RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות סי.

הפרוטוקול שלנו שיפר הן את התפוקה והן את יעילות הזמן להשגת נתוני RT-qPCR ישירות מדגימות בודדות או בתפזורת קטנה ללא צורך בבידוד RNA. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להשיג למעלה מ-9,000 תוצאות RT-qPCR ביומיים בלבד של עבודת ספסל, תהליך שבדרך כלל ייקח כחמישה שבועות באמצעות qPCR סטנדרטי של 96 בארות. פרוטוקול זה מספק בדיקת RT-qPCR מהירה יותר, חזקה ורגישה ביותר ב-C.elegans, שהיא אידיאלית לניטור השונות הבין-אישית בביטוי הגנים בין תולעים איזוגניות.

התחל באיסוף התולעים ממדשאת החיידקים שלהן על צלחת בינונית לגידול נמטודות טריות ללא זרעים ואפשר לתולעים לנוע סביב הצלחת במשך חמש דקות. בזמן שהתולעים מתאקלמות, במכסה מנוע נטול RNase, מערבבים 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה עם 1 עד 100 Dnase I לכל דגימה ומניחים את המכסה של רצועת PCR הפוכה על הפלטפורמה של משקף ניתוח. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת הליזיס למכסי צינור PCR כיפתי, וגרף את התולעים מהצלחת כדי למנוע העברת חיידקים לכל חריץ של המכסה.

לאחר שכל התולעים הועברו, סגרו את המכסים וסובבו את הצינורות למשך חמש שניות לפני שהניחו את הצינורות בבקבוק דיואר של חנקן נוזלי. לאחר חמש השניות האחרונות, הפשירו את הצינורות באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס לפני שתחזרו על הליך ההקפאה/הפשרה תשע פעמים נוספות. לאחר מחזור ההקפאה/הפשרה האחרון, מערבבים את הדגימות הליזיות על מערבל תרמי למשך 20 עד 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס וכ-1800 סיבובים לדקה.

בתום הדגירה של הערבוב, סובבו את הדגימות כפי שהודגם והוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת עצירה טרייה מופשרת לכל צינור. לשעתוק הפוך של דגימות חמות בתפזורת, במכסה מנוע נטול RNase, הכינו תערובת מאסטר של מאגר אנזים והוסיפו 14 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ל-11 מיקרוליטר מכל דגימה. העבירו את הדגימות דרך תרמו-ציקלר באמצעות תוכנית השעתוק ההפוכה המצוינת ודללו את תוצר ה-cDNA המתקבל ביחס של אחד לארבעה במים נטולי נוקלאז.

להגברה מוקדמת ספציפית למטרה, הוסף 3.75 מיקרוליטר של תערובת מאסטר להגברה מוקדמת לבאר אחת לכל דגימה בצלחת של 96 בארות והוסף 1.25 מיקרוליטר מכל תמיסת cDNA לכל באר של תערובת מאסטר. לאחר טעינת כל הדגימות, כסו את הצלחת בנייר דבק וסובבו לזמן קצר את הדגימות לפני שסובבו אותן באמצעות צנטריפוגה, ולאחר מכן העמיסו את הצלחת על תרמו-סייקלר והפעילו את התוכנית כמצוין. כדי להסיר פריימרים לא משולבים מהקדםampליגה, בקצה הצנטריפוגה התרמו-מחזור את לוחית הדגימה והסר בזהירות את האטם.

הוסף שני מיקרוליטרים של תערובת אקסונוקלאז I master לכל תגובת הגברה מוקדמת ואטום מחדש, צנטריפוגה וטען את הצלחת בחזרה לתוך התרמו-סייקלזר. בסוף המחזור, יש לדלל את הדגימות ב-18 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA. כדי להגדיר שבב מרובה מערכים, הוסף 3.6 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לטעינת בדיקה ו-0.4 מיקרוליטר של פריימר הפוך קדימה של 50 מיקרומולר לבאר אחת לכל דגימה בצלחת של 384 בארות.

