Name: ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למדו ניתוח פונקציה של GTPases קטנים בתאים אפיתל מקוטרים באמצעות מיקרו-הזרקת פלסמידים. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות ראשוניות של חלבונים עם מינימום השפעות משניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM070736) ל ח Fölsch. SF אנג נתמכה על ידי בפרס STAR * מלגות לתארים מתקדמים, ו-RS קאנג נתמכה על ידי בסיס תאית ומולקולרית של תכנית אימונים מחלות (GM8061)

1. בידוד של DNA פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רעלן פנימי ללא סיגמא אולדריץ maxiprep ערכה להכנת דנ"א רעלן פנימי חינם על פי פרוטוקול של היצרן. ערכה זו עובדת בשבילנו, כי זה אמין מסירה את כל ההכנות אנדוטוקסינים מ-DNA. אנדוטוקסינים כי מוזרקים עם ה-DNA לתוך גרעין התא יגרום למוות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl פנול / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) ל-DNA מערבולת מבודדים, ספין דקות 1 ב 13,000 סל"ד ב microcentrifuge Eppendorf. מעבירים את השלב העליון מים לתוך צינור חדשה ולהוסיף 100 כלורופורם μl / isoamylalcohol (24:1), מערבולת ספין לעיל. מעבירים את המים בשלב העליון המכיל את ה-DNA כדי צינור חדש. צעד זה נחוץ כדי להסיר כל חלבון ה-DNA, אשר מונע סתימת המחט microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת Acetate Na (pH 6.0) לריכוז סופי של 300 מ"מ ו - 2 X אתנול כרך 100%. דגירה ב -20 ° C במשך הלילה. ספין DNA עבור 20 דקות בסל"ד 13,000 ב microcentrifuge Eppendorf, לשטוף פעם אחת עם 70% אתנול, ו resuspend רעלן פנימי ב-free 300 μl מים (סיגמא אולדריץ '). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז ה-DNA. ריכוז ה-DNA טיפוסי טווחי 1-5 מיקרוגרם / μl. </li></ol> 2. התרבות של תאים MDCK <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים MDCK. ספירת תאים וזרעי 4 X 10 5 תאים על 12 מ"מ מסננים ברור Transwell (0.4 מיקרומטר גודל הנקבוביות, קורנינג שחקן המשנה, 3460). עבור ניסוי הכולל הזרקת מדומה מלאה שני חלבונים שונים ראב מוטציה אתה צריך זרע שלושה מסננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים MDCK במדיום ממ עם 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.1 מ"ג / מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין ו -7% (כרך / כרך) בסרום שור העובר (= התקשורת ממ צמיחה) בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת בתא basolateral מדי יום. זה מסייע בתהליך הקיטוב, כי זה מחקה את המצב של תאים אפיתל בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ימים שלאחר זריעת לבדוק מיקרוסקופ אם התאים צומחים בשכבה סגור. אם לא ניתן לזהות כל החורים monolayer, לבצע את הניסוי ביום 3. אם יש עדיין חורים, לבצע את הניסוי ביום 4. </li></ol> 3. Microinjection נוהל הודעה הזרקת Incubations <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי להכין 5 ממ מ"ל צמיחה מדיה פלוס 50 mM HEPES באחד צלחת 60 מ"מ x 15 עבור כל מסנן ומקום לתוך 39 ° C חממה. בנוסף, הקימו באר אחת של צלחת 12-היטב עם 1 מ"ל התקשורת ממ צמיחה פלוס 50 HEPES מ"מ ו 0.1 מ"ג / מ"ל ​​cycloheximide לכל לסנן, מקום לכדי 31 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ microinjection שלך התפאורה מחומם שלה 39 ° C. אנו משתמשים