Name: הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למד הדמיה חיה של הוצאת תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של דג זברה מתפתח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת אקטין ותחזוקת רקמות אפיתליאליות בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי במעבדה רוזנבלט לדיונים, הצעות מדעיים, והערות. אנחנו רוצים גם להודות מרי הלוראן אשר חביב סיפק את הקידוד פלסמיד-RFP UtrCH דוד גרינוולד שסיפק את CK: GFP מהונדס דג הזברה. תודה גם גרטשן המלך וצוות משאבים דג הזברה מרכזי באוניברסיטת יוטה תחזוקה טיפול מעולה של דג הזברה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס ממציא ניו NIH-NIH NIGMS המנהל 1 DP2 OD002056-01 ל JR. GTE נתמכה על ידי NIH הדרכה רב תחומית סרטן תוכנית גרנט 5T32 CA03247-8.

זרימת עבודה בסיסיים להדמיה של אקטין Dynamics במהלך שחול תא האפידרמיס של דג הזברה פיתוח האפידרמיס של דג הזברה מתפתח מורכבת משתי שכבות נפרדות, שכבת פני השטח (או periderm) לבין שכבת הבסיס של התאים ליצור קשר עם קרום המרתף 2. התאים של שכבת פני השטח החיצוניים עוברים אפופטוזיס ו מסולקות מן הרקמה על ידי שחול 3 (איור 1). כדי להמחיש את התהליך הזה בזמן אמת, אנו מזריקים RNA קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום התמזגו לתחום הומולוגיה calponin של utrophin, החלבון אקטין מחייב (RFP-UtrCH) 4,5, לאחד תאים דג הזברה הבמה מהונדס המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP ) תחת מרובדת epithelia האמרגן cytokeratin 8 6 (איור 2 א). למרות RFP-UtrCH מתבטא בכל מקום בגוף של בעלי חיים לאחר הזרקת RNA, אנו מתמקדים בתאי האפידרמיס שטחית המבטאים הן RFP ו-GFP לעקוב אקטין הדינמיקה במיוחד האפידרמיס (תרשים 2B). לאחר מכן, אנו לטיפול הזחלים עם G418 לגרום שחול תאים אפופטוטיים התמונה ואת האפידרמיס סיבי אקטין באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal ולרכוש מערכי נתונים 4D. לפני התחלת הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במבחנה לתמלל את RNA מתבנית DNA לינארית באמצעות mMachine mMessage SP6 Kit (Ambion) ולטהר את RNA כתרים באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen). לדלל את RNA ל ~ 60ng/ul באמצעות מים סטריליים, להפוך 3-5μl aliquots ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן להזרקה. הערה: הימנע להקפיא חוזרות / הפשרה על מנת למנוע הידרדרות של רנ"א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תבנית להחזיק את העוברים במהלך ההזרקה ידי שפיכת 40mL agarose של 2% בטווח הבינוני העובר E3 (E3) לתוך צלחת 100 x 15mm תרבות ומיקום תבנית microinjection (Adaptive כלי המדע, # I-34) במגש הזה. לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את התבנית כדי לחשוף את שקתות ב agarose. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי מחטים להזרקה באמצעות זכוכית בורוסיליקט עם חוטים (OD 1.0mm, מזהה 0.78, אורך 10 ס"מ) ו פולר P-97 סאטר פיפטה את ההגדרות הבאות (חום 485, משוך 50, מהירות 60, עיכוב / שעה 90, בלחץ 200 ). הערה: סוגים שונים של זכוכית ידרוש אופטימיזציה של התנאים המנויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפרים 1% נמוכה ממיסים (LM) agarose ב-E3 ולאחסן 1mL aliquots על 42 ° C. היזהר כמו אידוי של E3 מן המניות יכולים להגדיל