ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

הליך זה בודק את ההשפעות של GTP ACE קטנים על סחר בממברנות מקוטבות. ראשית, הזרקת פלסמידים של DNA המקודדים את ה-GTP ACE הקטן ואת החלבונים המדווחים לגרעיני תאים מקוטבים. לאחר מכן מבטאים את ה-DNA בטמפרטורות שיעצרו את חלבוני המדווח ברטיקולום האנדופלזמי או ב-TGN בזמן שה-GTPA הקטן מצטבר בציטוזול, המשיכו לרדוף אחר החלבון המדווח אל פני התא בנוכחות ציקלו היידה כדי למנוע סינתזת חלבון נוספת.

לבסוף, סמן את חלבון המדווח על פני התא לניתוח אימונופלואורסצנטי. תוצאות המתקבלות מבדיקה זו מאפשרות הדמיה של השינוי בלוקליזציה של פני השטח באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו trans transfect הוא שבמהלך הזמנים הקצרים של ביטוי יתר המושגים בהזרקת מיקרו, ההשפעות המשניות הן מינימליות, מה שמאפשר לנו לחקור את ההשפעות העיקריות של החלבונים המעניינים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום קוטביות התא, כגון כיצד gtpa קטן מווסת סחר בממברנה מקוטבת. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה להסביר את השלבים האישיים הדרושים להזרקת מיקרו מוצלחת ללא עזר חזותי בודד DNA פלזמה נטול אנדוטוקסין עם ערכת ההכנה של סיגמא אולדריץ' ללא אנדוטוקסין על פי פרוטוקול היצרן. לניסוי זה, השתמש בשלושה מסנני טרנסוול שקופים של 12 מילימטר בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר לתרבית.

התאים יושבים ארבע פעמים 10 מתאי ה-MDCK החמישיים על כל מסנן. לאחר יומיים יש לבחון את התרבית במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים גדלים בשכבה חד-שכבתית סגורה. למיקרו-הזרקה.

ביום המיקרו-הזרקה, הכינו צלחות בגודל 360 על 15 מילימטר של מצע גידול של חמישה ליטר MM בתוספת 15 מילימטר heis והניחו אותם באינקובטור של 39 מעלות צלזיוס. בנוסף, הכינו שלוש צלחות של 12 בארות של מצע גידול MEM אחד של מיליליטר בתוספת 50 מילי-מולארי, ו-0.1 מיליגרם למיליליטר ציקלוהקסימיד והניחו אותן באינקובטור של 31 מעלות צלזיוס. הפעל את מיקרוסקופ ההזרקה, שהוגדר כמו מיקרוסקופ הפוך זה עם מטרות שלב 10 x ו-32 x, וסילון einor femto.

הגדר את השלב המחומם ל -39 מעלות צלזיוס. פתח גם את אספקת מיכל גז החנקן לשולחן האוויר. כעת יש לדלל את ה-DNA במים מסוננים לריכוז סופי של 0.2 מיליגרם למיליליטר.

לאחר מכן סובב DNA במיקרו צנטריפוגה של איינור במהירות של 13,000 סל"ד למשך 30 דקות. הסר את החלק העליון והניח בצינור חדש. לאחר מכן, הכינו את תאי ה-MDCK על ידי הוצאת המסנן הראשון מצלחת התרבית שלו עם הלהב הכירורגי, חתכו את המסנן ממחזיק המסנן והניחו אותו בצלחת המוכנה בגודל 60 על 15 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר של 39 מעלות צלזיוס מצע גידול MEM מחומם בתוספת 50 מילי-מולארי.

כדי להכביד על המסנן בצלחת התרבית, הנח את הלהב הכירורגי במרכז המסנן ולאחר מכן העביר את לוחית התרבות לשלב המחומם של המיקרוסקופ. טען שניים עד שלושה מיקרוליטרים של ה-DNA המדולל למחט מיקרו-הזרקה. סובב את כיסוי המגן של המחט ותן לו ליפול לרצפה.

כדי למקם את המחט במחזיק, לחץ על מקש התפריט של ההזרקה וודא שהשסתום כבוי. הברג את המחט למחזיק שלה. היזהר לא להבריג את המחט חזק מדי.

מכיוון שהדבר עלול להוביל לשבירה, לחץ שוב על מקש התפריט. כך שלחץ הפיצוי המופעל ימנע מהמדיה להישאב לתוך המחט במהלך הליך המיקרו-הזרקה. לבסוף, הקש על הג'ויסטיק כדי למחוק את הביות המאוחסן כדי להוריד את המחט לתאים.

השתמש במטרה פי 10 והכניס את המחט לקרן האור שמעל הנוזל. עכשיו התמקדו בתאים. התמקד שוב על ידי סיבוב גלגל המיקוד 180 מעלות למעלה ומצא את המחט.

הזז לאט את המחט למיקוד. ואז תוציא אותו שוב מהמיקוד. פועלים לקראת הבאת התאים שוב למיקוד.