במיקרוסקופ הפוכה (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc) עם במה מחוממת, מטרות 10X ו 32x, ו Femtojet Eppendorf (Injectman NI2). לבסוף, לפתוח את גז חנקן טנק שמספק את שולחן אוויר עם חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל DNA עם מים מסוננים (0.2 מיקרומטר להשתמש במסנן) לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל ​​בנפח כולל של 10-100 μl. לאחר מכן, ספין-DNA microcentrifuge Eppendorf בסל"ד 13,000 למשך 30 דקות. הסרת החלק העליון מקום בצינור חדש. צעד זה מבטיח כי בעת טעינת ה-DNA שלך המדולל לתוך המחט microinjection אתה יכול לטעון DNA בצורה מדויקת "נקי". ה-DNA שלך מוכן כעת microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת התאים על ידי לקיחת לסנן החוצה הראשון של צלחת תרבותה. בעזרת להב כירורגי (Blade נוצה כירורגי, נירוסטה, לא 11), לחתוך את מסנן מבעל המקום לסנן לתוך 5 מ"ל, 39 ° C חם צמיחה התקשורת ממ פלוס 50 HEPES מ"מ (60 x 15 מ"מ צלחת). להכביד את המסנן בצלחת תרבות בלהב כירורגי השתמשת לחיתוך זה. מניחים אותו על כזה מסנן את החור של להב כירורגי המקיף את האמצעי של המסנן. מניחים צלחת התרבות שלך לבמה מחומם של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 2-3 μl של ה-DNA שלך מדולל (בקידוד זה מקרה פלסמידים VSVGts045-GFP = שליטה מדומה הזרקה) לתוך מחט microinjection (Femtotip השנייה, Eppendorf, 930000043), לסובב את מכסה המגן של המחט ולתת לו ליפול על הרצפה . כעת המחט הוא מוכן להיות מוברג לתוך המחזק שלו. לשם כך, לחץ על מקש התפריט של injectman כדי לוודא את השסתום נסגר. בורג את המחט לתוך המחזק שלו, צריך להיזהר לא לדפוק את המחט חזק מדי כמו שעלולות להוביל שבירה. כעת, לחץ על מקש התפריט שוב, P ליישם ג תמנע מדיה נשאב לתוך המחט במהלך ההליך microinjeciton. לבסוף, ברז ג'ויסטיק שלך למחוק ביות מאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוריד את המחט על גבי התאים, להשתמש המטרה 10X ולהביא את המחט לתוך קרן האור מעל הנוזל. עכשיו להתמקד בתאים, להביא את הפוקוס שוב על ידי סיבוב גלגל פוקוס 180 מעלות למעלה, למצוא את המחט. לאחר מכן, לאט להזיז מחט לתוך להתמקד, ואז להביא מתוך התמקדות שוב (עובדים לקראת הבאת את התאים לתוך להתמקד שוב), להפיל מחט לתוך עבורcus שוב. חזור על הפעולה עד שהמחט נוגעת את פני השטח של התקשורת, ובשלב זה כל מה שאתה רואה זה הילה. כאשר אתם מגיעים לנקודה שבה התאים הם בפוקוס, אבל המחט היא עדיין מטושטשת (כלומר מן המטוס מוקד) שינוי המטרה 32x והגדרות גס בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת Z-להגביל ידי נגיעה קרום apical עם קצה המחט ואת הפחתת כ -10 מיקרומטר כמו הגרעינים מניחים כ 10 מיקרומטר מתחת קרום apical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתגדיר את מגבלת-z, למצוא את הלחץ הנכון זריקה. התחלה ב 95 PSI. אם הלחץ גבוה מדי, התאים שלך יתפוצץ. אם הלחץ שלך הוא נמוך מדי, תראו נקודה לבנה שנשאר, אבל שום דבר אחר לא קורה. עם זריקה מוצלחת, תראה שינוי פאזה ללא שינוי גודל התא. עבור הזריקה, להביא את המחט כמה מיקרונים מן המטוס מוקד כמה שיותר מהר. מטרת עם המחט מעל הגרעין (כלומר באמצע תא יחיד), ולחץ על כפתור הזריקה של הג'ויסטיק שלכם, אבל לא לחיצה ארוכה על לחצן למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 100-500 תאים בתוך החור של להב כירורגי שלך