את ריכוז agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על דג הזברה מבוגר בתנאי מעבדה סטנדרטיים, עם קבוע אור / חושך מחזור של 14 שעות אור ו 10 שעות חושך 7. בלילה שלפני הניסוי להגדיר דגים להזדווג על ידי הנחת 3 נשים ו -2 גברים בטנק מופרדים על ידי מחיצה. למחרת בבוקר, להחליף את המים במיכל ולמשוך את המחיצה כאשר האורות נדלקים. </li></ol> 1. הזרקת RNA קידוד החלבון אקטין Tagged fluorescently הכבילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה RNA על הקרח. הוסף האדום פנול 0.5% ל RNA ביחס של 1:1 עבור ריכוז RNA הסופי של ~ 30ng/μl עומס פתרון 1μl לתוך מחט נימי רתומה גב מילוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ~ 75 1 8-cell בשלב CK: עוברים GFP ב-E3. Pipet pipet שנאספו עוברים לתבנית microinjection עם 5 ¾ פסטר בעדינות לכוון את העוברים בשוקת עם FST דומון # 5 מלקחיים. הערה: הקפד לעבוד מהר, כדי למנוע הזרקת לעובר רב תא הבמה, אשר עלולה לגרום ביטוי פסיפס של RNA מוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת stereomicroscope מעבדה סטנדרטי לנתח, להזריק את הרנ"א בחלמון של עוברי באמצעות לחץ שבשליטת microinjector (הרווארד Apparatus PLI-100 Pico-Injector). נקודה אדומה (אדום פנול) צריך להיות גלוי העובר לאחר ההזרקה. הזרק לפחות 50 עוברי עבור כל ניסוי. (ראה פרוטוקול יופיטר הקודם עבור פרוטוקול מפורט על הזרקת RNA לתוך עוברי דג הזברה 9). הערה: <ol type="A" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח של ~ 2nl אמור לשמש עבור הזרקה של רנ"א לתוך אחד התאים עוברים שלב. כדי לקבוע את כמות הרנ"א מוזרק, לוותר בולוס של רנ"א לתוך טיפה של שמן מינרלי בשקופית מיקרומטר מכויל או תחת מיקרוסקופ עם בר סולם מובנית מהעיניות. טיפה של רנ"א צריך להיות כדור מושלם. לחשב את הסכום מועברת באמצעות המשוואה: כרך (ב nl) = 4/3πr 3. התאמת עוצמת השמע מועבר על ידי שינוי בלחץ ההזרקה או זמן על המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול צריך גם לקחת להזרים את הסכום הנמוך ביותר של רנ"א המאפשרת ויזואליזציה של fluorophore, כמו ריכוז גבוה של RNA יכול להיות רעיל העובר המתפתח. כדי לקבוע רמת ביטוי הולם, בניסוי במינון עקומת יש לבצע לפני הפעלת הניסוי. &lt;/ Li&gt; </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין עוברים להסיר כל הביצים מופרית או פגום ומקום כל העוברים הנותרים ב 28.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ לנתח ניאון כדי לבחור עוברי דג הזברה, כי יש רמה גבוהה של GFP (האפידרמיס) ו RFP (אקטין) פלואורסצנטי. מניחים את העוברים שנבחרו 28.5 ° C עד מוכן להמשיך עם הטיפול התרופה לגרום אפופטוזיס. </li></ol> 2. אינדוקציה של שחול תא הזחלים דג הזברה באמצעות G418 מצאנו כי החשיפה לאנטיביוטיקה aminoglycoside G418, או Geneticin, גורם לאפופטוזיס ו שחול של תאים אפידרמיס בפיתוח הזחלים דג הזברה 3 על ידי מנגנון בלתי ידוע. חשוב לציין כי טיפול זה עובד רק על זחלים, כי הם 4 ימים הפריה פוסט ומעלה. אנו מוצאים כי ~ 5-25 תאים ניתן למצוא extruding בכל זמן נתון מתוך סנפיר אפיתל של דג הזברה G418 הזחל טיפול. כאשר כמות תאים אפופטוטיים extruding יכול לנוע בין דגים דגים, אנו ממליצים הרכבה דגים מרובים עבור הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מקום 4 שלאחר יום הפריה (DPF) הזחלים דג הזברה בתערוכה הן GFP