ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית של הצמח והתא, כגון, כיצד אנו יכולים ליצור חלבונים בתא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היעילות הגבוהה של ביטוי משותף של חלבוני היתוך תאי בווקטור ביטוי אחד. מי שידגים את ההליך יהיה Guitao Zhong, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל, תכנן את הפריימרים לשיבוט מולקולרי של שברי DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגבירו את שברי ה-DNA הנחוצים לבניית קלטות ביטוי החלבון העצמאיות למחצה על ידי תגובות PCR סטנדרטיות עם פריימרים מתאימים ופולימראז בנאמנות גבוהה. אלה כוללים את המקדם, המדווח הפלואורסצנטי, גן המטרה והמסיים.

בחנו את איכות מוצרי ה-PCR בסיבוב הראשון על ידי חיפוש פירוק DNA וזיהום באלקטרופורזה של DNA באמצעות ג'ל אגרוז 1%. כמת את מוצרי ה-PCR באמצעות ספקטרופוטומטר. היחס בין הקריאות ב-260 ל-280 ננומטר של מוצרי ה-PCR צריך להיות בין 1.6 ל-1.8.

מערבבים את שברי ה-DNA המיועדים לאותה קלטת ביטוי חלבון יחד בצינור PCR אחד לנפח סופי של חמישה מיקרוליטר. אודות ערבוב DNS מנתוני קלטות ביטוי שונים. מכיוון ששוויון מפחית את היעילות של הרכבת ה- DNA, עקב מספר הולך וגדל של מולקולות DNA שצריך לקשר.

כעת, הוסיפו 15 מיקרוליטר של תערובת מאסטר פי 2 לתערובת ה-DNA של 5 מיקרוליטר ודגרו בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. הגבירו את כל קלטת ביטוי החלבון העצמאית למחצה על ידי סיבוב שני של PCR. השתמש ב-0.5 עד מיקרוליטר אחד של המוצר מתגובת ההרכבה האיזותרמית של הסיבוב הראשון כתבנית בפריימרים החיצוניים ביותר.

השתמש ביחידה אחת של פולימראז בנאמנות גבוהה בנפח תגובה של 50 מיקרוליטר למשך 30 מחזורים, ולאחר מכן הארכה סופית ב-68 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, ליניאריזציה של וקטור עמוד השדרה הסופי של ביטוי החלבון POC 18, וקטור CAMBIA 1300, על ידי הוספת ארבע יחידות של אחת קטנה לנפח תגובה סופי של 10 מיקרוליטר. וקטורים אלה מיועדים לביטוי חולף של חלבון וטרנספורמציה גנטית.

דגרו על עיכול ההגבלה למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. לאחר העיכול, השבת את אנזים ההגבלה על ידי דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, ערבבו מולקולות DNA שוות ערך של קלטות ביטוי חלבון וקטור סופי ליניארי לנפח תגובה סופי של חמישה מיקרוליטר.

לבסוף, בצע את הסיבוב השני של רקומבינציה של DNA על ידי ערבוב התגובה עם 15 מיקרוליטר של מאגר מאסטר פי 2, ודגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. כדי להכין תאי תרחיף BY-2 של טבק להפצצה, יש לאסוף 30 מיליליטר של תאי BY-2 מתורבתים ל-3 ימים על פיסת נייר סינון חיטוי של 70 מיליליטר באמצעות משאבת ואקום, על ידי הגדרת לחץ הוואקום ל-40 מיליבר. בינתיים, הוסיפו כמה טיפות של מדיום תרבותי נוזלי של תאי BY-2 לצלחת פטרי.

העבירו את נייר הסינון עם תאי ה-BY-2 עליו לצלחת הפטרי. כדי להכין צמחים צעירים של ארבידופסיס להפצצה, הכינו צמחי דגימה בני שבעה ימים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, העבירו אותם למלבן במרכז צלחת בינונית MS חדשה בחצי חוזק כדי להגביר את יעילות ההפצצה.

הקפד להימנע מחפיפה של הצמחים בעת העברתם והנחתם על הצלחת. הוסף כמה טיפות של מדיום נוזלי MS בחצי חוזק על פני הצמחים או הרקמות כדי לשמור על לחות ולמנוע ייבוש הצמחים במהלך השלבים הנותרים. כדי לצפות חלקיקי זהב ב- DNA פלסמיד, תחילה מערבולת את תמיסת המיקרו-נשא הזהב ביסודיות למשך שלוש דקות.