שוכב על התאים שלך. כשתסיים, במקום בתאים שלך עם המנה תרבות להב כירורגי לתוך 39 ° C האינקובטור, דגירה של 2 ח במהלך תקופה זו, VSVGts045-GFP מתבטא מופרש לתוך חדר המיון. עם זאת, 39 ° C, VSVGts045-GFP לא יכול להתקפל כראוי ולכן לא יכול לעזוב את חדר המיון. בינתיים, GTPase קטן של הריבית להצטבר cytosol של שיתוף הזרקת ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, במקום התאים שלך לתוך 1 מ"ל התקשורת ממ צמיחה פלוס 50 HEPES מ"מ ו 0.1 מ"ג / מ"ל ​​cycloheximide בצלחת 12-באר ו דגירה עבור 2 שעות ב 31 ° C. במהלך תקופה זו מרדף, VSVGts045-GFP יהיה לקפל כראוי, לעזוב את ER ו מועבר פני התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.10 עבור מסנני שני (להזריק פלסמידים קידוד VSVGts045-GFP ו-V5 למשל מתויג Rab13T22N) ושלושה (להזריק פלסמידים קידוד VSVGts045-GFP ו-V5 למשל מתויג Rab13Q67L). כל זריקה ייקח בערך 20-60 דקות. עם זאת, חשוב בהחלט להתייחס בכל דרך לסנן אותו לאורך כל המשמרת incubations טמפרטורה מכתים פני השטח עד שאתה לתקן את התאים. לאחר קיבוע, אתה יכול לבצע את שאר פרוטוקול מכתים שלך כל המסננים באותו זמן. </li></ol> 4. Surface מכתים לניתוח immunofluorescence שים לב, כדי למנוע הלבנת של האות של ה-GFP VSVGts045-GFP, להגן על דגימות מן האור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום במהלך כל ההליכים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ברצונך לבצע מכתים השטח, המקום התאים בצלחת תרבות לצלחת מתכת על הקרח ולשטוף תאים 1X עם קרח קר PBS 2 + (PBS [0.2 גר '/ ליטר KCl, 0.2 גר' / ליטר KH 2 PO 4 שלך, 8 גר '/ ליטר NaCl, ו 2.17 גר' / ליטר Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] בתוספת 0.1 גר '/ ליטר CaCl 2 ו - 0.1 גר' / ליטר MgCl 2 x 6 H 2 O). לאחר מכן, מקום 30 μl של נוגדן זה מזהה את ectodomain של החלבון שלך, במקרה זה את העכבר נוגדן חד שבטי TK1 (IgG 1, המתקבל המנוח תומס קרייס), על parafilm נקי דגש על צלחת המתכת על הקרח. הנח את המסנן עם תאים שלך הפוך על ירידה ולהוסיף כמה טיפות של נוגדן על הישבן של המסנן. דגירה עבור h 1 על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים המקום לתוך צלחת 12-באר, לשטוף 3X עם קרח קר PBS 2 + (או RT חם PBS 2 + ללא מכתים לפני השטח), ולתקן עם paraformaldehyde 3% עבור 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעם עם PBS 2 + ולהשאיר ב PBS 2 + דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים חסימת / חיץ permeabilization (גוש הפרמטרים BPB) (2% [wt / כרך] BSA, 0.4% [wt / כרך] saponin ב PBS 2 +) עם 10% [כרך / כרך] בסרום עז. דגירה 1 ש 'ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים העיקרית לזהות הביעו ראב GTPase, בדוגמה זו אנטי V5 (עכבר חד שבטיים נוגדנים IgG 2a, Invitrogen), 1:200 של גוש הפרמטרים BPB. ספין נוגדנים מדולל microcentrifuge Eppendorf במשך 10 דקות בסל"ד 13,000. מקום 30 μl של הפתרון נוגדן על parafilm נקי להציב בחדר רטוב. מניחים את התאים על מסנן הפוך על ירידה נוגדנים ואת דגירה של 1 ש 'ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום התאים בחזרה (עד צד ימין) לתוך צלחת 12-היטב ולשטוף 5X מעל 30 דקות עם גוש הפרמטרים BPB ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל משני נוגדנים מתאימים, עז במקרה זה אנטי עכבר IgG 1 