פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לפתח תאי ייצור עבור תרופות ביולוגיות בעלי קלונליות ופרודוקטיביות גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציה של תא המאחסן ב-DNA המקודד לגן המבוקש. השלב הבא של הפרוצדורה הוא בידוד של קלונים בעלי תפוקה גבוהה באמצעות פלטות, ולאחריו תיעוד של היווצרות המושבות באמצעות מערכת ה-clone select imager.

השלב הסופי הוא סריקה ובחירה של שיבוטים (clones) בעלי פריון גבוה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ייצור נוגדנים בתרביות אצומה רציפות ומוזנות באמצעות reverse phase HPLC. הדגמה של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי המיון וה-pcan 80 dgl קשים ללמידה בשל המערך המורכב המעורב בהליכים אלו; המדענים הבאים מהמעבדה ידגימו הליכים אלו עבור השפעת הטרנספקציה של תא המאכסן, Jason Sanders ידגים את המיון לצורך תיעוד של יצירת מושבות, ו-Russell Kan ידגים את הדגימה ב-tecan.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו יום אחד לפני הטרנספקציה, זרעו את תאי המארח בבאלס לתרבית תאים ב-15 milliliters של Growth Medium. הדגירו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius ו-7.5% carbon dioxide. למחרת, הכינו את קומפלקסי הטרנספקציה: ראשית, דללו 8 micrograms של DNA ב-800 microliters של growth medium ללא סרום בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית סטרילית וערבבו בעדינות. לאחר מכן, דללו 40 microliters של lip ב-800 microliters של growth medium ללא סרום בתוך מבחנת פוליסטירן.

הוסיפו את ה-DNA המדולל ל-Lipofectamine המדולל. ערבבו בעדינות והדגירו ל-30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין את תאי המארח לטרנספקציה. הסירו את מצע הגידול מהתאים והחליפו אותו ב-6.4 milliliters של מצע גידול ללא סרום.

הוסיפו 1.6 milliliters של קומפלקסי הטרנספקציה לבקבוק. ערבבו בעדינות על ידי נדנוד הבקבוק. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור פחמן דו-חמצני למשך שש שעות.

לאחר שש שעות, הוסיפו שמונה מיליליטרים של מצע גידול לבקבוק והדגירו בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור פחמן דו-חמצני למשך הלילה של היום למחרת. הסירו את המצע באמצעות שאיבה והוסיפו מצע גידול טרי לבקבוק. הדגירו את התאים למשך לילה נוסף לאחר הדגירה הראשונית.

החליפו את מצע הגידול במצע סלקציה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור פחמן דו-חמצני למשך שבועיים עד שלושה שבועות. שבועיים עד שלושה שבועות לאחר הטרנספקציה, התאים מוכנים לשיבוט באמצעות מיון תאים מופעל בזרימה (FACS); פרקו את התאים מהבלילה וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 800 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.

יש להשעות מחדש את התאים במצע סלקציה, המועשר ב-2% bovine serum albumin. לאחר מכן, יש להוסיף נוגדן anti-human IgG מסומן פלואורסצנטית. יש להוסיף דילול של 1:20, להדגיר על קרח למשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים ב-PBS קר ולהשעות מחדש את התאים ב-one XPBS בתוך מבחנה מפוליפרופילן.

דוגמה לתאים צבועים מוצגת בתמונה זו עבור מיון אספטי במערכת BD FACS Aria. הכין פלטת תרבית תאים של 96 בארות המכילה 200 µL של מצע סלקציה בכל באר. טען באופן אספטי את המבחנה עם התאים ובצע אנליזה במערכת BD FACS Aria; רשום את התוצאות עבור תאים צבועים ותאים לא צבועים בהתאמה.

הגדירו את השערים (gates) וההגדרות למיון תאים בודדים בעלי פרופיל הצביעה הפלואורסצנטית הרצוי אל תוך פלטת 96 בארות. דגרו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שבועיים. ביום 0, ביום 3, ביום 7 וביום 13 לאחר המיון, תיעקו את היווצרות המושבות בפלטת 96 הבארות באמצעות מדמייר לבחירת שיבוטים (clone select imager) כדי להבטיח בחירה של שיבוטים שנגזרו מתא בודד, לצורך סריקה ובחירה של שיבוטים בעלי פריון גבוה. ראשית, תיעקו את מיקום הדגימה בפלטת הבדיקה (assay plate) של 96 הבארות המקבלת. לאחר מכן, השתמשו במערכת רובוטית לטיפול בנוזלים כדי להעביר מנות (aliquots) של 20 µL של עליון (supernatant) לכל באר בפלטת הבדיקה של 96 הבארות. ייצור הנוגדנים בדגימות נותח בשיטת סנדוויץ'.

זיהוי Human IgG באמצעות ELI SA במערכת לטיפול בנוזלים באופן הבא. ראשית, הדגימות וסטנדרט נטענים לתוך לוחיות בדיקה עם bio coat של anti-human IgG מקודדות מראש. הלוחיות מדגרות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן נשטפות שלושה פעמים ב-PBS.

בשלב הבא, מוסיפים ללוחיות נוגדן Goat anti-human IgG טהור מסוג immuno pure המזווג ל-HRP בדילול של 1:2000, ומדגירים את הלוחיות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, שוטפים את הלוחיות שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן מוסיפים את מצע ה-A BTS.

לבסוף, קוראים את הפלטות באמצעות קורא פלטות תוך שימוש בספיגה באורך גל של 405 nanometers לצורך גילוי. באמצעות פלטפורמה אוטומטית זו, נמצא כי רמת הנוגדנים על פני השטח, כפי שמשתקפת בצביעה עם anti-human IgG המסומן פלואורסצנטית, נמצאת במתאם עם פריון הנוגדנים של התא. כפי שמוצג כאן עבור שני השיבטים המובילים שהופקו מאוכלוסיית תאים עם ביטוי גבוה של נוגדנים על פני השטח, הפריון הספציפי נע בין 50 ל-70 picograms לתא ליום.

לעומת זאת, פריון הנוגדנים היה בערך 20 picograms לתא ליום עבור שני השיבוטים המובילים שהופקו מאוכלוסיית התאים עם ביטוי נוגדנים נמוך על פני השטח. יתרה מכך, קווי תאים שפותחו באמצעות מיון (sorting) הם יציבים יותר ביחס לייצור נוגדנים מאלו ששובטו באמצעות דילול מוגבל ידני. הפריון הספציפי של השיבוט המוביל, שיבוט מספר אחת, שהופק באמצעות דילול מוגבל ידני, ירד מ-30 PCD בערך ל-10 PCD בערך לאחר טיפוח של 80 הכפלות תאים.

מצד שני, הסוב-קלון העליון שהופק על ידי מיון FACS מקלון שני היה מסוגל לשמור על פריון ספציפי של כ-20 PCD למשך לפחות 100 הכפלות תאים. זיהוי אתר השילוב של הגן התוסף בכרומוזום התא באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH) הדגים כי קלון אחד הוא אוכלוסייה מעורבת של פנוטיפ A ופנוטיפ B. לעומת זאת, הקלון שמוין ב-FACS נראה כאוכלוסייה הומוגנית יותר, כאשר 99.5% מהתאים הם בעלי פנוטיפ A. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הפיתוח של שורות תאים לייצור עבור הפקת חלבונים טיפוליים.