פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח קווי תאים לייצור תרופות ביולוגיות עם שיבוטיות ופרודוקטיביות גבוהה. זה מושג על ידי טרנסקציה ראשונה, התא המארח עם ה-DNA, המקודד את הגן המבוקש. השלב הבא של ההליך הוא לבודד שיבוטים בעלי תפוקה גבוהה על ידי עובדות, ולאחר מכן תיעוד של היווצרות מושבה על ידי הדמיית בחירת השיבוטים.

השלב האחרון הוא סינון ובחירת שיבוטים פרודוקטיביים במיוחד. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ייצור נוגדנים בתרביות אצווה רציפות ומוזנות באמצעות HPLC בשלב הפוך. וידאו. הדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את מיון העובדות ואת שלבי ה-pcan 80 dgl מכיוון שמערך מורכב מעורב בהליכים אלה, המדענים הבאים ממעבדה ידגימו נהלים אלה לטרנספקציה של אפקט התא המארח, מיון ג'ייסון סנדרס לתיעוד היווצרות מושבה וראסל קאן לדגימת טקאן.

ואלייזה להתחיל בהליך זה יום אחד לפני הטרנספקציה לזרוע את התאים המארחים בבקבוק תרבית תאים ב-15 מיליליטר של צמיחה. בינוני. דגרו את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 7.5% פחמן דו חמצני למחרת, הכינו את מתחמי הטרנספקציה תחילה לדלל שמונה מיקרוגרם, DNA ב-800 מיקרוליטר של מצע גידול ללא סרום בצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי מעורבב בעדינות. לאחר מכן, יש לדלל שפתיים של 40 מיקרוליטר ב-800 מיקרוליטר של מצע גידול ללא סרום בצינור פוליסטירן.

הוסף את ה-DNA המדולל לליפופקטמין המדולל. מערבבים בעדינות ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין את תאי המארח להעברה. הסר את מצע הגידול מהתאים והחלף ב -6.4 מיליליטר של מצע גידול ללא סרום.

הוסף 1.6 מיליליטר ממתחמי הטרנספקציה לבקבוק. מערבבים בעדינות על ידי נדנוד הבקבוק. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני למשך שש שעות.

לאחר שש שעות, הוסיפו שמונה מיליליטר של מצע גידול לבקבוק ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני למשך הלילה למחרת. הסר את המדיום על ידי שאיפה והוסף מצע גידול טרי לבקבוק. דגרו את התאים שוב למשך הלילה לאחר הדגירה של הלילה.

החלף את מצע הגידול בבחירה. בינוני. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני למשך שבועיים-שלושה. שבועיים-שלושה לאחר הטרנספטציה, התאים מוכנים לשיבוט על ידי זרימה ציטומטרית המופעלת על ידי מיון תאים שנעקרו מהבקבוק והצנטריפוגה ב-800 סל"ד למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את התאים במדיום הבחירה, בתוספת אלבומין סרום בקר 2%. לאחר מכן הוסיפו נוגדן IgG אנטי-אנושי עם תווית פלואורסצנטית. הוסף דילול של 1 עד 20 דגירה על קרח למשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן שטוף פעמיים עם PBS קר השעיה מחדש תאים ב-XPBS אחד בצינור פוליפרופילן.

דוגמה לתאים מוכתמים מוצגת בתמונה זו למיון אספטי על אריה של פקס BD הכינו צלחת תרבית תאים של 96 בארות המכילה 200 מיקרוליטר מדיום בחירה בכל באר. טען את הצינור בתאים באופן אספטי ונתח את עובדות ה- BD. Aria, רשום את התוצאות עבור תאים מוכתמים ולא מוכתמים בהתאמה.

הגדר את השערים וההגדרות למיון תאים בודדים של פרופיל הצביעה הפלואורסצנטי הרצוי לתוך צלחת 96 באר דגר את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים ביום האפס, היום השלישי, היום השביעי והיום ה-13 לאחר מיון עובדות היווצרות מושבת מסמך בצלחת 96 בארות על מצלמת בחירת שיבוט כדי להבטיח בחירה של שיבוטים שמקורם בתא בודד למסך ולבחור לפרודוקטיביות גבוהה שיבוטים. ראשית, מסמך את מיקום הדגימה בלוחית הבדיקה המקבלת 96. לאחר מכן השתמש במערכת רובוטית לטיפול בנוזלים כדי להעביר כמויות של 20 מיקרוליטר סופרנטנט לכל באר של 96 לוחות הבדיקה ייצור הנוגדנים בדגימות מנותח על ידי כריך.

IgG אנושי מזהה ELI SA במערכת הטיפול בנוזלים באופן הבא. ראשית, הדגימות והתקן נטענים על לוחות בדיקת IgG אנטי-אנושיים מקודדים מראש. הצלחות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן שלוש שטיפות PBS.

הבא חיסון עז טהור אנטי אנושי IgG. HRP מתווסף לצלחות בדילול של 1 עד 2000 והצלחות מודגרות למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה שוטפים את הצלחות שלוש פעמים עם PBS ואז מוסיפים את מצע A BTS.

לבסוף, הלוחות אדומים על קורא לוחות המשתמש בספיגה של 405 ננומטר לזיהוי. באמצעות פלטפורמה אוטומטית זו, נמצא כי רמת הנוגדנים על פני השטח המשתקפת על ידי צביעה עם IgG אנטי אנושי פלואורסצנטי מתואם עם פרודוקטיביות הנוגדנים של התא. כפי שמוצג כאן עבור שני השיבוטים המובילים שנוצרו מאוכלוסיית התאים עם ביטוי נוגדנים גבוה על פני השטח, הפרודוקטיביות הספציפית נעה בין 50 ל-70 פיקוגרם לתא ליום.

לעומת זאת, תפוקת הנוגדנים הייתה בערך 20 פיקוגרם לתא ליום עבור שני השיבוטים המובילים שנוצרו מאוכלוסיית התאים עם ביטוי נוגדנים נמוך על פני השטח. יתר על כן, קווי תאים שפותחו על ידי מיון עובדות יציבים יותר ביחס לייצור נוגדנים מאלה ששובטו באמצעות דילול מגביל ידני. הפרודוקטיביות הספציפית של שיבוט השיבוט העליון שנוצר על ידי דילול הגבלה ידני ירדה מכ-30 PCD לכ-10 PCD לאחר תרבית ל-80 הכפלות תאים.

מצד שני, שיבוט המשנה העליון שנוצר על ידי שיבוט מיון פקס שני הצליח לשמור על הפרודוקטיביות הספציפית סביב 20 PCD עבור לפחות 100 הכפלות תאים. זיהוי אתר האינטגרציה הטרנסגנית בכרומוזום התא על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרה הראה כי שיבוט אחד הוא אוכלוסייה מעורבת של פנוטיפ A ופנוטיפ B.In ניגודיות, העובדה ששיבוט ממוין נראה כאוכלוסייה הומוגנית יותר עם 99.5% מהתאים של פנוטיפ A.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח קווי תאים לייצור להגנה על חלבונים טיפוליים.