הורידו את המחט שוב לפוקוס. חזור על הפעולה עד שהמחט נוגעת במשטח המדיה ובשלב זה נצפית הילה. המשך להגיע לנקודה שבה התאים נמצאים בפוקוס, אך המחט עדיין מטושטשת מחוץ למישור המוקד.

כעת עבור למטרה 32x ומצא את הגדרות המסלול. הגדר את גבול Z על ידי נגיעה בקרום האפיקלי עם קצה המחט והחסרת כ -10 מיקרומטר. מכיוון שהגרעינים מונחים כ-10 מיקרומטר מתחת לממברנה האפיקלית.

עכשיו הוציאו את המחט כמה מיקרונים ממישור המוקד מהר ככל האפשר. כוון עם המחט מעל הגרעין ולחץ ושחרר את כפתור ההזרקה של הג'ויסטיק. התחל ב-95 PSI כדי למצוא את לחץ ההזרקה הנכון.

אם הלחץ גבוה מדי, התאים מתפוצצים. אם הלחץ נמוך מדי, נקודה לבנה נמשכת, אבל שום דבר אחר לא קורה. בצע הזרקה מוצלחת הכוללת שינוי פאזה ללא שינוי גודל התא.

הזרקו 100 עד 500 תאים בתוך החור של להב הניתוח שנמצא על התאים. לאחר מכן מניחים את התאים עם צלחת התרבות ולהב הניתוח לאינקובטור של 39 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך שעתיים. לבסוף, העבירו תאים לצלחת 12 בארות מוכנה של מיליליטר אחד, MEM בתוספת 50 מילי-מולרי 0.1 מיליגרם למיליליטר, ציקלו היידה ודגירה למשך שעתיים בטמפרטורה של 31 מעלות צלזיוס.

על מנת למנוע הלבנה של אות ה-GFP המבוטא, הגן על הדגימות מפני אור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום במהלך כל ההליכים הבאים להכתמת פני השטח. מניחים את התאים בכלי תרבית על צלחת מתכת על קרח ושוטפים. לאחר עם PBS קר כקרח פלוס פלוס, הניחו חתיכה נקייה של פרפורם על לוחית המתכת על פיפטת קרח 30 טיפות מיקרוליטר של נוגדן המזהה את תחום האקטו של החלבון המבוקש.

כעת הנח את המסנן המכיל תאים הפוך על הטיפה והוסף כמה טיפות נוגדן על הצד האחורי של המסנן. דגירה במשך שעה על קרח. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח פלוס פלוס ומתקנים עם 3% אלדהיד פרפורמי למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

המשך לשטוף תאים פעם אחת עם PBS פלוס פלוס ושיווי משקל ב- PBS פלוס פלוס למשך חמש דקות. כעת דגרו על התאים בחסימת מאגר חדיר. דגירה של שעה בטמפרטורת החדר, דלל נוגדנים ראשוניים אחד עד 200 ב-BPB כדי לזהות את הצנטריפוגה המבוטאת RAB GTP ACE למשך 10 דקות ב-13,000 סל"ד פיפטה, 30 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים על פרם נקי המונח בתא רטוב.

מניחים את התאים על המסנן הפוך על טיפות הנוגדנים ודוגרים למשך שעה. בטמפרטורת החדר, הניחו את התאים בצד ימין כלפי מעלה ל-12. ובכן צלחת ושטיפה חמש פעמים במשך 30 דקות עם BPB בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה עם נוגדנים משניים מתאימים, כולל שלב שטיפה.

טבלו תאים על המסנן שלוש פעמים במים נטולי יונים והניחו את הצד הימני כלפי מעלה על מגלשות מיקרו ב-10 מיקרוליטר של תושבת הניחו זכוכית מכוסה מיקרו בגודל 18 על 18 מילימטר מעל ובעזרת רקמות פנים לחצו בעדינות את החלקה על התאים. לבסוף, אטום עם לק בהזרקה מדומה של הפלסמיד המקודד V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. החלבון מועבר למשטח הבסיסי של תאי MDCK מקוטבים היטב כפי שנשפט על ידי צביעת פני השטח האדומים בתאים שאינם מקוטבים היטב.

חלק מחלבון ההיתוך GFP יועבר לממברנה האפיקלית. אם דגימות בקרה נראות כך, לא ניתן לסמוך על הנתונים ויש לחזור על הניסוי עם תאים מקוטבים טובים יותר. שימו לב שלא כל הביטוי לאיחוי GFP מועבר לקרום הבסיסי במהלך המרדף אחר 31 מעלות צלזיוס, כפי שמעיד האות הירוק התוך תאי הנרחב עבור החלבון הכולל לאחר שליטה, טכניקה זו אמורה להימשך כ-10 עד 12 שעות לאחר התפתחותה.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסחר בממברנות לחקור חלבונים רגולטוריים בתאי אפיתל מקוטבים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא חלבונים בתאי אפיתל מקוטבים בטכניקת מיקרו-הזרקה.