ו RFP הקרינה לתוך צלחת 35 x 10mm תרבות המכילה 3 מיליליטר (MLS) של E3. אפשר לטפל עד 25 זחלים בצלחת תרבות זו גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחליף את התקשורת עם 3mLs של 1mg/mL המכיל E3 של הזחלים G418 ו מדגירים את התרופה במשך 4 שעות ב 28.5 ° C. שים לב G418 אור רגיש, כל כך דואגים לשמור על תרבות צלחת מכוסה או בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר התקשורת ולהחליפו מראש חימם 28.5 ° C-E3 מדיה המכילה Tricaine 0.02% והמשך הרכבה הזחלים. </li></ol> 3. דג הזברה הזחלים הרכבה עבור הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 3 זחלים אל צינור 1.5 Eppendorf מ"ל ולהסיר ביותר של E3 לאחר הכיור דגים לתחתית של התחתית. מצאנו כי עד 3 חיות יכול להיות מותקן כראוי לפני agarose מתמצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה pipet לחתוך, 120ul pipet של 1% LM-agarose (42 ° C) לתוך הצינור, לערבב, ואז בעדינות pipet הזחלים תערובת agarose על coverglass בתחתית של צלחת תרבות MatTek. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בעל פין FST בסיכה להוסיף או טונגסטן מחט מחוברת, במהירות לכוון את הזחלים ולכן הם ישר ושטוח נגד coverglass של המנה MatTek. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל סיכה ישר לכוון הראשון הזחלים ואז סיכה בצורת האות כדי לוודא שהם שטוח נגד coverglass תוך מניעת נזק דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה, בעדינות למלא את המנה עם E3 המכיל 0.02% Tricaine. הערה: לחילופין, G418 ניתן להוסיף E3 בצלחת הדמיה להמשיך שחול זירוז, אם כי לטווח ארוך חשיפה 1mg/mL G418 יהרוג את הזחלים. </li></ol> 4. הדמיה חיה של אקטין דינמיקה הפרט התנהגויות תא אפיתל במהלך שחול נייד באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג Confocal מצאנו כי את כל התהליך של שחול תא אפופטוטיים מן האפידרמיס של דג הזברה מתפתח הזחלים לוקח כ 20 דקות 3. כאן אנו מדגימים כיצד הגדרת ניסוי זמן לשגות הדמיה לאסוף סדרה של מטוסים z דרך שכבה יחידה של האפידרמיס דג הזברה כדי להמחיש את התהליך שחול. מצאנו כי טיפוסי מיקרוסקופים widefield ניאון גורם משמעותי photobleaching של סיבי אקטין ואינם מאפשרים הדמיה timelapse. לכן, כדי למקסם את ההחלטה שלנו ולמנוע photobleaching, אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. להלן נתאר כיצד להגדיר את הניסוי באמצעות תוכנת IQ אנדור עם מיקרוסקופ ניקון, אם כי העקרונות שנדונו ניתן ליישם מיקרוסקופ דומה בחר קופצים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להפעיל את ארגון (עבור עירור של ה-GFP ב 488nm) ו HeNe (עבור עירור של RFP ב 561nm) לייזרים, מיקרוסקופ, מצלמה מנורה epifluorescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך IQ אנדור תוכנה (גרסה 1.10.1), ליצור סדרה זמן פרוטוקול המכיל את אורכי הגל אתה רוצה תמונה, בתדירות של המרווחים בין לוכדת תמונה מספר פעמים ללכוד יש לחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות במקום צלחת MatTek המכיל הדגימה שלך על הבמה מיקרוסקופ ולהשתמש מטרה 20x עם האור המועבר להתמקד הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המים 40X טבילה אובייקטיבי (NA 0.8) לתוך המיקום הנכון. שימוש למטרה זו, אנו יכולים הסרט כ 20-25 תאים לכל שדה, אשר מאפשר לנו לעקוב אחר התנהגויות הסלולר במהלך