אלכסה 594 שכותרתו (עבור VSVG זיהוי על פני השטח, Invitrogen), ו Cy5 שכותרתו נוגדנים משני להכיר GTPase ראב שלך, עז זה למשל אנטי עכבר IgG 2a Cy5 שכותרתו (ImmunoResearch ג'קסון), 1:200 לתוך גוש הפרמטרים BPB ספין לעיל. מקום 30 μl פתרון נוגדן על parafilm נקי בחדר רטוב ותאי מקום על הפוך מסנן מטה אל טיפת נוגדן. דגירה 1 ש 'ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים תאים 3X מסנן למים מקום deionized ו rבצד מעלה ight על microslides. הוסף 10-15 הר μl (10% [wt / כרך] DABCO, 50% [wt / כרך] גליצרול במים מזוקקים) על גבי התאים. 18X18 מ"מ מקום לכסות מיקרו זכוכית על גבי ושימוש ברקמות הפנים בעדינות העיתונות זכוכית לכסות מיקרו על התאים. חותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות במיקרוסקופ confocal. השתמשנו LSM Microsystem 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc אשר היה מצויד עדשה 63X טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת דמויות, להתאים ולשלב תמונות באמצעות תוכניות כגון Adobe Photoshop ו - Adobe Illustrator. </li></ol> 5. נציג תוצאות לדוגמאות על אופן שיתוף ביטוי GTPases קטן מפריע VSVG מיון חביב מתייחסים מאמרים שפורסמו עבור missorting או apical 3, 4 או עיכוב משלוח פני 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. בשנת הזרקת מעושה, כלומר זריקה של קידוד רק פלסמיד VSVGts045-GFP, החלבון מועבר אל פני השטח basolateral היטב מקוטב תאים MDCK כמו להישפט על ידי צביעת השטח (באדום, איור 1). שים לב שלא כל VSVGts045-GFP מועברת הממברנה basolateral במהלך מרדף על 31 מעלות צלזיוס כפי שמעידים האות תאיים נרחב החלבון הכולל (בירוק, איורים 1 A ו-B). בתאים שאינם היטב מקוטב VSVGts045-GFP תימסר גם הממברנה apical (איור 1 ב '). אם דגימות השליטה שלך נראים כמו התא B באיור 1, אתה לא יכול לסמוך על הנתונים יש לחזור על הניסוי עם יותר מקוטב תאים. ברים הם סולם 5 מיקרומטר.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
<li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li>
<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השלבים הקריטיים ביותר עבור ניסוי מוצלח microinjection הם איכות וטוהר של ה-DNA ואת הקוטביות של התאים שלך. ללא תאים מקוטב, שליטה זריקה שלך כבר mistargeted VSVG ואת הניסוי לא ניתן להשתמש. אם ה-DNA הוא באיכות ירודה, ה-DNA עשויה להדביק את מחט הזריקה המוביל עניים או כל ביטוי של החלבון הרצוי כלל. כמו כן, מומלץ להשתמש פלסמידים ביטוי ידועים להוביל רמות ביטוי גבוה כגון pRKV. אם אתם רוצים לבדוק למיון של חלבונים מטען אחר, מש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Axiovert 200 מיקרוסקופ עם שלב מחומם </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> סדר מותאם אישית </td></tr><tr><td> Injectman NI2 micromanipulator Femtojet </td><td> Eppendorf </td><td> סדר מותאם אישית </td></tr><tr><td> Femtotips II (מחטים Microinjection) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader טיפים </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> נקה 12 מ&quot;מ transwell לסנן תומך </td><td> קורנינג שחקן המשנה </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> רעלן פנימי ללא ערכת פלסמיד maxiprep </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

