השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשוות את הזיקות היחסיות של שותפי קשירת חלבון עבור Row Family GT P ACE בתנאי העמסת נוקלאוטידים מבוקרים בקפידה. זה מושג על ידי טיהור ראשוני של שותפים מחייבים תחרותיים משוערים, שכל אחד מהם מסומן באותו תג, למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP. השלב השני הוא לטהר את ה-GTPA מעניין.

לדוגמה, RAC אחד וטען עם הנוקלאוטיד המתאים כדי להשיג את מצב האיתות הרצוי של GTPA. לאחר מכן, ה-gtpa הטעון בנוקלאוטיד מודגר עם כמות קבועה של מתחרה מחייב אחד וכמויות הולכות וגדלות של מתחרה הקישור השני כדי להשיג עקומת קשירת טיטרציה. השלב האחרון הוא לפתור חלבונים הקשורים ל-GT pase משותק על ידי כתם מערבי ולחקור את הממברנה עבור תג ה-GFP המשותף בין שני השותפים המקשרים.

בסופו של דבר, הכתם המערבי משמש לזיהוי הריכוזים היחסיים שבהם כמויות דומות של כל שותף מחייב מתויג GFP נלכדות על ידי GTPase. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו משקעים משותפים, הוא שתכונות קשירת החלבון של gtpa מוכתבות על ידי הנוקלאוטיד הקשור בתא. הנוקלאוטיד הקשור הוא לא יציב מה שמקשה על פירוש נתוני קשירת החלבון.

התחל בהליך זה עם טיהור של G tpa מתויג GST וביטוי של חלבונים קושרים gtpa כמפורט בפרוטוקול הטקסט. RINs את הצלוחיות של תאים שהועברו במי מלח חוצץ פוספט או PBS ומנקזים את הבקבוק למשך חמש דקות. שואבים את הנוזל החופשי, ואז מגרדים את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה לתוך צינור מיקרו-פוגה, תאים מעורבבים לליזה על ידי היפוך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

במהלך הליזיס יש לשטוף שתי מנות של 40 מיקרוליטר של חרוזי מלכודת GFP שלוש פעמים עם משקעי חיץ ליזה טריים. החרוזים ב -2, 700 פעמים G למשך שתי דקות בין כביסות. לאחר הליזיס, יש להבהיר את הליזאטים על ידי צנטריפוגה ב 21, 000 פעמים G למשך 10 דקות.

העבירו את הליזט המובהר של כל אחד מחלבוני המתחרים לחרוזי מלכודת GFP שטופים נפרדים. אפשר לחלבוני היתוך GFP להיקשר במשך שעתיים, תוך ערבוב על ידי היפוך בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את חרוזי מלכודת ה-GFP הטעונים פעמיים במאגר ליזה ופעמיים בתחרות.

חרוזי שקיעת חיץ מחייבים ב -2, 700 פעמים G למשך שתי דקות בין כביסות. סילוק חלבוני היתוך GFP על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של 0.2 גליצין מולארי ופיפטינג למעלה ולמטה למשך 30 שניות משקעים מיד את החרוזים ב-21,000 פעמים G למשך 60 שניות ומעבירים את הנוזל לצינור פוגה חדש המכיל ארבעה מיקרוליטרים של טריס HCL טוחנת אחת בצע שלב זה במהירות כדי להגביל את הנזק לחלבון המטוהר. נתח מיקרוליטר אחד מכל חלבון מטוהר על ידי כתם מערבי ובדוק עם נוגדן אנטי GFP כדי לקבוע את התפוקה היחסית באמצעות מערכת ספיגה כמותית על פי פרוטוקול היצרן.

השוואת ריכוז החלבון המולרי על ידי הוספת מאגר מחייב תחרות. קח 90 מיקרוליטר של מתלה GST מוכן חרוז אחד ושטוף שלוש פעמים עם מאגר טעינת נוקלאוטידים באמצעות ממיין חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב. שאפו את המאגר מהחרוזים והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר טעינת נוקלאוטידים בהתאם לשאלה אם נדרשת העמסת נוקלאוטידים או ללא העמסת נוקלאוטיד.