שיחול בעוד גם לפתרון המשנה הסלולר דינמיקה אקטין. הערה: הרכבה זהה ואסטרטגיות הדמיה יכול להיות מיושם על מיקרוסקופים זקופה, אם כי טבילה במים 40X אובייקטיבי עם מרחק עבודה ארוך יש להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום טיפת מים על החלק העליון של היעד במהירות 40X במקום צלחת MatTek על העליונה. לאדואר: Zeiss פתרון Immersol טבילה יכול לשמש גם אם אידוי של המים היא בעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הדגימה באמצעות שלב או הארה DIC ולאחר מכן להשתמש epifluorescence 488nm להתמקד דווקא על האפידרמיס GFP חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב סריקה confocal. התאם את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה לכל אחד הערוצים (488nm ו 561nm) בהתאם. תשמרי על עצמך כדי לאזן את כוח לייזר וזמן החשיפה לגילוי אופטימלי של האות שלך כדי למנוע כל photobleaching או רעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות תאים extruding, להשתמש epifluorescence לדמיין GFP שכותרתו האפידרמיס לזהות קבוצה של תאים דפוס שושנת הקלאסי, המורכב מאוסף של תאים סביב תא עגול קטן באמצע. שימוש במצב סריקה confocal, שם צריך להיות גם הצטברות של אקטין המכרז שכותרתו נראה כמו טבעת סביב התא עגול קטן באמצע, סימן ההיכר של שחול התא. לאחר שזיהית תא extruding, להגדיר במהירות את המיקרוסקופ לרכוש 4D (XYZ-Time) מערכי נתונים confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את נקודות העליונים והתחתונים בתוך המטוס z לדמיין שכבה יחידה של האפידרמיס, כולל תא extruding, ובחר את גודל הצעד. במשך זמן לשגות הדמיה, לקבוע את המרווחים עבור לכידת תמונה ומספר חזרות. לדוגמה, אנו בדרך כלל לרכוש סדרה Z-5-פורש 10μm, עם גודל 1 מיקרומטר צעד, כל 1-2 דקות במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להציג את הנתונים, אנחנו בדרך כלל עושים את 3-D התחזיות של הסדרה z ולשמור את הנתונים להגדיר כקובץ סרט התואם מהיר זמן (Apple). באופן זה, אנו יכולים לדמיין התכווצות של טבעת אקטין והתנהגויות אפיתל המתרחשים סביב התא למות לאורך זמן. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סכמטי של תא שחול אפופטוטיים. סיבי אקטין מוצגים באדום, GFP אפידרמיס התאים החיוביים הם ירוקים. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. זרימת עבודה ניסויית. א סכמטי של זרימת העבודה עבור הניסוי. B. הביטוי של RFP-UtrCH באפידרמיס של CK 4dpf: GFP דג הזברה. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. עדיין במסגרות (z-תחזיות) מתוך הסרט זמן לשגות העוקב לחיות אקטין הדינמיקה במהלך תהליך של שחול תא אפיתל. חצים מציינים את טבעת של אקטין נוצר על ידי תאים שכנים אשר חוזים וסוגר במשך 2 דקות.

<ol><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li>
<li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li>
<li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li>
<li>Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
<li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%2C+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
</ol>

בעלי חיים הבטחת הרווחה כל ההליכים שבוצעו באמצעות פרוטוקול זה דג הזברה, Danio rerio, אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת יוטה (הבטחת לרווחת בעלי חיים # 10-07017).

פרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטה פשוט וברור כדי להמחיש את התהליך של שחול ברקמות האפיתל לחיות. סוג זה של הניסוי מאפשר לנו לבחון את הדקויות של אקטין דינמיקה לא העריכו בעבר מנתח רקמות קבוע, ולכן, משלים שיטות immunofluorescent משותף. אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה בשילוב עם מעכבי כימיים או מוטציות גנטיות טוב יותר לנתח את התהליך שחול ומחלות קובע מחקר הקשורים לכישלון להסיר תאים אפופטוטיים ברור, אשר אנו מצפים שיוביל תגובות דלקתיות או הצטברות של תאים פגומים, כמו לראות סרטן. לדוגמה, המעבדה ש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> סוג </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> מגיב </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> מגיב </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> מעבר טנקים </td><td> כלי </td><td> Thoren Aquatic מערכות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> משאבה Pipet </td><td> כלי </td><td> בל מוצרי אמנות </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ Pipet פסטר </td><td> כלי </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microinjection עובש </td><td> כלי </td><td> מסתגלת המדע כלים </td><td> אני-34 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות 100x15mm פלייט </td><td> כלי </td><td> דיג </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / בראון Micropipet פולר </td><td> כלי </td><td> סאטר החברה Instrument </td><td> דגם P97 </td><td></td></tr><tr><td> בורוסיליקט זכוכית נימים עם נימה </td><td> כלי </td><td> סאטר החברה Instrument </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, מזהה 0.78mm, אורך 10 ס&quot;מ </td></tr><tr><td> אחסון אלקטרודה צנצנת </td><td> כלי </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> P0290 </td><td> 0.5% ב DPBS </td></tr><tr><td> לחץ שבשליטת Microinjector ו Micromanipulator </td><td> כלי </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות 35x10mm דיש </td><td> כלי </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> מגיב </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב DH 2 0 </td></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> כלי </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm מחזיק פין </td><td> כלי </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> הכנס סיכות </td><td> כלי </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 26007-02 ו-03 </td><td></td></tr><tr><td> תחתית זכוכית מהודרת עם תרבות coverglass 1.5 </td><td> כלי </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> נמוכה ממיסים agarose </td><td> מגיב </td><td> דיג </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ </td><td> מיקרוסקופ </td><td> לייקה </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ </td><td> מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> SMZ645 </td><tד&gt; </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלורסנט הביתור </td><td> מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> טווייה מיקרוסקופ דיסק Confocal </td><td> מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> Eclipse טי </td><td> לבוש עם ראש דיסק Yokagawa ספינינג </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> מצלמה </td><td> אנדור </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 מיקרון מרובע פיקסלים </td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של שחול cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

תחזוקה homeostatic של רקמות אפיתל דורש את הסרת מתמדת של תאים פגומים מבלי לשבש תפקוד מחסום. המחקרים שלנו מצאו כי תאים מתים לשלוח אותות חיים לשכנים שלהם הטופס חוזה טבעת של אקטין שרירן כי זה פולט מתוך גיליון אפיתל ואילו לסגור פערים שאולי נבעה היציאה שלה, תהליך שמכונה שחול תא 1. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטה לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל. כדי להמחיש שחול, אנו מזריקים בדיקה אדום חלבון פלואורסצנטי שכותרתו עבור אקטין-F לתוך אחד התאים הטרנסגניים בשלב עוברי דג הזברה לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק של האפידרמיס להשרות אפופטוזיס על ידי תוספת של G418 אל הזחלים. לאחר מכן, אנו משתמשים זמן לשגות הדמיה במיקרוסקופ על דיסק מסתובב confocal לצפות בדינמיקה אקטין והתנהגויות תא אפיתל בתהליך של תאים אפופטוטיים שחול. גישה זו מאפשרת לנו לחקור את התהליך שחול ב לחיות epithelia ותספק שדרה ללמוד מדינות מחלה הנגרמת על ידי הכישלון לחסל תאים אפופטוטיים.