ניתוח פונקציה של gtpases קטנים על ידי microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

תאים אפיתל לקטב הממברנה הפלסמטית שלהם לתוך תחומים apical ו basolateral ביוכימית וברור תפקודית שם תחום apical פניהם &#39;חינם&#39; משטחים את הממברנה basolateral נמצא במגע עם המצע לבין תאים שכנים. שני תחומים מופרדים על ידי קרום צמתים הדוקים, המהווים מחסום דיפוזיה. Apical-basolateral קיטוב ניתן סיכם בהצלחה בתרבות כאשר לתאי האפיתל כגון כליה מדין-דארבי כלב (MDCK) התאים זורעים בצפיפות גבוהה על מסנני פוליקרבונט בתרבית במשך כמה ימים 1 2. הקמה ותחזוקה של הקוטביות בתא מוסדר על ידי מערך של GTPases קטן superfamily ראס כגון RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ו Rab13 3 4 5 6 7. כמו כל החלבונים האלה GTPases מחזור בין המדינה התמ&quot;ג הנכנס פעילים מדינה פעיל GTP הנכנס. מוטציות ספציפיות באזורים מחייב נוקלאוטיד להפריע זה רכיבה על אופניים 8. לדוגמה, Rab13T22N נעול לצמיתות בצורה תוצר ועל כך לכינוי &quot;דומיננטי שלילי&quot;, בעוד Rab13Q67L כבר לא יכול hydrolyze GTP ו נעול ולכן במצב &quot;פעיל דומיננטי&quot; 7. כדי לנתח את תפקידם בתאים אללים דומיננטי פעיל הן שליליות הדומיננטי של GTPases באים לידי ביטוי בדרך כלל ברמות גבוהות להפריע לתפקוד של חלבונים אנדוגניים 9. דרך אלגנטית להשיג רמות גבוהות של overexpression בסכום זמן קצר היא להציג את פלסמידים קידוד החלבונים הרלוונטיים ישירות לתוך הגרעינים של תאים בוגרים מקוטב על מסנן תומך באמצעות טכניקה microinjection. זה לעתים קרובות בשילוב עם הזרקת המשותפת של פלסמידים כתב המקודדים קולטנים הממברנה הפלסמטית כי ממוינות במיוחד לתחום apical או basolateral. המטען משמש לעתים קרובות כדי לנתח מטען מיון לתחום basolateral הוא אלל טמפרטורה רגיש של גליקופרוטאין וירוס שלפוחי stomatitis (VSVGts045) 10. חלבון זה לא יכול להתקפל כראוי על 39 מעלות צלזיוס, ובכך להישמר ב reticulum endoplasmic (ER), ואילו חלבון הרגולציה של הריבית התאספו cytosol. לעבור 31 מעלות צלזיוס לאחר מכן לאפשר VSVGts045 להתקפל כראוי, לעזוב את ER ולנסוע הממברנה פלזמה 11. מרדף זו מבוצעת בדרך כלל בנוכחות cycloheximide למנוע סינתזת חלבון נוספת מובילה לתוצאות הניקוי. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את ההליך של microinjecting פלסמידים לתאים מקוטב incubations העוקבים לרבות משמרות טמפרטורה המאפשרים ניתוח מקיף של חלבונים רגולטוריים המעורבים מיון basolateral.

