הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

תחזוקה של רקמות אפיתל דורשת הסרה מתמשכת של תאים פגומים וגוססים מבלי לשבש את תפקוד המחסום. כדי להשיג את האפיתל הזה, יש להוציא תאים גוססים על ידי יצירה וכיווץ של טבעת של אקטין ומיוזין בתא המקיף את התא הגוסס כדי להוציא אותו תוך סגירת כל הפערים שעלולים לנבוע מיציאתו. במאמר וידאו זה, שיטה לגרום ולדמות שחול תאים אפופטוטי מהאפידרמיס של דגי זברה זחלים בזמן אמת.

בהראה, זה מושג על ידי הזרקה של חלבון פלואורסצנטי אדום שכותרתו בדיקת F actin לתוך שלב תא אחד, עוברי דג זברה טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק באפידרמיס כדי לדמיין חוטים פועלים ברקמות האפיתל. ביום הרביעי, זחלים לאחר התאמה אישית המבטאים גם GFP וגם RFP מטופלים לאחר מכן ב-G 4 18 כדי לגרום לאפופטוזיס באפידרמיס. דינמיקת אקטין ושינויים בצורת תאי האפיתל המתרחשים במהלך שחול מוצגים על ידי הדמיית זמן-lapse במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כוח חיסוני וניתוחים, הוא שאנו יכולים לצפות בשינויים מהירים ובדינמיקת אקטין המתרחשים במהלך תהליך האקסטרוזיה אם ברקמת אפיתל חיה. בסרטון זה, נראה לכם הליך להדמיית שחול של תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של דגי זברה מתפתחים בזמן אמת. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להבין כיצד תאים מסדרים מחדש את שלד האקטון שלהם כדי להסיר תאים אפופטוטיים תוך שמירה על תפקוד המחסום וכיצד שיבוש תהליך האקסטרוזיה עלול להוביל למצבי מחלה מסוימים.

אז בואו נתחיל כדי לדמיין דינמיקת פעולה במהלך שחול תאים באפידרמיס של דג הזברה המתפתח, התחל בהפשרת RNA שתועתק בעבר על קרח. אנו מתמללים Mr.mRNA המקודד חלבון פלואורסצנטי אדום המאוחה לעגל בתחום ההומולוגיה של אוטרופין ופועלים בחלבון קשירה. הוסף פנול אדום ל-RNA ביחס של אחד לאחד לריכוז RNA סופי של כ-30 ננוגרם למיקרוליטר וטען מיקרוליטר אחד של תמיסה למחט נימית משוכה על ידי מילוי אחורי.

אסוף כ-75 עוברים בשלב תא אחד C-K-G-F-P במאגר E שלוש. פיפטה את העוברים שנאספו לתבנית המיקרו-הזרקה עם פיפטת פסטה של חמישה ושלושת רבעי וכיוון בעדינות את העוברים בשוקת עם FST Dumont. מספר חמש, מלקחיים פועלים במהירות כדי להימנע מהצורך להזריק את ה-RNA לעוברים רב-שלביים תחת מעבדה סטנדרטית המנתחת מיקרוסקופ סטריאו.

השתמש במזרק מיקרו מבוקר לחץ כדי להזריק את ה-RNA לעול העוברים כמאובן של פנול. אדום אמור להיות גלוי בעובר לאחר ההזרקה. הקפידו להזריק לפחות 50 עוברים לכל ניסוי.

מיין את העוברים כדי להסיר ביציות לא מופרות או פגומות ולדגור על כל העוברים הנותרים ב-28 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי כדי לבחור עוברי דג זברה בעלי רמה גבוהה של פלואורסצנטיות GFP באפידרמיס ו-RFP המסומן פלואורסצנטי פועל. דגרו על העוברים שנבחרו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להמשיך בטיפול התרופתי כדי לגרום לחשיפה לאפופטוזיס לאמינו גליקוזיד.

אנטיביוטיקה G ארבע 18 או תרופה גורמת לשחול של תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של זחלי דג הזברה המתפתחים. חשוב לציין, טיפול זה עובד רק על זחלים שנמצאים ארבעה ימים לאחר ההפריה ומעלה כדי לגרום לשחול תאים. אסוף עד 25 4 ימים לאחר ההפריה זחלי דג הזברה המבטאים הן GFP והן RFP לתוך צלחת תרבית בגודל 35 על 10 מילימטר המכילה שלושה מיליליטר של E שלושה מדיום.

החלף בזהירות את המדיום בשלושה מיליליטר של E, שלושה המכילים מיליגרם אחד למיליליטר של G, ארבע 18 ודגרו זחל בתרופה למשך ארבע שעות בחושך ב -28 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את המדיה והחלף ב-E חם מראש שלוש מדיה המכילה 0.02% טריקה והמשך להרכיב את הזחלים כדי להרכיב את הזחלים להדמיה. העבירו עד שלושה זחלים לצינור פנדור של 1.5 מיליליטר והסירו את רוב מדיום ה-E שלוש.