תאים מתים נמתחים מרקמות אפיתל על ידי התכווצות מתואמת של תאים שכנים מבלי לשבש תפקוד מחסום. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטות לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל ברזולוציה הסלולר.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

שמירה הומאוסטטית של רקמות אפיתליאליות מחייבת סילוק מתמיד של תאים פגומים מבלי להפר את תפקודי המחסום. מחקרינו מצאו ש...

תחזוקה של רקמות אפיתליאליות דורשת הסרה רציפה של תאים פגומים ומתים מבלי לפגוע בתפקוד המחסום. כדי להשיג זאת, תאים אפיתליאליים דוחפים החוצה תאים גוססים על ידי יצירה וכיווץ של טבעת אקטין ומיוזין בתא המקיף את התא הגוסס, כדי להשליכו תוך סגירת כל הפערים שעלולים להיווצר כתוצאה מיציאתו. במאמר וידאו זה, מוצגת שיטה להשראה ולדימוי של דחיקה של תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של זחלי דג זברה בזמן אמת.במקרה המוצג, הדבר מושג על ידי הזרקה של גשש F actin המסומן בחלבון פלואורסצנטי אדום לתוך שלב תא אחד של עוברי דגי zebrafish טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק באפידרמיס, כדי להמחיש את סיבי האקטין ברקמות אפיתליאליות. זחלים ביום הרביעי לאחר ההפריה, המבטאים הן GFP והן RFP, מטופלים לאחר מכן ב-G418 כדי להשרות אפופטוזה באפידרמיס. דינמיקת האקטין ושינויי הצורה של התאים האפיתליאליים המתרחשים במהלך ההדחקה (extrusion) מומחשים באמצעות דימות time-lapse במיקרוסקופ קונפוקאלי בעל דיסק מסתובב.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונו-כוח ואנליזות, הוא היכולת לצפות בשינויים מהירים ובדינמיקה של actin המתרחשים במהלך תהליך האקסטרוזיה ברקמה אפיתליאלית חיה. בסרטון זה, נדגים הליך לדימוי של אקסטרוזיה של תאים אפופטוטיים מהדרמיס של דגי זברה בשלבי התפתחות בזמן אמת. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להבין כיצד תאים מסדרים מחדש באופן מתואם את שלד התא של ה-actin כדי להסיר תאים אפופטוטיים תוך שמירה על תפקוד מחסום, וכיצד שיבוש של תהליך האקסטרוזיה עשוי להוביל למצבים מחלות מסוימים.כדי להתחיל, לצורך ויזואליזציה של דינמיקת האקטין במהלך דחיסה תאית (cell extrusion) באפידרמיס של דגי זברה (zebrafish) מתפתחים, התחילו בהפשרה של RNA שתומלל בעבר על קרח. אנו מתמללים mRNA המקודד לחלבון פלואורסצנטי אדום המחובר לדומיין ההומולוגיה של calponin של utrophin ולחלבון קושר אקטין. הוסיפו phenol red ל-RNA ביחס של 1:1 לריכוז RNA סופי של כ-30 ng/µL, וטענו 1 µL מהתמיסה לתוך מחט קפילרית שנמשכה באמצעות מילוי אחורי (back filling).אספו כ-75 עוברים של C-K-G-F-P בשלב תא אחד לתוך תמיסת E three. העבירו באמצעות פיפטה את העוברים שנאספו לתבנית המיקרו-הזרקה באמצעות פיפטה רחבה של 5.75, וכוונו בעדינות את העוברים בתוך התעלה בעזרת פינצטת Dumont מספר 5. עבדו במהירות כדי להימנע מהזרקת RNA לעוברים בשלבים מתקדמים, תחת מיקרוסקופ סטריאו למחקר מעבדה סטנדרטי.השתמשו במיקרו-מזרק בעל בקרת לחץ כדי להזריק את ה-RNA לחלמון של העוברים כפי שסומן בפנול. הצבע האדום צריך להיות גלוי בעובר לאחר ההזרקה. הקפידו להזריק לפחות ל-50 עוברים עבור כל ניסוי.