לאחר מכן הוסף 2.2 מיקרוליטר של תערובת מאסטר דגימה ו -1.8 מיקרוליטר מכל אקסונוקלאז מוגבר מראש שטיפלתי בדגימה לבארות המתאימות של הצלחת. כדי להגדיר שבב מערך יחיד, הוסף 5.4 מיקרוליטר של תערובת מאסטר טעינת הבדיקה ו-0.6 מיקרוליטר של פריימר הפוך קדימה לבאר אחת לכל דגימה של צלחת שנייה של 384 בארות, ולאחר מכן הוסף 3.3 מיקרוליטר של תערובת מאסטר דגימה ו-2.7 מיקרוליטר מכל אקסונוקלאז מוגבר מראש שטיפלתי בדגימה לבארות המתאימות של צלחת המערך היחיד המוכנה. כדי להכין את שבב הננו-פלואידיקה לריצה הראשונה, החזק את השבב בזווית של 45 מעלות לאט ובזהירות הזריק 150 מיקרוליטר של נוזל קו בקרה לתוך מצברי השבב.

לאחר טעינת כל הנוזל, הסר את סרט המגן הכחול מתחתית השבב והנח את השבב במכונת ההתחלה של PCR ננו-פלואידיקה כשהברקוד פונה כלפי חוץ. לאחר מכן הפעל את סקריפט Prime(153x). לאחר ההתחלה, הנח את השבב על משטח כהה וכאשר כל בדיקה או תערובת דגימה נטענת, הסר את פקקי המחסום המתאימים במידת הצורך והוסף את הנפח המתאים של בדיקה או תערובת דגימה לכניסות המתאימות של השבב הננו-נוזלי בהתאם לתוכנית הניסוי.

לאחר הטעינה, הכנס את השבב לתוך התרמו-ציקלר הננו-פלואידי, והפעל את הפרוטוקול המתאים בתוכנת איסוף הנתונים. אם לא נעשה שימוש בשבב מרובה המערכים כולו, בצע ריצת פוסט-סקריפט כדי לאפשר שימוש במורד הזרם במערכי השבבים הנותרים. כדי לבדוק אם פרוטוקול תולעת ל-Ct הוא שיטת מיצוי cDNA תקפה, השיטה הושוותה לשיטות מיצוי סטנדרטיות של גואנידיום תיוציאנט-פנול-כלורופורם.

ברחבי העולם, רמות ביטוי hsp-70 mRNA לכל 100 ננוגרם של RNA כולל היו דומות הן בשיטות פנול-כלורופורם והן בשיטות תולעת ל-Ct. עם זאת, במקרים של ביטוי hsp-70 הגבוה ביותר, הביטוי היה גבוה יותר בשיטת תולעת ל-Ct, מה שמעיד על רגישות משופרת. עבור מיצוי גואנידיום תיוציאנט-פנול-כלורופורם של דגימות בתפזורת, hsp-70 ירד ב-82.7 במוטציות hsf-1 בהשוואה לביקורת וב-92.3% עבור חם ל-CT, מה שמצביע על כך שהירידה הייתה דומה בין שתי השיטות.

באמצעות cDNA שהתקבל מדגימות בתפזורת של 25 תולעים או מממוצע של 36 דגימות תולעים בודדות, השיטות זיהו רמות ביטוי דומות עבור כל המלווים שנבדקו, מה שמצביע על כך שהפרמטרים המתקבלים מתולעים בודדות הם אמינים. כאן, מוצג הביטוי הממוצע של תעתיקי hsp מרובים מתולעים בודדות לאחר הלם חום קצר. כפי שנצפה, השונות בביטוי התעתיקים שונה באופן דרמטי בין גנים שונים.

עבור כל תעתיק שנבדק באמצעות דגימות תולעת בודדות, המקדמים הטכניים של השונות היו נמוכים מהמקדמים הביולוגיים של השונות, מה שמצביע על כך שלא נדרשו משולשים טכניים להערכת פרמטרים כאשר qPCR בוצע על תולעים בודדות. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חיוני להזרים נפחים קטנים במדויק ולא לזרוק לאחור לתוך השבב הננו-פלואידי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשיג קבוצות גדולות של נתוני RT-qPCR, אותם ניתן לייצא ולעבד כרצונכם באמצעות סקריפטים של Excel או R.