מאמר זה מפרט את ההליכים הכרוכים overexpression וניתוח של GTPases קטן בתאי האפיתל מקוטב באמצעות טכניקה microinjection.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

תאי אפיתל מקטבים את ממברנת הפלזמה שלהם לאזורים אפקליים ובסולטרליים, הנבדלים זה מזה מבחינה ביוכימית ותפקודית, כאשר האזור האפקלי פונה ל...

פרוצדורה זו בוחנת את ההשפעות של small GTP ACEs על תעבורת ממברנה מקוטבת. ראשית, הזרק במקביל פלסמידי DNA המקודדים את ה-small GTP ACE ואת חלבוני הדגמי (reporter proteins) לתוך גרעיני תאים של תאים מקוטבים. לאחר מכן, בצע ביטוי של ה-DNA בטמפרטורות שיעצרו את חלבוני הדגמי ברשתית התוך-פלזמית (endoplasmic reticulum) או ב-TGN, בעוד ה-small GTPA מצטבר בציטוזול; המשך במעקב (chase) אחר חלבון הדגמי אל פני השטח של התא בנוכחות cyclo heide כדי למנוע סינתזת חלבונים נוספת.לבסוף, סמנו את חלבון הדגגל על פני השטח של התא לצורך ניתוח אימונופלורסצנציה. תוצאות המתקבלות מבדיקה זו מאפשרות ויזואליזציה של השינוי במיקום על פני השטח באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנספקציה הוא שבמהלך זמני ביטוי-יתר הקצרים המושגים באמצעות מיקרו-הזרקה, אפקטים משניים הם מינימליים, מה שמאפשר לנו לחקור את האפקטים הראשוניים של החלבונים הנבדקים.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום קוטביות התא, כגון האופן שבו gtpa קטן מווסת תעבורה ממברנלית מקוטבת. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את השלבים הבודדים הדרושים למיקרו-הזרקה מוצלחת קשה להסביר ללא עזר חזותי. בודדו DNA של פלסמיד נקי מאנדוטוקסינים באמצעות ערכת Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep בהתאם לפרוטוקול היצרן. עבור ניסוי זה, השתמשו בשלושה מסנני Transwell שקופים של 12 מילימטר עם גודל נקבים של 0.4 µm לתרבית.מניחים ארבע פעמים 10 של תאי MDCK חמישיים על כל מסנן. לאחר יומיים, בוחנים את התרבית תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים גדלים בשכבה אחת סגורה (monolayer). להזרקה מיקרוסקופית.ביום ההזרקה המיקרוסקופית (microinjection), הכין פלטות של 360 על 15 מילימטר עם חמישה ליטרים של מצע גידול MM בתוספת 15 מילימטר heis והנח אותן באינקובטור בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס. בנוסף, הכין שלוש פלטות בעלות 12 בארות עם מיליליטר אחד של מצע גידול MEM בתוספת 50 millimolar heis ו-0.1 מיליגרם למילליטר cycloheximide, והנח אותן באינקובטור בטמפרטורה של 31 מעלות צלזיוס. הפעל את מיקרוסקופ ההזרקה המיקרוסקופית, הגדר את המיקרוסקופ ההפוך עם במה מחוממת, עדשות אובייקטיביות של 10x ו-32x, ומערכת einor femto jet.הגדירו את הבמה המחוממת ל-39 °C. פתחו גם את אספקת מיכל גז החנקן לשולחן האוויר. כעת, דללו את ה-DNA במים מסוננים לריכוז סופי של 0.2 mg/mL.לאחר מכן, סובב את ה-DNA במיקרו-צנטריפוגה ב-13,000 RPM למשך 30 דקות. הסר את החלק העליון והעבר אותו למבחנה חדשה. לאחר מכן, הכן את תאי ה-MDCK על ידי הוצאת המסנן הראשון מתוך צלח התרבית באמצעות להב נישור, גזור את המסנן מתוך תומך המסנן והנח אותו בתוך פלטה מוכנה של 60 על 15 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר של מצע גידול MEM מחומם ל-39 מעלות צלזיוס בתוספת 50 מילימולר heis.כדי להכביד על המסנן בצלחת התרבית, הניחו את הלהב הכירורגי במרכז המסנן ולאחר מכן העבירו את צלחת התרבית אל הבמה המחוממת של המיקרוסקופ. טענו 2-3 µL של ה-DNA המדולל לתוך מחט למיקרו-הזרקה. סובב את כיסוי ההגנה של המחט והניחו לו ליפול לרצפה.כדי להציב את המחט במחזיק, לחצו על מקש התפריט של המזרק וודאו שהשסתום סגור. הבריגו את המחט לתוך המחזיק שלה. היזהרו לא להבריג את המחט חזק מדי.מכיוון שדבר זה עלול להוביל לשבירה, לחץ שוב על מקש התפריט. כך, לחץ הפיצוי המופעל ימנע מהמדיום להישאב לתוך המחט במהלך הליך המיקרו-הזרקה. לבסוף, הקש על הג'ויסטיק כדי למחוק את הגדרות ה-homing השמורות ולהוריד את המחט אל התאים.השתמש בעדישה עם הגדלה של 10x והבא את המחט אל תוך קרן האור מעל הנוזל. כעת התמקד בתאים. בצע מיקוד למעלה שוב על ידי סיבוב גלגל המיקוד ב-180 מעלות כלפי מעלה ואתר את המחט.