טרנספורמציה גנטית בינארית חיידקית מבוססת וקטור כרומוזום מלאכותי בצמחי Arabidopsis: טכניקה ליצירת צמחים טרנסגניים עם החדרת עותק יחיד

התחל עם צמחי Arabidopsis הנושאים ראשי פרחים לא בשלים. טבלו את ראשי הפרחים בתרחיף תאי Agrobacterium הנושאים T-DNA משובט עם כרומוזום מלאכותי חיידקי בינארי או BIBAC, וקטור המשתכפל הן במערכות E. coli והן במערכות Agrobacterium. וקטור בינארי T-DNA זה יכול לספק טרנסגנים גדולים כגון גן עמידות לקוטלי עשבים וסמנים פלואורסצנטיים הניתנים לבחירה לאורך מקדם ספציפי לזרע.

בזמן שראשי הפרחים עדיין שקועים, ערבבו בעדינות את הצמחים כדי לשפר את המגע שלהם עם אגרובקטריום. עם יכולתו הטבועה להדביק צמחים, אגרובקטריום מעביר את הטרנסגן לתא הפרחים. כאשר הטרנסגן נכנס לתא, הוא עובר לגרעין ומתמזג עם גנום הצמח.

כעת, עטפו את הצמח בניילון נצמד ודגרו בחושך כדי לשמור על לחות לשיפור השינוי. הסר את הסרט וגדל צמחים בתנאים פיזיולוגיים עד שהם מייצרים זרעים.

לאחר מכן, קצרו את הזרעים והתבוננו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחור טרנספורמציה. כעת, גדלו את הזרעים שעברו טרנספורמציה בתנאים מתאימים עד לנביטה. מרססים את הצמחים בקוטל עשבים, ודוגרים.

צמחים עם החדרת טרנסגנים מרובים חווים השתקת גנים וקמלים, בעוד שצמחים עם החדרת עותק יחיד מבטאים אנזים פעיל לחילוף חומרים של קוטלי עשבים ושורדים את הטיפול. חלץ DNA גנומי מהטרנספורמנטים ששרדו ובצע PCR כדי לחשב את היעילות של החדרת עותק בודד.

כדי להכין את צמחי הארבידופסיס לטרנספורמציה, יש לגדל צמחי ארבידופסיס בחממה או בתא גידול מבוקר אקלים, עד שהם פורחים. מהדקים את הברגים הראשונים כדי לאפשר לברגים משניים נוספים להופיע. הצמחים מוכנים לטבילה ארבעה עד שישה ימים לאחר הגזירה, כאשר לצמחים יש הרבה ראשי פרחים לא בשלים, ואין הרבה סיליקיות מופרות.

לביצוע טבילת פרחים, טבלו תפרחות למשך 5 עד 10 שניות בתרחיף אגרובקטריום. השתמש בתסיסה עדינה. עטפו את החלקים מעל הקרקע של הצמחים בניילון נצמד כדי לשמור על לחות גבוהה, וכסו את העציצים בקופסה כדי לשמור על הצמחים בחושך.

דגרו את הצמחים במשך יומיים בחממה או בתא גידול. לאחר יומיים, הסר את הקופסה ואת הסרט הנצמד, וגדל את הצמחים לבגרות בחממה או בתא גידול. כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, ניתן לטבול מחדש את אותם צמחים שבעה ימים לאחר הטבילה הראשונה.

לאחר מכן, כאשר הצמחים שעברו טרנספורמציה בוגרים ויבשים, קצרו את הזרעים. אסוף ונתח את זרעי הצמחים שעברו טרנספורמציה עם אותו מבנה כמו קבוצה בודדת. במקרה שצמחים עוברים טרנספורמציה עם נגזרת פלסמיד BIBAC-RFP-Gateway, זהה צמחים טרנסגניים על ידי ניתוח הזרעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

כדי לזהות ביטוי DsRed בשכבות זרעים, דמו את הזרעים בעירור של 560 ננומטר, ופליטה של 600 עד 650 ננומטר. הפרד את זרעי הפלואורסצנט מעמיתיהם שאינם פלואורסצנטיים באמצעות מלקחיים.

כדי לסנן צמחים טרנסגניים שעברו טרנספורמציה עם נגזרת פלסמיד BIBAC-BAR-Gateway, זרעו את הזרעים במגשים מלאים באדמה. הקפידו על פיזור אחיד של זרעים על מגשים, על ידי השעיית זרעים באגר 0.1% במדיום 0.5X MS, ופזרו את הזרעים באמצעות פיפטה של 1 מיליליטר.

לעורר את הזרעים לנבוט בצורה סינכרונית על ידי דגירה של הזרעים למשך יומיים לפחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ניתן לעשות זאת לפני או אחרי זריעת הזרעים. שבועיים ושלושה לאחר זריעת הזרעים, יש לרסס את השתילים בתמיסת גלופוסינאט-אמוניום של 0.5%. השתמש ב -500 מיליליטר של תמיסת גלופוסינאט-אמוניום למטר מרובע. העבירו שתילים ששרדו לעציצים. לנתח את הצמחים העמידים לגלופוסינאט-אמוניום, על ידי PCR לנוכחות המבנה המעניין.