לניסוי התחרות, הוסף 12 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי תמ"ג 12 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי GTP גמא S או ללא נוקלאוטיד ל-60 מיקרוליטר של חרוזי מתלה GST עבור בקרות טעינת הנוקלאוטיד. חלקו את החרוזים הנותרים לשלושה קוואט של 10 מיקרוליטר והוסיפו שני מיקרוליטרים של 100 מילי-מולרי תמ"ג, שני מיקרוליטרים של 10 מילי-מולרי GTP, גמא S או ללא נוקלאוטיד לכל צינור. דגרו את תערובות החרוזים למשך 30 דקות בחום של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה.

ייצב את המתלה הקשור לנוקלאוטיד, אחד על ידי הוספת מגנזיום כלוריד מולרי אחד לתערובת הניסוי ותערובות הבקרה כדי לבצע את קשירת התחרות. הגדר שישה צינורות מיקרו פוגה. כל אחד מהם מכיל 200 מיקרוליטר של מאגר מחייב תחרות.

כל צינור צריך להכיל גם 10 מיקרוליטר מהמתלה הטעון בנוקלאוטידים, חרוז אחד וחמישה מיקרוליטר מהמתלה. חלבון קושר אחד A כחלבון קושר קבוע לכל צינור הוסף 0 1 2 0.55, 10 או 20 מיקרוליטר של חלבון קושר אחד B כחלבון הקישור המשתנה. נפחים אלה מניחים ריכוזי מלאי שווים בערך של חלבוני הקישור הקבועים והמשתנים וייתכן שיהיה צורך להתאים אותם.

הרכיבו את הנפח הכולל של תערובת הכריכה ל-235 מיקרוליטר על ידי תוספת של מאגר הכריכה התחרותי. לאחר מכן, הגדר צינור מיקרו פוגה המכיל 200 מיקרוליטר של מאגר התחרות. 10 מיקרוליטר של מתלה ניסיוני טעון נוקלאוטיד, חרוז אחד ו -10 מיקרוליטר של מתלה חלבון קושר אחד A. לאחר מכן הגדר את G-D-P-G-T-P גמא S וללא צינורות בקרת נוקלאוטידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

דגרו את הצינורות במשך שעתיים תוך ערבוב על ידי היפוך בארבע מעלות צלזיוס לאחר הדגירה. שוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם מאגר כריכת התחרות. לבסוף, יש להוציא את החלבונים הקשורים ב-20 מיקרוליטר של מאגר דגימה מפחית.

כתמים מערביים כמותיים של תג GFP של GFP RCC 2 מטוהר ו-GFP Corona בתחום C.Propeller אחד מגלה כי החלבון ברצועה העליונה, GFP RCC 2 נפוץ פי 1.4 מהרצועה התחתונה ויש לדלל אותו כדי להשיג יחס מולארי של אחד לאחד לניסוי התחרות. ניסוי בקרה מדגים כי מצב טעינת הנוקלאוטידים של מתלה אחד מכתיב את ספציפיות הכריכה, טיטרציה של נפחים הולכים וגדלים של GFP RCC שתיים כנגד נפח קבוע של GFP Corona שווה ערך בתחום מדחף C אחד וספיגה. החלבונים הנקשרים למתלה אחד מאפשרים לדמיין שינוי יחסי בחלבון הקשור תוך התוויית עוצמות פס ה-GFP עבור שני המתחרים באותו גרף, וזיהוי הנקודה שבה הקווים מצטלבים, מאפשר לזהות את נפח החלבון הקושר המשתנה בשיווי משקל.

עם זאת, יש להקפיד על כך שנושאים כמו אינטראקציה בין מתחרים או עודף פיתיון gtpa לא יפגעו בניסוי. עלייה במתחרה אחד ללא הפסד של השני כפי שמוצג כאן, מצביעה על בעיה בעת ניסיון הליך זה. חשוב לזכור לבדוק כי קיים יחסי גומלין בין שפע השותפים המחייבים המתחרים.

ישנן מספר בעיות שיכולות לעוות את התוצאות או שניתן לפתור אותן כל עוד הן מזוהות על ידי בדיקת הנתונים.