מיינו את העוברים כדי להסיר ביצים לא מופרות או פגומות, והדגרירו את כל שאר העוברים בטמפרטורה של 28 °C. לאחר 24 שעות, השתמשו במיקרוסקופ דיססקציה פלואורסצנטי כדי לבחור עוברי zebrafish בעלי רמה גבוהה של פלואורסצנציית GFP באפידרמיס ופלואורסצנציית RFP מסומנת. הדגרירו את העוברים שנבחרו בטמפרטורה של 28 °C עד להגעה לשלב הטיפול התרופתי להשראת אפופטוזיס באמצעות חשיפה לאמינו גליקוזיד.האנטיביוטיקה G 418 או התרופה גורמות לדחיקה החוצה של תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של זחלי zebrafish מתפתחים. חשוב לציין כי טיפול זה יעיל רק בזחלים שנמצאים ביום הרביעי לאחר ההפריה ומעלה כדי להשרות דחיקה של תאים. אספו עד 25 זחלי zebrafish ביום הרביעי לאחר ההפריה המבטאים הן GFP והן RFP אל תוך צלחת תרבית של 35 על 10 מילימטר המכילה שלושה מיליליטר של מצע E3.החליפו בזהירות את המצע בשלושה מיליליטר של E three המכיל 1 mg/mL של G four 18, והדגירו את הזחלים בתרופה למשך ארבע שעות בחושך בטמפרטורה של 28 °C. לאחר מכן, הסירו את המצע והחליפו אותו במצע E three שחומם מראש ומכיל 0.02% trica, והמשיכו להרכבת הזחלים לצורך הדמיה. העבירו עד שלושה זחלים לפח ל-1.5 מיליליטר והסירו את רוב מצע ה-E three.בעזרת טיפ של פיפט חתוך, העבירו 120 µL של 1% low melt agarose אל תוך המבחנה וערבבו. לאחר מכן, העבירו בעדינות בעזרת פיפט את הזחלים ותערובת ה-agarose על גבי זכוכית כיסוי בתחתית של צלחת תרבית matech. בעזרת מחזיק פינים FST עם פין מוכנס או מחט טונגסטן מחוברת, יישרו במהירות את הזחלים כך שיהיו ישרים ומוצמדים לזכוכית הכיסוי.המתינו עד שהג'ל יתגבש. לאחר מכן, מלאו בעדינות את הכלי בתווך E3 המכיל 0.02% trica. מצאנו כי התהליך השלם של פליטת תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של זחלי דג זברא בשלבי התפתחות אורך כ-20 דקות.כאן אנו מדגימים כיצד להגדיר ניסוי דימות בשיטת צילום רצף זמנים (time-lapse) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם דיסקה מסתובבת ותוכנת and or IQ, כדי לאסוף סדרה של מישורי Z דרך שכבה בודדת של האפידרמיס של דג הזברה. ראשית, הפעילו את לייזרי הארגון והליום-ניאון, את מצלמת המיקרוסקופ ואת מנורת הפלואורסצנציה האפי-פלואורסצנטית בתוך תוכנת and or IQ. צרו פרוטוקול של סדרת זמנים הכולל את אורכי הגל שיוצגו בדימות.תדירות המרווחים בין לכידות התמונה ומספר הפעמים שבהן יש לחזור על הלכידה. הניחו בעדינות את צלח ה-mattec המכיל את הדגימה על בסיס המיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמשו בעדשה עם הגברה של 20 פעמים ובאור תמיכה (transmitted light) כדי להתמקד בזחלים. העבירו את עדשת הטבילה במים עם הגברה של 40 פעמים למצב הנכון. באמצעות עדשה זו, ניתן להקליט בערך 20 עד 25 תאים לשדה, מה שמאפשר לנו לעקוב אחר התנהגויות תאיות במהלך תהליך ה-extrusion, תוך הגעה לרזולוציה המאפשרת צפייה בדינמיקה תת-תאית של actin.הנח בזהירות טיפת מים על חלקו העליון של העדשה אובייקטיבית פי 40 והנח במהירות את צלח ה-mattec מעליה. זהה את הדגימה באמצעות תאורת שדה בהיר (brightfield), ולאחר מכן השתמש בפלואורסצנציית epi באורך גל של 488 ננומטר כדי להתמקד ספציפית באפידרמיס החיובי ל-GFP. עבור למצב סריקה קונפוקאלית.