בעזרת פיפטה עם קצה פיפטה חתוכה 120 מיקרוליטר של 1% נמס נמוך לתערובת הצינורות. ואז פיפטה בעדינות את תערובת הזחלים והארו על זכוכית הכיסוי בתחתית צלחת תרבית מטק. בעזרת מחזיק סיכת FST עם סיכת הכנסה או מחט טונגסטן מחוברת, כוון במהירות את הזחלים כך שיהיו ישרים ושטוחים כנגד זכוכית הכיסוי.

אפשר לאוז להתמצק. לאחר מכן מלאו בעדינות את המנה ב-E שלושה בינוניים המכילים 0.02% טריקה. מצאנו שכל תהליך שחול התאים האפופטוטיים מהאפידרמיס של זחלי דג הזברה המתפתחים אורך כ-20 דקות.

כאן אנו מדגימים כיצד להגדיר ניסוי הדמיה בהילוך מהיר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב ותוכנת AND או IQ כדי לאסוף מישורי Z מסדרה דרך שכבה אחת של האפידרמיס של דג הזברה. ראשית, הפעל את מצלמת המיקרוסקופ של לייזרי ניאון ארגון והליום ומנורת פלורסנט אפי בתוך תוכנת ו/או IQ. צור פרוטוקול סדרת זמן המכיל את אורכי הגל שיש לצלם.

תדירות המרווחים בין צילומי התמונה ומספר הפעמים שיש לחזור על הלכידה הנח בעדינות את צלחת המטק המכילה את הדגימה על שלב המיקרוסקופ ולאחר מכן השתמש במטרה פי 20 עם אור מועבר כדי להתמקד בזחלים. העבר את יעד הטבילה במים פי 40 למצב הנכון. באמצעות מטרה זו, אנו יכולים לצלם כ-20 עד 25 תאים לכל שדה, מה שמאפשר לנו לעקוב אחר התנהגויות תאיות במהלך שחול, תוך פתרון דינמיקת משחק תת-תאית.

הניחו בזהירות טיפת מים על החלק העליון של המטרה פי 40 והניחו במהירות את צלחת המאטק מעל. זהה את הדגימה באמצעות תאורת שדה בהיר ולאחר מכן השתמש בפלואורסצנציה אפי של 488 ננומטר כדי להתמקד במיוחד באפידרמיס החיובי של GFP. עבור למצב סריקה קונפוקלי.

התאם את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה עבור כל אחד מהערוצים בהתאם. הקפד לאזן את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה לזיהוי אופטימלי של האות שלך וכדי למנוע פוטוטוקסיות. כדי לזהות תאים שחוללים, השתמש באפי פלואורסצנטי כדי לדמיין את האפידרמיס המסומן ב-GFP ולזהות קבוצת תאים בתבנית רוזטה קלאסית המורכבת מאוסף תאים המקיפים תא עגול קטן באמצע.

בנוסף, צריכה להיות הצטברות של האקטין המסומן RFP הנראה כטבעת סביב התא העגול הקטן באמצע, סימן היכר של שחול תאים. לאחר זיהוי תא שחול, הגדר במהירות את הגבולות העליונים והתחתונים עבור סדרת Z ואת גודל הצעד. לאחר מכן התחל לרכוש ארבעה מערכי נתונים קונפוקליים D כדי להציג את הנתונים ולדמיין את ההתכווצות של טבעת האקטין והתנהגויות האפיתל המתרחשות סביב התא הגוסס.

עם הזמן, בצע הקרנות תלת מימד של סדרת Z ושמור את הנתונים כקובץ סרט. ניתן לבצע שלב זה באמצעות מגוון חבילות תוכנה. איור זה מראה את הביטוי של RFP UTR CH באפידרמיס של זחלי דג זברה CK GFP של ארבעה ימים לאחר ההפריה.

כאן עדיין הקרנות מסגרת Z מסרט דולג זמן העוקבות אחר דינמיקת משחק חי. במהלך תהליך שחול תאי האפיתל מוצגים החיצים מציינים את טבעת האקטין שנוצרת על ידי תאים שכנים, שמתכווצת ונסגרת במהלך שתי דקות. בעקבות הליך זה, אנו יכולים להשתמש בשיטות אחרות בשילוב עם טכניקה זו, כגון שימוש במעכבים כימיים או מוטציות גנטיות כדי להבין טוב יותר כיצד שינוי שחול עשוי להוביל למצבי מחלה מסוימים.

כתוצאה מהכישלון לנקות תאים אפופטוטיים, זה עתה הראינו לכם כיצד להגדיר ניסוי הדמיה בזמן-lapse כדי לדמיין את תהליך האקסטרוזיה מהאפידרמיס של דג הזברה המתפתח. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגביל את כמות האור החשופה לדגימה שלך כדי למנוע הלבנת תמונות או רעילות. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.