הביאו את המחט למיקוד באופן איטי. לאחר מכן, הוציאו אותה שוב מהמיקוד. עבדו לקראת הבאת התאים למתח מיקוד שוב.הביאו שוב את המחט למיקוד. חזרו על הפעולה עד שהמחט תיגע בפני השטח של המצע, נקודה שבה נצפה הילה. המשיכו עד להגעה לנקודה שבה התאים נמצאים במיקוד, אך המחט עדיין מטושטשת מחוץ למישור המיקוד.כעת עברו לעדשה עם הגדלה של 32x ובצעו כיוונון גס. הגדירו את גבול ה-Z על ידי נגיעה בממברנה האפיקלית עם קצה המחט והחסרת כ-10 micrometers. זאת כיוון שהגרעינים שוכנים בעומק של כ-10 micrometers מתחת לממברנה האפיקלית.כעת הוציאו את המחט מספר מיקרונים ממישור המוקד במהירות המקסימלית. כוון את המחט מעל הגרעין, לחצו ושחררו את כפתור ההזרקה של הג'ויסטיק. התחילו ב-95 PSI כדי למצוא את לחץ ההזרקה המתאים.אם הלחץ גבוה מדי, התאים מתפוצצים. אם הלחץ נמוך מדי, נקודה לבנה נשארת, אך שום דבר אחר לא קורה. בצעו הזרקה מוצלחת הכוללת שינוי פאזה ללא שינוי בגודל התא.הזריקו 100 עד 500 תאים לתוך החור של הלהב הכירורגי המונח על התאים. לאחר מכן, הניחו את התאים יחד עם צלחת התרבית והלהב הכירורגי בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 39 °C והדגריו למשך שעתיים. לבסוף, העבירו את התאים לפלטת 12 בארות מוכנה המכילה 1 ml של MEM בתוספת 50 mM של 0.1 mg/mL cycloheximide והדגריו למשך שעתיים בטמפרטורה של 31 °C.כדי למנוע הלבנה (bleaching) של אות ה-GFP המבוטא, הגנו על הדגימות מאור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום במהלך כל ההליכים הבאים לצביעת פני השטח. הניחו את התאים, בתוך צלחת תרבית, על פלטת מתכת בקרח ובצעו שטיפה אחת עם PBS++ קר מאוד. הניחו פיסת פאראפורם (paraform) נקייה על פלטת המתכת שבקרח, וטפטפו באמצעות פיפטה טיפות של 30 µL של נוגדן המזהה את הדומיין החיצוני (ecto domain) של החלבון הנחקר.כעת הניחו את המסנן המכיל את התאים כשהוא הפוך על הטיפה, והוסיפו מספר טיפות של נוגדן על גבו של המסנן. דגרו למשך שעה אחת על קרח. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS++ קר מאוד וקבעו אותם עם 3% paraformaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.המשיכו לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS plus plus והמתינו חמש דקות להשגת שיווי משקל ב-PBS plus plus. כעת הדגירו את התאים בבופר חסימה חדיר (blocking permeable buffer). הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, דללו נוגדנים ראשוניים ביחס של 1:200 ב-BPB כדי לזהות את RAB GTP ACE המבטא, סובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-13,000 RPM והעבירו באמצעות פיפטה 30 µL של תמיסת הנוגדנים על גבי זכוכית נקייה המונחת בתא לחות.הניחו את התאים על המסנן, כשהם פונים כלפי מטה, על טיפות הנוגדנים והדגירו למשך שעה אחת. בטמפרטורת החדר, החזירו את התאים למצב זקוף לתוך פלטת 12 בארות ושטפו חמש פעמים במשך 30 דקות עם BPB בטמפרטורת החדר, לאחר הדגרה עם נוגדנים שניים מתאימים, כולל שלב שטיפה.טבול את התאים שעל המסנן שלוש פעמים במים דה-יוניים והנח אותם עם הצד הימני כלפי מעלה על שקופיות מיקרוסקופ עם 10 µL של חומר קיבוע. הנח זכוכית כיסוי מיקרוסקופית בגודל 18 על 18 מילימטר למעלה, ובעזרת נייר סופג לחץ בעדינות את זכוכית הכיסוי על התאים. לבסוף, אטום בעזרת לק. בהזרקה מדומה של הפלסמיד המקודד ל-V-S-V-G-T-S-O 45 GFP בלבד, החלבון מועבר למשטח הבזולטרלי של תאי MDCK מקוטבים היטב, כפי שניתן לראות לפי הצביעה האדומה של המשטח בתאים שאינם מקוטבים היטב.חלק מחלבון היתוך ה-GFP יגיע לממברנה האפיתלית. אם דגימות הביקורת נראות כך, לא ניתן להסתמך על הנתונים ויש לחזור על הניסוי עם תאים בעלי קיטוב טוב יותר. שימו לב שלא כל חלבון היתוך ה-GFP המבוטא מגיע לממברנה הבסולטרלית במהלך המרדף בטמפרטורה של 31 °C, כפי שמעיד האות הירוק התוך-תאי הנרחב עבור החלבון הכולל. לאחר השליטה בטכניקה, היא אמורה לארוך כ-10 עד 12 שעות לאחר פיתוחה.טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תעבורת ממברנות לבחון חלבוני בקרה בתאים אפיתליאליים מקוטבים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ביטויי החלבונים בתאים אפיתליאליים מקוטבים באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה.

