השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשוות את זיקות הקשירה היחסיות של שותפי קישור חלבוניים ל-Row Family GTPACES תחת תנאי טעינת נוקלאוטידים מבוקרים בקפידה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי טיהור של שותפי קישור תחרותיים פוטנציאליים, כאשר כל אחד מהם מסומן באותו תג, לדוגמה, חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP. השלב השני הוא טיהור ה-GTPA הרלוונטי.

לדוגמה, טענו את RAC 1 עם הנוקלאוטיד המתאים כדי להשיג את מצב איתוול ה-GTPA הרצוי. לאחר מכן, דגרו את ה-gtpa הטעון בנוקלאוטיד עם כמות קבועה של מתחרה קישור אחד וכמויות עולות של המתחרה השני בקישור כדי להשיג עקומת טיטרציה של הקישור. השלב האחרון הוא הפרדה של חלבונים הקשורים ל-GT pase המיובל (immobilized) באמצעות western blot וסריקה של הממברנה עבור תג ה-GFP המשותף לשני השותפים בקישור.

בסופו של דבר, ה-Western blot משמש לזיהוי הריכוזים היחסיים שבהם כמויות דומות של כל שותף קישור מתויג ב-GFP נקלטות על ידי ה-GTPase. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו co-precipitation הוא שתכונות הקישור של החלבון של gtpa נקבעות על ידי הנוקלאוטיד הקשור בתא. הנוקלאוטיד הקשור הוא לבילי, דבר המקשה על פרשנות נתוני קישור החלבון.

התחילו פרוצדורה זו בטיהור של G tpa מתויג GST וביטוי של חלבוני קישור ל-gtpa כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט. שטפו את הבקבוקונים של התאים שעברו טרנספקציה בבופר פוספט סלין (phosphate buffer saline) או PBS ונקזו את הבקבוקון למשך חמש דקות. שאבו את הנוזל החופשי, לאחר מכן גרדו את התאים לתוך מבחנת מיקרוצנטריפוגה ב-500 µL של בופר ליזיס, וערבבו את התאים כדי להביא לליזיס על ידי היפוך בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות.

במהלך שטיפת הליזיס, שטוף שתי מנות של 40 µL של חרוזי GFP trap שלוש פעמים עם תמיסת ליזיס רעננה. שקיע את החרוזים ב-2,700 ×g למשך שתי דקות בין השטיפות. לאחר הליזיס, הבהר את הליזאטים באמצעות סנטריפוגציה ב-21,000 ×g למשך 10 דקות.

העבירו את הליזט המזוכל של כל אחד מחלבוני התחרות לחרוזי GFP trap שטופים ונפרדים. אפשרו לחלבוני היתוך GFP להיקשר במשך שעתיים, תוך ערבוב על ידי היפוך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו את חרוזי ה-GFP trap הטעונים פעמיים בבופר ליזיס ופעמיים בתמיסת התחרות.

שקיעת חרוזיים בבופר קישור ב-2,700 ×g למשך שתי דקות בין השטיפות. אלואציה של חלבוני GFP fusion על ידי הוספה של 40 µL של גליצין 0.2 M וביצוע פיפוט למעלה ולמטה למשך 30 שניות; מיד לאחר מכן יש להשקיע את החרוזיים ב-21,000 ×g למשך 60 שניות ולהעביר את הנוזל למבחנה חדשה המכילה 4 µL של tris HCL 1 M. בצע שלב זה במהירות כדי להגביל את הנזק לחלבון המופרש. יש לנתח 1 µL מכל חלבון מופרש באמצעות western blot ולסמן עם נוגדן anti-GFP כדי לקבוע את התבואה היחסית באמצעות מערכת blotting כמותית, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

השוו את ריכוז החלבון המולרי על ידי הוספה של חוצץ קישור תחרותי. קחו 90 µL של חרוזי GST rack one מוכנים ושטפו שלוש פעמים עם חוצץ טעינת נוקלאוטידים, תוך שימוש במפריד חלקיקים מגנטי לשקיעת החרוזים בכל שלב. שאבו את החוצץ מהחרוזים והוסיפו 100 µL של חוצץ טעינת נוקלאוטידים, בהתאם לצורך בטעינת G-D-P-G-T-P או בהיעדר טעינת נוקלאוטיד.