כוון את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה עבור כל אחד מהערוצים בהתאם. הקפד לאזן בין הספק הלייזר לזמן החשיפה כדי להגיע לגילוי אופטימלי של האות וכדי למנוע פוטו-טוקסיות. כדי לזהות תאים בולטים (extruding cells), השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסוג epi כדי להוות ויזואליזציה של האפידרמיס המסומן ב-GFP, וזהה קבוצת תאים בתבנית רוזטה קלאסית, המורכבת מאוסף תאים המקיפים תא עגול קטן במרכז.בנוסף, צריכה להיות נראית הצטברות של אקטין המסומן ב-RFP כטבעת סביב התא העגול הקטן שבמרכז, סימן היכר של דחיקת תאים (cell extrusion). לאחר זיהוי תא שנדחק, הגדירו במהירות את הגבולות העליונים והתחתונים עבור ה-Z Series ואת גודל הצעד. לאחר מכן, התחילו ברכישת ארבעה מערכי נתונים של D confocal כדי לבחון את הנתונים ולהמחיש את התכווצות טבעת האקטין ואת ההתנהגויות האפיתליאליות המתרחשות סביב התא הגסס.במהלך הזמן, צור היטלי תלת-ממד (3D projections) של סדרת ה-Z ושמור את הנתונים כקובץ סרטון. ניתן לבצע שלב זה באמצעות מגוון חבילות תוכנה. דמות זו מראה את הביטוי של RFP UTR CH באפידרמיס של זחלי דג זברה CK GFP ארבעה ימים לאחר ההפריה.להלן תמונות סטילס של היטל Z (Z projections) מסרט time lapse העוקב אחר דינמיקה חיה. במהלך תהליך של פליטת תאי אפיתל (epithelial cell extrusion), החצים מצביעים על טבעת האקטין שנוצרת על ידי תאים שכנים, אשר מתכווצת ונסגרת במהלך של שתי דקות. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות בשילוב עם טכניקה זו, כגון שימוש במעכבים כימיים או במוטציות גנטיות, כדי להבין טוב יותר כיצד שינויים בתהליך הפליטה עשויים להוביל למצבים מחלה מסוימים.בהתבסס על הכישלון בפינוי תאים אפופטוטיים, הראינו לכם כיצד להקים ניסוי של דימוי במרווחי זמן (time-lapse imaging) כדי להמחיש את תהליך הדחיקה מהאפידרמיס של דג זבראם בשלבי התפתחות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגביל את כמות האור החושפת את הדגימה כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photo bleaching) או רעילות. וזהו הכל.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מקור: Williams, A. L., et al. הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים כדי להמחיש התפתחות בזמן אמת: הדמיה של תאי פסגה עצבית נודדים בעוברי דג זברה. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מציג פרוטוקול הדמיה מרובה פוטונים כדי לדמיין את הנדידה של תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה.

הדמיה של נדידת תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה באמצעות הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים

לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור היא כלי מצוין להדמיית התפתחות עוברית. הוא מאפשר הקלטה של סרטוני זמן-lapse ארוכים של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. אנו מדגימים את היישום שלו להדמיית התפתחות עין דג הזברה על פני קני מידה רחבים מרחביים-זמניים ומציגים צינור לאיחוי ודה-קונבולוציה של מערכי נתונים מרובי תצוגות.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

למד הדמיה חיה של הוצאת תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של דג זברה מתפתח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת אקטין ותחזוקת רקמות אפיתליאליות בזמן אמת.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

גלה סרטונים נוספים