analyzing-function-small-gtpases-microinjection-plasmids-into

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הזרקה ישירה של intranuclear cDNA היא טכניקה יעילה transfection שלאחר mitotic תאים. שיטה זו מספקת רמות גבוהות של ביטוי חלבון מן Heterologous בונה cDNA בודדות או מרובות ומאפשר תפקוד החלבון להיחקר בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עם מגוון רחב של מבחני תא בודד.

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

שיטה לשליטה במרחב ובזמן פעילות GTPase קטן לאור המתואר. שיטה זו מבוססת על heterodimerization FKBP-FRB rapamycin הנגרמת צילום-caging מערכות. אופטימיזציה של הקרנת אור מאפשר הפעלה מבוקרת spatio-temporally של GTPases קטנים ברמה subcellular.

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

טכניקה גנטית כדי לתמרן בתוך כל תאי...

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

מצגת זו מדגימה שיטה לפיה אלקטרופורציה של תאים דבקים ומתורבתים משמשת לחקר תקשורת בין-תאית, צומתית, בעוד התאים גדלים על שקופית המצופה בתחמוצת אינדיום-בדיל מוליכה ושקופה.

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

פרוטוקול זה משווה את הזיקות היחסיות של שותפים מחייבים ל-GTPases ממשפחת Rho, כולל Rac1. in vivo, חלבונים קושרים Rac1 מתחרים על ממשק מחייב יחיד, שהקונפורמציה שלו מוכתבת על ידי נוקלאוטיד קשור. הנוקלאוטיד חשוב וקשה לשליטה בניסוי, בשל קצב ההידרוליזה הגבוה.

השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

אנו מתארים שיטה לניסויי הצלת דלדול המשמרת את שלמות התא ואת הומאוסטזיס החלבון. אדנופקציה מאפשרת ניתוחים פונקציונליים של חלבונים בתוך תהליכים ביולוגיים המסתמכים על דינמיקה מבוססת אקטין מכווננת היטב, כגון חלוקת תאים מיטוטיים ומיוגנזה, ברמת התא הבודד.

Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

כאן נתאר פרוטוקול לחקור את prenylation ואת guanosine-5'-טריפוספט (GTP)-טעינה של GTPase רו. פרוטוקול זה מורכב משתי שיטות מפורט, כלומר assay ממברנה fractionation ו- immunosorbent של GTPase-מקושרים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את prenylation ואת GTP העמסת שונים GTPases קטנים אחרים.

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

למדו ניתוח פונקציה של GTPases קטנים בתאים אפיתל מקוטרים באמצעות מיקרו-הזרקת פלסמידים. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות ראשוניות של חלבונים עם מינימום השפעות משניות.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

גלה סרטונים נוספים