עבור ניסוי התחרות, הוסף 12 µL של 100 mM GDP, 12 µL של 10 mM GTP gamma S או ללא נוקלאוטיד ל-60 µL של חרוזי GST rack one עבור בקרות טעינת הנוקלאוטידים. פצל את יתר החרוזים לשלוש מנות של 10 µL והוסף לכל מבחנה 2 µL של 100 mM GDP, 2 µL של 10 mM GTP gamma S או ללא נוקלאוטיד. דגור את תערובות החרוזים למשך 30 דקות ב-30 °C עם ערבוב.

ייצבו את הרשת הקשורה לנוקלאוטיד על ידי הוספה של מגנזיום כלוריד בריכוז של מולרי אחד לתערובת הניסוי ולתערובות הביקורת כדי לבצע את קישור התחרות. הכינו שש פרועות מיקרו-צנטריפוגה, שכל אחת מהן מכילה 200 microliters של חוצץ לקישור תחרותי.

כל מבחנה צריכה להכיל גם 10 µL מהרק המוטען בנוקלאוטידים, חרוזים אחד וחמישה µL מהרק. חלבון קישור A אחד כחלבון קישור קבוע לכל מבחנה; הוסף 0, 1, 2, 0.55, 10 או 20 µL מרק חלבון קישור B אחד כחלבון הקישור המשתנה. נפחים אלו מניחים ריכוזי מלאי שווים בקירוב של חלבוני הקישור הקבוע והמשתנה, וייתכן שיהיה צורך להתאימם.

השלם את הנפח הכולל של תערובת הקישור ל-235 µL על ידי הוספה של בופר קישור תחרותי. לאחר מכן, הכן מבחנת מיקרו-צנטריפוגה המכילה 200 µL של בופר התחרות. הוסף 10 µL של נוקלאוטיד ניסויי למסך (rack) אחד של חרוזיים ו-10 µL של חלבון A קושר למסך אחד. לאחר מכן, הכן את מבחנות הביקורת של G-D-P, G-T-P gamma S וללא נוקלאוטיד כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

דגרו את המבחנות למשך שעתיים, תוך ערבוב על ידי היפוך לאחר הדגירה, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו את החרוזיים שלוש פעמים עם תמיפת קישור לתחרות. לבסוף, אלוטו את החלבונים הקשורים ב-20 µL של תמיסת דגימה מחזרת.

Western blotting כמותי של תג ה-GFP של GFP RCC two ו-GFP Corona in one C.Propeller domain מופרשים מגלה כי החלבון בפס העליון, GFP RCC two, שכיח פי 1.4 מהפס התחתון ויש לדללו כדי להגיע ליחס מולרי של אחד ለአחד עבור ניסוי התחרות. ניסוי בקרה מדגים כי מצב טעינת הנוקלאוטידים של rack one קובע את סגוליות הקישור; הטיטרציה של נפחים עולים של GFP RCC two מול נפח קבוע של GFP Corona in one C propeller domain במינון אקו-מולרי, ולאחריה blotting. החלבונים הנקשרים ל-rack one מאפשרים ויזואליזציה של שינוי יחסי בחלבון הקשור; שרטוט עוצמות פסי ה-GFP עבור שני המתחרים על אותו גרף, וזיהוי הנקודה שבה הקווים נחתכים, מאפשרים לזהות את נפח חלבון הקישור המשתנה בשיווי משקל.

עם זאת, יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח שבעיות כגון אינטראקציה בין המתחרים או עודף של פיתיון gtpa לא יפגעו בניסוי. עלייה באחד המתחרים ללא ירידה בשני, כפי שמוצג כאן, מעידה על בעיה בעת ביצוע פרוצדורה זו. חשוב לזכור לבדוק שקיים קשר הופכי בין השפעות של השותפים הקושרים המתחרים.

קיימים מספר גורמים שעלולים להעוות את התוצאות ו/או שניתן לפתור אותם, כל עוד הם מזוהים באמצעות בדיקה של הנתונים.