA דו-גדילי יופיע כנקודה קטנה באתר ההזרקה.

השלימו את הזרקת ה-double stranded RNA לעוברים שעל הפסחית. השמידו את כל העוברים שאינם בשלב ה-blaster derm. הניחו את זכוכית הכיסוי בתוך תא לחות סגור, כגון צלחת פטרי מפלסטיק, בטמפרטורה של 18 degrees Celsius עד שהעוברים יתפתחו לשלב העוברי או ה larval הרצוי.

עבור עוברים שהגיעו לשלב העוברי הרצוי, השתמשו בחוט (probe) כדי להסיר את העוברים מהסרט הדביק הדו-צדדי ודחפו אותם לקצה של זכוכית הכיסוי. שטפו את העוברים באמצעות heptane לתוך מבחנת איסוף בעלת רשת ניילון בתחתיתה. שטפו את העוברים שלוש פעמים ב-PBT, השריו ב-50% Bleach למשך חמש דקות ושטפו את העוברים שוב שלוש פעמים ב-PBT.

העבירו את העוברים מבקבוקון האיסוף לחתיכת רשת ניילון באמצעות פיפט, ולאחר מכן טבלו את חתיכת רשת הניילון בתמיסת הקיבוע. קבעו את העוברים למשך 30 דקות. הסירו את השכבה התחתונה של תמיסת הקיבוע.

לאחר מכן מקבעים אותם במתנול, מעבירים את העוברים למבחנה מסוג Eppendorf ומבצעים צביעה אימונוהיסטוכימית עם נוגדנים מסוג A 12 ונוגדני דיפוזיה, תוך שימוש בפרוטוקולי צביעת נוגדנים סטנדרטיים לעוברים שהגיעו לשלב הזחלים הרצוי. מכינים סלייד עם טיפה של שמן halocarbon 700 במרכז, ושתי כיסויי זכוכית קטנים משני צידי טיפת השמן. מעבירים זחל אחד לסלייד ולאחר מכן מניחים כיסוי זכוכית מעל טיפת השמן.

בחן את הלרובות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield). תוצאות מייצגות הן של הזרקת RNA דו-גדילי של דיפוזיה והן של הזרקת RNA דו-גדילי של GFP מוצגות כאן.

עובריים שהוזרק להם RNA של GFP דו-גדילי מראים איחוי קנה נשימה תקין, וחלבון הדיפוזיה נמצא בתאי האיחוי. החיצים מצביעים על תאי איחוי חיוביים לדיפוזיה בגזע הלטרלי, והכוכבית מציינת את מיקום האיחוי התקין.

עם זאת, עוברים שהוזרקו להם RNA דו-גדילי נגד diffusion מראים כישלון בחיבור הענפים, וחלבוני diffusion אינם נוכחים בתאי החיבור. המשולש מציין את אתר הכישלון בחיבור הענפים כאשר עוברים שהוזרקו להם RNA דו-גדילי התפתחו לשלב הזחל. הזחלי G-F-P-R-N AI מראים חיבור תקין של ענפי קנה הנשימה, כפי שמסומן בכוכבית.

מצד שני, זחלי ה-diffusion RN AI הפגינו כישלון בחיבור הענפים, כפי שמסומן באמצעות משולשים. תוצאות אלו מדגימות את ההשפעה של השתקה (knockdown) של ביטוי הגן האנדוגני diffusion באמצעות הזרקת RNA דו-גדילי לעוברי דרוזופילה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשמיד את כל עוברי ה-enseal blaster לאחר התפתחותם.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לבחון את תפקידם של גנים חדשים בפיתוח איברים ב-drosophila. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע knockdown לגנים אנדוגניים על ידי הזרקת double stranded RNA לעוברים של drosophila.