כעת, הוסיפו 25 מיקרוליטר של חלקיקי זהב לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, ומערבולת למשך 10 שניות. הוסף 10 מיקרוליטר של 25.46 מיליגרם לליטר ספרמידין ומערבולת למשך 10 שניות. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר של מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר DNA פלסמיד, ומערבולת למשך שלוש דקות.

לבסוף, הוסיפו 25 מיקרוליטר של 277.5 מיליגרם לליטר תמיסת סידן כלורי, ומערבולת למשך דקה אחת. סובב את המיקרו-נושאי הזהב באמצעות צנטריפוגה ספסל במהירות מרבית למשך חמש שניות. לאחר הצנטריפוגה, צנרת אותו בזהירות החוצה את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.

לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם 200 מיקרוליטר אתנול מוחלט, והשעו מחדש את הגלולה על ידי מערבולת למשך חמש עד 10 שניות. לאחר הרווח, סובב את המיקרו-נשאים של הזהב במהירות המרבית למשך חמש שניות, והסר את האתנול. השעו מחדש את חלקיקי הזהב ב-18 מיקרוליטר של אתנול מוחלט.

לאחר מכן, ציטטו שישה מיקרוליטרים של תרחיף חלקיקים על האמצע של שלושה מיקרו-נשאים ותנו להם להתייבש באוויר. כדי להעביר את ה-DNA לתאים ולצמחים באמצעות הפצצת חלקיקים, הגדר תחילה את מערכת העברת החלקיקים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הפציצו את התאים או הצמחים על צלחת האגרומדיום שלוש פעמים בשלושה מיקומים שונים.

שמור את התאים והצמחים המופגזים בחושך בתא הגידול של הצמח במשך שש עד 72 שעות לפני תצפית על אותות פלואורסצנטיים. הגדר את תא הגידול של הצמח לחושך של 24 שעות ו-22 מעלות צלזיוס. העבירו את הצמחים הצעירים או תאי התרחיף, על מגלשת זכוכית קונבנציונלית, והניחו בעדינות שקופית כיסוי בחלק העליון להדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי סטנדרטי.

באמצעות ההגדרות המפורטות בפרוטוקול הטקסט, לעורר חלבונים מתויגים GFP ב-485 ננומטר, ולזהות פלואורסצנטיות ב-525 ננומטר. עבור חלבונים מתויגים RFP, מעוררים ב-585 ננומטר ומגלים ב-608 ננומטר. לבסוף, חשב את יחס הקולוקליזציה של אותות פלואורסצנטיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

ביטוי משותף של arabidopsis VSR-2 ו-arabidopsis SCAMP4 בתאי טבק BY-2 הושג באמצעות הפצצת חלקיקים והראה לוקליזציות נכונות. RFP arabidopsis VSR-2 מציג דפוס נקב, שהיה שונה מלוקליזציה של קרום הפלזמה של arabidopsis SCAMP4-GFP, עם כמה נקודות ניקוב ציטוזוליות. יתר על כן, צמחים טרנסגניים של arabidopsis המבטאים במשותף arabidopsis SCAMP4-GFP ו-RFP arabidopsis VSR-2 נוצרו באמצעות טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריות.

מוצגת הלוקליזציה התת-תאית של ביטוי משותף של שני החלבונים הכימריים בתאי שיער שורש ושורש. בהתאם למחקרים קודמים, טיפול בארבידופסיס טרנסגני גרם לתאים קדם-ווצ'ואלריים המסומנים RFP arabidopsis VSR-2, ויוצרים מבנה קטן דמוי טבעת. ואילו טיפול עם פרפולדין A השרתה ארבידופסיס SCAMP GFP שכותרתו צבירת רשת טרנסגולד G.

כבקרה שלילית, מעט אות אוטו-פלואורסצנטי נצפה בתאי טבק BY-2 ותאי שיער שורש ושורש ארבידופסיס על ידי החלת אותן הגדרות של איסוף תמונות. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הלוקליזציה התת-תאית של החלבונים. ניתן ליישם אותו גם לחקר חלבון בכיוון.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי הצמח. לייצא בנוחות את הלוקליזציות התת-תאיות והאינטראקציה המרחבית של חלבונים בתא הצמח החי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טרנספורמציה בתיווך PET והכלאה גנטית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד לבטא במשותף מספר חלבוני היתוך בצמחים.

אל תשכח שעבודה עם הפצצה עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון מגני עיניים בעת ביצוע הליך זה.